Laporan Praktikum PJP Dr.

Inda Setyawati,
Karakterisasi Biomolekul S.T.P., M.Si.
Topik ke 1 Asisten Roro Intan Sasmaya
Akbar
Tanggal 15 Sept 2022 Nama Rama Vijaya Jhowry
Waktu 13.00-16.00 WIB NIM/Kel G8401211093/K4

PENENTUAN KADAR PROTEIN

PENDAHULUAN
Protein merupakan makromolekul yang terdiri dari asam amino yang
terhubung dengan ikatan peptida. Molekul protein berupa rantai polipeptida dengan
jumlah residu asam amino yang beragam, berkisar dari 100 hingga 100,000 residu
(Nelson dan Cox 2017). Kadar protein dalam suatu sampel dapat ditentukan melalui
metode yang mendeteksi protein berdasarkan sifat kimianya. Metode penentuan
kadar protein beragam dari metode kolorimetri hingga metode yang mengukur
kadar penyerapan cahaya dalam sampel. Penentuan kadar protein dalam praktikum
ini menggunakan metode spektrofotometri sinar UV, metode Bradford, dan metode
Lowry. Spektrofotometri sinar UV mengukur absorbansi sampel terhadap sinar UV.
Metode Bradford dan metode Lowry merupakan metode kolorimetri menggunakan
reagen tertentu yang bereaksi dengan protein dalam sampel untuk menghasilkan
warna biru (Purwanto 2014).
METODE
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah spektrofotometer UV-Vis,
mikropipet, tip pipet, tabung mikro, kuvet, vortex, neraca analitik, pipet kaca 5 mL,
beaker kaca 100 mL, dan tabung reaksi. Bahan yang digunakan dalam praktikum
ini adalah larutan bovine serum albumin (BSA) 1 mg/mL, buffer kalium fosfat 50
mM, pereaksi Bradford, 48 mL Na2CO3 2% dalam 0.1 N NaoH, NaK tartrat 1%
dalam akuades sebanyak 1 mL, 0.5% CuSO4,5H2O dalam akuades sebanyak 1 mL,
dan Folin fenol 2 N.
Prosedur
Untuk metode Bradford, larutan stok BSA sebanyak 0 μL, 10 μL, 20 μL, 30
μL, 40 μL, 50 μL, 60 μL, 70 μL, 80 μL, 90 μL, dan 100 μL dipipet dan ditambah
akuades hingga volume masing-masing tabung 100 μL untuk membuat larutan
standar. Larutan sampel diambil sebanyak 100 μL. Larutan standar dan sampel
ditambahkan 5 mL pereaksi Bradford lalu divortex hingga merata. Larutan standar
dan sampel kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang 595 nm untuk
membuat kurva standar dan mengukur kadar protein larutan sampel.
Untuk metode Lowry, prosedur dilakukan secara duplo. Reagen I dibuat
dari pencampuran 48 mL Na2CO3 2%, 1 mL NaK tartrat 1%, dan 1 mL
CuSO4,5H2O 0.5%. Pereaksi II dibuat dari pencampuran Folin fenol 2N dan
akuades dengan perbandingan 1:1. Larutan BSA dipipet sebanyak 0 mL, 0.2 mL,
dan 0.4 mL lalu ditambah akuades hingga volume larutan dalam masing-masing
tabung sebanyak 1 mL. Larutan sampel sebanyak 1 mL dan larutan standar
ditambahkan pereaksi I sebanyak 4.5 mL lalu diinkubasi selama 10 menit. Setelah
inkubasi, sampel dan standar ditambahkan pereaksi II, lalu diinkubasi kembali
selama 30 menit dan dilakukan uji absorbansi pada panjang gelombang 660 nm.
Kurva standar kemudian dibuat berdasarkan hasil uji absorbansi untuk menentukan
kadar protein pada sampel (Waterborg 2009).

HASIL DAN DISKUSI

Penentuan kadar protein dengan metode Bradford melibatkan perubahan
absorbsi cahaya oleh pewarna Coomassie Blue ketika berinteraksi dengan protein.
Saat berikatan dengan protein, terjadi peningkatan absorbansi Coomassie Blue pada
panjang gelombang 595 nm yang dapat dihubungkan dengan konsentrasi protein
(Carlsson et al. 2011). Metode Lowry merupakan kombinasi metode Biuret yang
menggunakan ion Cu2+ dalam larutan basa yang mengandung agen chelating
dengan aksi reagen merkuri fenol berupa reagen Folin-Ciocalteu (Niamke et al.
2005). Menurut Purwanto (2014), pereaksi Bradford yang digunakan dalam metode
Bradford mengandung pewarna Coomassie Brilliant Blue yang berikatan dengan
gugus samping basa dan aromatik pada protein dalam suasana asam, sehingga
absorbansinya dapat diukur pada panjang gelombang 465-595 nm. Pereaksi I pada
metode Lowry mengandung Cu2+ yang berikatan dengan ikatan peptida protein
membentuk kompleks protein-Cu+. Ion Cu+ mereduksi pereaksi Folin-Ciocalteu
yang terkandung pada pereaksi II, sehingga menghasilkan warna biru yang dapat
dideteksi secara kolorimetri.
Penentuan kadar protein dengan metode spektrofotometri sinar UV
memiliki prinsip yang melibatkan spektrum absorbsi protein pada panjang
gelombang sekitar 280 nm yang berasal dari asam amino aromatik tirosin dan
triptofan, sementara prinsip metode Bradford melibatkan pengikatan pewarna
Coomassie Blue dalam suasana asam dengan gugus samping asam amino basa dan
aromatik. Prinsip kerja metode Lowry melibatkan reduksi Cu oleh protein pada
keadaan basa. Metode spektrofotometri UV, metode Bradford, dan metode Lowry
melibatkan spektrofotometri untuk uji absorbansi, yang dibandingkan metode lain
dapat dijalankan pada keluaran yang tinggi menggunakan reagen murah dan
peralatan yang dapat ditemukan di sebagian besar laboratorium biokimia (Noble
dan Bailey 2009).
Tabel 1. Hasil uji absorbansi metode Bradford
Larutan Volume Volume Konsentrasi Absorbansi Faktor
Standar stok 1 H2 O (μg/mL) simplo pengenceran
mg/mL (μL)
(μL)
1 0 1000 0 0 -
2 600 400 0.6 0.125 1.67
3 800 200 0.8 0.146 1.25
 4 1000 0 1 0.257 1
Sampel 1 1.576 0.362 1
Sampel 2 0.698 0.155 1

0,3
y = 0,2357x - 0,0094
0,25 R² = 0,9345

0,2
Absorbansi

0,15

0,1

0,05

0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
-0,05
Konsentrasi (μg/mL)

Gambar 1. Kurva standar hasil uji absorbansi metode Bradford

Tabel 2. Hasil uji absorbansi metode Lowry

Larutan Volume Volume Konsentrasi Absorbansi Absorbansi Absorbansi Faktor
larutan H2O (μg/mL) simplo duplo rata-rata pengenceran
(μL) (μL)
Standar 1 0 100 0 0 - 0 -
Standar 2 20 80 0.2 0.284 - 0.284 5
Standar 3 40 60 0.4 0.316 - 0.316 2.5
Sampel 1 100 0 0.447 0.364 0.426 0.395 1
Sampel 2 100 0 1.072 0.936 0.842 0.889 1

0,4
y = 0,79x + 0,042
0,35 R² = 0,8251
0,3

0,25
Absorbansi

0,2

0,15

0,1

0,05

0
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45
Konsentrasi (μg/mL)
 Gambar 2. Kurva standar hasil uji absorbansi metode Lowry

Berdasarkan data hasil uji absorbansi, fungsi kurva standar untuk metode
Bradford adalah 𝑦 = 0.2357𝑥 − 0.0094 dengan nilai R2 0.9345. Fungsi kurva
standar untuk metode Lowry adalah 𝑦 = 0.79𝑥 + 0.042 dengan nilai R2 0.8251.
Nilai R2 menunjukkan korelasi konsentrasi standar dengan absorbansi pada metode
Lowry lebih lemah dibandingkan metode Bradford. Fungsi kurva standar
digunakan untuk menentukan konsentrasi protein pada sampel. Konsentrasi dan
faktor pengenceran standar didapatkan melalui rumus berikut.

𝑉1 𝑀1 = 𝑉2 𝑀2
𝑉𝐹
𝐹𝑃 =
𝑉𝐼
Contoh perhitungan konsentrasi stok:
600 × 1 = 1000 × 𝑀2
600
𝑀2 = = 0.6 𝜇𝑔/𝑚𝐿
1000
Contoh perhitungan faktor pengenceran:
𝑉𝐹 100 𝜇𝐿
𝐹𝑃 = = =5
𝑉𝐼 20 𝜇𝐿
Perhitungan konsentrasi sampel menggunakan fungsi kurva standar untuk
metode Bradford adalah sebagai berikut.
𝑦 = 0.2357𝑥 − 0.0094
0.362 = 0.2357𝑥 − 0.0094
0.362 + 0.0094 = 0.2357𝑥
0.3714 = 0.2357𝑥
0.3714 0.2375𝑥
= ; 𝑥 = 1.576 𝜇𝑔/𝑚𝐿
0.2357 0.2357
Contoh perhitungan konsentrasi sampel menggunakan fungsi kurva standar
untuk metode Lowry:
𝑦 = 0.79𝑥 + 0.042
0.395 = 0.79𝑥 + 0.042
0.395 − 0.042 = 0.79𝑥
0.353 = 0.79𝑥
0.353 0.79𝑥
= ; 𝑥 = 0.447 𝜇𝑔/𝑚𝐿
0.79 0.79
Berdasarkan perhitungan ini, konsentrasi protein pada sampel yang
digunakan dalam metode Bradford bernilai 1.576 μg/mL untuk Sampel 1 dan 0.698
μg/mL untuk Sampel 2. Konsentrasi protein pada sampel metode Lowry bernilai
0.447 μg/mL untuk Sampel 1 dan 1.072 μg/mL untuk Sampel 2. Konsentrasi protein
Sampel 2 untuk tiap metode lebih tinggi dibandingkan Sampel 1.
Menurut Noble dan Bailey (2009), pengukuran kadar protein dapat
dilakukan dengan metode-metode lain yaitu metode BCA, metode derivatisasi
amina, dan metode deteksi fluoresensi berdasar detergen. Metode BCA mengganti
reagen Folin-Ciocalteu pada metode Lowry dengan bicinchoninic acid, sehingga
sensitivitas dan toleransi terhadap senyawa penginterferensi metode ini lebih tinggi
dibanding metode Lowry. Metode derivatisasi amina dan metode deteksi
fluoresensi berdasar detergen melibatkan probe fluoresensi untuk mengukur kadar
protein.

SIMPULAN

Penentuan kadar protein dalam suatu sampel dapat dilakukan melalui

berbagai metode yang melibatkan spektrofotometri, di antaranya metode
spektrofotometri sinar UV, metode Bradford, dan metode Lowry. Konsentrasi
protein pada sampel metode Bradford dalam praktikum ini adalah 1.576 μg/mL
untuk Sampel 1 dan 0.698 μg/mL untuk Sampel 2. Konsentrasi protein pada sampel
yang digunakan pada praktikum ini untuk metode Lowry bernilai 0.447 μg/mL
untuk Sampel 1 dan 1.072 μg/mL untuk Sampel 2.

DAFTAR PUSTAKA

Carlsson N, Borde A, Wölfel S, Åkerman B, Larsson A. 2011. Quantification of

protein concentration by the Bradford method in the presence of
pharmaceutical polymers. Anal Biochem. 411(1):116–121.
Niamke S, Kouame LP, Kouadio JP, Koffi D, Faulet BM, Dabonne S. 2005. Effect
of some chemicals on the accuracy of protein estimation by the Lowry
method. Biokemistri. 17(2):73–81.
Nelson DL, Cox MM. 2017. Lehninger Principles of Biochemistry Seventh Edition.
New York (NY): W.H. Freeman and Company.
Noble JE, Bailey MJA. 2009. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 463:73–
95.
Purwanto MGM. 2014. Perbandingan analisa kadar protein terlarut dengan berbagai
metode spektroskopi UV-Visible. Jurnal Ilmiah Sains & Teknologi.
7(2):64–71.
Waterborg JH. 2009. The Lowry method for protein quantitation. Di dalam: The
protein protocols handbook. Springer. hlm. 7–10.