Laporan Praktikum PJP Dr.

Inda Setyawati,
Karakterisasi Biomolekul S.TP., M.Si.
Topik ke 2 Asisten Roro Intan Sasmaya
Akbar
Tanggal 01 Sept 2022 Nama Rama Vijaya Jhowry
Waktu 13.00-15.00 NIM/Kel G8401211093/K4

HIDROLISIS PATI DAN ANALISISNYA

PENDAHULUAN
Pati merupakan polimer dari glukosa yang terhubung dengan ikatan
glikosidik. Pati digunakan oleh tumbuhan untuk menyimpan cadangan gula dan
memiliki berbagai kegunaan dalam industri. Ikatan glikosidik tersebut dapat
diputus melalui hidrolisis oleh enzim α-amylase. Aktivitas α-amylase dalam
hidrolisis pati dapat dianalisis diantaranya dengan metode iodine dan metode DNS.
Metode iodine atau metode Fuwa merupakan salah satu metode analisis aktivitas
amylase yang sering digunakan. Cara kerja metode ini berdasar pada perubahan
warna karena pengikatan molekul iodine pada polimer pati (Xiao et al. 2006).
Metode DNS merupakan metode yang juga banyak digunakan oleh peneliti untuk
analisis aktivitas amylase atau karbohidrase lainnya dengan menganalisis gula
pereduksi yang terbentuk dari hidrolisis pati (Gusakov et al. 2011).
METODE
Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah mikropipet, penangas air,
tabung mikro, dan spektrofotometer. Bahan yang digunakan dalam praktikum
metode iodine adalah larutan pati 1% (b/v), enzim α-amylase, asam asetat 1N,
larutan iod, dan larutan pati standar (0, 500, 1000, 1500, 2000, 2500 ppm).
Campuran 100 μL larutan pati dan 100 μL larutan α-amylase dimasukkan ke dalam
satu tabung mikro, dan tabung mikro lain dimasukkan 200 μL larutan standar.
Campuran pati-amylase dan larutan standar diinkubasi dalam penangas air selama
5, 10, dan 15 menit pada suhu 37°C. Setelah inkubasi, sampel dan larutan standar
ditambahkan 100 μL asam asetat dan 100 μL larutan iod. Sampel dan larutan
standar kemudian diencerkan sampai 2 mL dan dilakukan uji absorbansi pada
panjang gelombang 600 nm.
Bahan yang digunakan dalam praktikum metode DNS adalah larutan pati
0,05% (b/v), enzim α-amylase 1%, larutan DNS 1%, dan larutan standar glukosa
(0, 500, 1000, 1500, 2000, dan 2500 ppm). Sebanyak 0,5 mL larutan pati dan 0,5
mL α-amylase dimasukkan dalam tabung. Tabung lain diisi 1 mL larutan standar.
Tabung pati-amylase dan tabung larutan standar diinkubasi selama 5, 10, dan 15
menit dengan penangas air pada suhu 37°C. Setelah inkubasi, sampel dan standar
ditambahkan 3 mL larutan DNS dan diinkubasi dalam penangas air mendidih
selama 10 menit. Sampel dan standar kemudian didinginkan, ditambah akuades
sebanyak 700 μL, dan dilakukan uji absorbasi pada panjang gelombang 550 nm.
 HASIL DAN DISKUSI
Pati merupakan polisakarida yang terbentuk dari monomer glukosa dan
terdiri dari 2 jenis, yaitu amilosa dan amilopektin. Amilopektin memiliki struktur
yang bercabang dibandingkan amilosa. Pada pati, monomer glukosa terhubung
dengan ikatan α1-4 glikosidik untuk amilosa dan amilopektin serta ikatan α1-6
glikosidik untuk percabangan pada amilopektin (Nelson dan Cox 2017). Praktikum
ini bertujuan menganalisis hidrolisis pati dengan aktivitas enzim α-amylase melalui
metode iodine dan metode DNS. Analisis hidrolisis pati dengan metode iodine dan
metode DNS memiliki beberapa prinsip. Pertama, pemutusan ikatan glikosidik pada
pati melalui hidrolisis dengan α-amylase menghasilkan fragmen polisakarida dan
oligosakarida seperti maltosa dan maltotriosa (Nelson dan Cox 2017). Maltosa dan
maltotriosa merupakan gula pereduksi yang dapat dianalisis dengan metode DNS,
karena DNS (3,5-dinitrosalicylic acid) mengalami reduksi ketika bereaksi dengan
dengan gula pereduksi, sehingga membentuk 3-amino-5-nitrosalicylic acid (ANS)
yang berwarna jingga (Saqib dan Whitney 2011). Kedua, pati memiliki struktur
gelung heliks yang bereaksi dengan iod. Dalam reaksi tersebut, molekul iod masuk
ke dalam gelung heliks pati sehingga menghasilkan warna biru. Enzim α-amylase
memutus ikatan α1-4 glikosidik pada pati (Xiao et al. 2006), sehingga struktur
gelung heliks pati terurai dan molekul iod terlepas. Hal ini mengakibatkan
hilangnya warna biru hasil reaksi pati-iod. Salah satu aplikasi metode iodine dan
metode DNS adalah analisis aktivitas dan karakterisasi enzim-enzim karbohidrase
yang digunakan secara ekstensif dalam bioteknologi (Gusakov et al. 2011). Hasil
uji metode iodine (metode Fuwa) dan metode DNS di dalam tabel berikut.
Tabel 1. Absorbansi larutan standar pada 600 nm (Metode Fuwa)

Konsentrasi Absorbansi

Blanko 0 0
Standar 500 0.250
1000 0.457
2000 0.177
4000 0.629
8000 0.029
Sampel
39014 0.001
5 menit
10
22443 0.117
menit
15
25871 0.093
menit

Tabel 2. Absorbansi larutan standar pada 550 nm (Metode DNS)

Konsentrasi Absorbansi

Blanko 0 0
 Standar 500 0.040
1000 0.072
2000 0.151
4000 0.131
8000 0.082
Sampel
88788 0.77
5 menit
10
81288 0.71
menit
15
85038 0.74
menit

Data konsentrasi dan absorbansi standar dihubungkan dan dibuat kurva

standar absorbansi terhadap konsentrasi sebagai berikut.

Absorbansi Terhadap Konsentrasi Standar

(Metode Fuwa)
0,7
0,6 y = -7E-06x + 0,2741
0,5 R² = 0,0066
Absorbansi

0,4
0,3
0,2
0,1
0
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000
Konsentrasi (ppm)

Gambar 1. Kurva standar absorbansi terhadap konsentrasi (metode Fuwa)

Absorbansi Terhadap Konsentrasi Standar

(Metode DNS)
0,16
y = 8E-06x + 0,0597
0,14
R² = 0,167
0,12
Absorbansi

0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000
Konsentrasi (ppm)
 Gambar 2. Kurva standar absorbansi terhadap konsentrasi larutan standar
(metode DNS)
Berdasarkan Gambar 1, kurva standar untuk metode Fuwa memiliki fungsi
Y= -7x10-6x + 0.2741 dan R2 = 0,0066, yang menunjukkan sedikitnya korelasi
antara konsentrasi dan absorbansi larutan standar metode Fuwa. Berdasarkan
Gambar 2, kurva standar untuk metode DNS memiliki fungsi Y = 8x10-6x + 0.0597
dan R2 = 0.167. Hal ini menunjukkan sedikit korelasi positif antara konsentrasi
dengan absorbansi larutan standar metode DNS. Persamaan kurva standar
digunakan untuk menemukan konsentrasi sampel pada durasi inkubasi yang
berbeda-beda dan menganalisis aktivitas α-amylase.
Perhitungan konsentrasi sampel metode Fuwa:
𝑦 = −7 × 10−6 𝑥 + 0.2741
0.001 = −7 × 10−6 𝑥 + 0.2741
−7 × 10−6 𝑥 = 0.001 − 0.2741 = −0.2731
−0.2731
𝑥5 = ≅ 39014 𝑝𝑝𝑚
−7 × 10−6
0.117 = −7 × 10−6 𝑥 + 0.2741; 𝑥10 ≈ 22443 𝑝𝑝𝑚
0.093 = −7 × 10−6 𝑥 + 0.2741; 𝑥15 ≅ 25871 𝑝𝑝𝑚
Perhitungan konsentrasi sampel metode DNS:
𝑦 = 8 × 10−6 𝑥 + 0.0597
0.77 = 8 × 10−6 𝑥 + 0.0597
8 × 10−6 𝑥 = 0.77 − 0.0597 = 0.7103
0.7103
𝑥5 = ≈ 88788 𝑝𝑝𝑚
8 × 10−6
0.71 = 8 × 10−6 𝑥 + 0.0597; 𝑥10 ≈ 81288 𝑝𝑝𝑚
0.74 = 8 × 10−6 𝑥 + 0.0597; 𝑥15 ≈ 85038 𝑝𝑝𝑚
Hasil perhitungan menggunakan persamaan kurva standar untuk metode
iodine (metode Fuwa) dan metode DNS menunjukkan bahwa pada metode Fuwa,
lama inkubasi berkorelasi negatif dengan konsentrasi sampel. Hal ini kemungkinan
menunjukkan bahwa semakin lama inkubasi pada suhu 37°C, semakin banyak pati
yang dihidrolisis, ditunjukkan dengan menurunnya konsentrasi pati pada sampel.
Namun, hubungan konsentrasi pati dengan lama inkubasi tidak didukung data
absorbansi yang didapat untuk metode Fuwa. Pada metode DNS, konsentrasi
berkorelasi positif dengan absorbansi, namun perbedaan absorbansi yang berkaitan
dengan lama inkubasi tidak terlalu signifikan. Hal ini kemungkinan karena metode
DNS tidak sesensitif metode lain, misalnya sensitivitas metode DNS 1/10
sensitivitas dari metode Nelson-Somogyi (Gusakov et al. 2011). Salah satu faktor
gagal yang mungkin dalam praktikum ini adalah penggunaan penangas air dalam
inkubasi sampel. Suhu air pada penangas air dapat naik melebihi 37°C hingga
mencapai titik didih, sehingga menyebabkan denaturasi enzim dan aktivitas
hidrolisis pati tidak dapat diamati. Faktor gagal mungkin yang terjadi adalah larutan
standar yang tumpah saat pemindahan sehingga perlu dibuat ulang, dan suhu larutan
standar yang saat pengukuran absorbansi karena lama pendinginan yang berbeda-
beda. Faktor gagal ini kemungkinan mempengaruhi kurva standar dari hasil yang
diperoleh pada praktikum ini secara signifikan. Kurva standar yang ideal
menunjukkan korelasi yang kuat antara konsentrasi dan absorbansi, yang dapat
diamati dari tingginya nilai R2.
SIMPULAN
Aktivitas α-amylase dan kadar pati yang terhidrolisis dipengaruhi oleh lama
inkubasi pada suhu 37°C. Kadar pati yang terhidrolisis meningkat dengan
meningkatnya lama inkubasi. Aktivitas α-amylase dan kadar pati terhidrolisis juga
dipengaruhi oleh faktor gagal percobaan yang juga dapat mempengaruhi data hasil
pengamatan dan kurva standar. Data hasil analisis hidrolisis pati juga dapat
dipengaruhi oleh sensitivitas metode yang digunakan.
DAFTAR PUSTAKA
Gusakov AV, Kondratyeva EG, Sinitsyn AP. 2011. Comparison of two methods
for assaying reducing sugars in the determination of carbohydrase activities.
Int J Anal Chem. 2011.
Nelson DL, Cox MM. 2017. Lehninger Principles of Biochemistry Seventh Edition.
New York (NY): W.H. Freeman and Company.
Saqib AAN, Whitney PJ. 2011. Differential behaviour of the dinitrosalicylic acid
(DNS) reagent towards mono-and di-saccharide sugars. Biomass Bioenergy.
35(11):4748–4750.
Xiao Z, Storms R, Tsang A. 2006. A quantitative starch-iodine method for
measuring alpha-amylase and glucoamylase activities. Anal Biochem.
351(1):146–148.