LAPORAN PELAKSANAAN PRAKTIKUM

LABORATORIUM BIOKIMIA JURUSAN KIMIA FMIPA UNIVERSITAS

LAMPUNG
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------
NAMA : Nabila Rifa Anisa
NPM : 1917021031
KELAS : Biologi B
KELOMPOK : 1 (Satu)
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------
JUDUL PERCOBAAN : Uji Kuantitatif Protein

TUJUAN PERCOBAAN :

Adapun tujuan dari praktikum kali ini, mahasiswa diharapkan dapat memahami dan melakukan
dengan baik uji kuantitatif protein untuk menentukan konsentrasi suatu analit di dalam sampel
melalui pengujian Biuret, Lowry, Bradford, maupun Bicinchoninic Acid Assay (BCA). Mahasiswa
juga diharapkan dapat membuat kurva standard BSA dari hasil pengamatan beserta persamaan
regresinya dan menghitung konsentrasi protein pada sampel yang diukur.

ALAT DAN BAHAN :

Adapun alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah tabung reaksi (16×100 mm), pipet tetes,
water bath, dan cuvette 1 cm.

Sedangkan bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah 2 g Natrium KaliumTtartrat x 4 H 20,
100 g Natrium Karbonat, 500 ml 1N NaOH, H20 hingga satu liter (yaitu, 7mM Na-K tartrat, 0,81M
Natrium Karbonat, konsentrasi akhir NaOH 0,5N), 1 gm tembaga sulfat (CuSO 4. 5H20), 90 ml H20,
10 ml 1N NaOH (konsentrasi akhir 70 mM Na-K tartrat, 40 mM tembaga sulfat), 1 vol reagen
Folin-Ciocalteau, dan aquades.

PRINSIP DAN PROSEDUR KERJA:

A. Prinsip Kerja

Prinsip dari pengujian ini adalah mengukur absorbansi pada pengenceran standar dan
sampel yang mengandung protein lalu menggambarkan hasil dalam bentuk kurva standar
BSA sehingga konsentrasi protein pada sampel yang diukur dapat diketahui.

B. Prosedur Kerja

1,0 ml setiap pengenceran standar dan sampel yang mengandung protein

- ditambahkan ke 0,90 ml reagen A dalam tabung

reaksi terpisah dan dicampurkan
- diinkubasi selama 10 menit pada water bath pada
suhu 50% dan didinginkan
- ditambahkan 0,1 ml reagen B, dicampur, dan
diinkubasi selama 10 menit
- ditambahkan 3 m raegen C, dicampur, diinkubasi 10
menit dalam rendaman 50◦C, dan didinginkan
- diukur absorbansi pada λ 750 nm dalam cuvette 1 cm

Hasil
DATA PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN
A. Data Pengamatan
1. Tabel Kurva Standar BSA

Tabung Konsentrasi Protein Absorbansi Standar BSA

(µg/mL) (A750nm) (µL)
1 0 0 0
2 2.5 0.05 1.25
3 5 0.1 2.5
4 7.5 0.15 3.75
5 10 0.2 5
6 12.5 0.25 6.25
7 15 0.3 7.5
8 17.5 0.35 8.75
9 20 0.38 10

2. Kurva Standar Protein

0.4

0.35

0.3
Absorbansi (A750nm)

0.25

0.2

0.15

0.1

0.05

0
0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20

Konsentrasi Protein (µg/mL)

3. Persamaan Regresi Linier

y = a + bx

y = 0,0031 + 0,0194x

4. Kadar Protein dalam Sampel

  Tabel Data Absorbansi Sampel

Sampel Absorbansi Sampel Absorbansi Kontrol

x 0.0687 0.0492

 Perhitungan Kadar Protein pada sampel

 y = Absorbansi sampel – Absorbansi Kontrol
y = 0,0687 – 0,0492
y = 0,0195

 y = a + bx

0,0195 = 0,0031 + 0,0194x

0,0195 – 0,0031 = 0,0194x

0,0164 = 0,0194x

x = 0,8453 mg/mL

B. Pembahasan
Prinsip dari metode uji kuantitatif protein Biuret adalah menghasilkan pembentukan
kompleks antara ion tembaga dan ikatan peptida. Cara kerja dari uji ini menggunakan
reagen biuret yang mengandung NaOH dan CuSO4 encer. Reagen biuret akan bereaksi
dengan ikatan peptida protein pada sampel. Adanya protein sampel ditunjukkan perubahan
sampel menjadi warna ungu. Mekanisme terbentuknya warna ungu pada uji biuret dimulai
dari pembuatan pereaksi biuret yang dibuat dari CuSO4 dan NaOH. Larutan dibuat alkalis
oeh NaOH kemudian ditambahkan sampel dan pereaksi bereaksi dengan sampel sehingga
menghasilkan senyawa komleks berwarna ungu. Pembentukan warna disebabkan karena
adanya kompleks ion Cu+ dengan ikatan peptida protein. Hasil reaksi dari metode Biuret
yaitu larutan yang mengalami perubahan warna menjadi ungu yang mengindikasikan
adanya protein.

Prinsip dari metode Lowry dalam uji kuantitatif protein terdiri dari dua tahap yaitu
pembentukan kompleks antara ion tembaga dan ikatan peptide, dan penambahan reagen
Folin-Ciocalteu yang membentuk warna biru. Cara kerja dari uji protein Lowry didasarkan
pada reaksi biuret dengan langkah-langkah tambahan dan reagen untuk meningkatkan
sensitivitas deteksi. Dalam reaksi biuret, tembaga berinteraksi dengan empat atom nitrogen
peptida untuk membentuk kompleks tembaga. Pada metode pengujian Lowry,
menambahkan asam phosphomolybdat/phosphotungstat juga dikenal sebagai reagen Folin-
Ciocalteu. Pereaksi ini berinteraksi dengan ion tembaga dan rantai samping tirosin,
triptofan, dan sistein. Hasil reaksi dari metode Lowry yaitu larutan yang menghasilkan
warna biru-hijau.

Prinsip dari metode Bradford dalam uji kuantitatif protein adalah adanya reaksi yang
terjadi antara protein dengan asam fosfotungsat pada suasana alkalis akan memberikan
warna biru. Cara kerja dari metode pengujian ini adalah dengan menggunakan pengikatan
zat warna biru Coomassie Briliant G-250 yang sangat baik untuk protein. Penggunaan
pewarna Coomassie Briliant G-250 berperan sebagai reagen kolorimetri untuk deteksi dan
kuantisasi total protein dalam metode Bradford. Pengembangan warna dalam tes protein
Bradford berhubungan dengan adanya asam amino basa tertentu (terutama arginin, lisin
dan histidin) dalam protein. Kekuatan van der Waals dan interaksi hidrofobik juga
berpartisipasi dalam pengikatan pewarna oleh protein. Dalam suasana regaen asam, protein
berikatan dengan pewarna Coomassie. Ini menghasilkan perubahan spektrum dari warna
kemerahan/coklat (maksimum absorbansi pada λ 465 nm) ke warna biru (maksimum
absorbansi pada λ 610 nm). Hasil reaksinya menghasilkan kompleks protein zat warna
kompleks dengan peningkatan absorbansi molar untuk penentuan konsentrasi protein.

Prinsip dari metode Bicinchoninic Acid Assay (BCA) adalah menggabungkan reaksi biuret
yang diinduksi protein dengan analisis secara kolorimetri yang sangat sensitif dan selektif
dari kation Cupro yang dihasilkan (Cu1 +) oleh asam bicinchoninic (BCA). Cara kerja dari
metode ini melalui dua tahap yaitu, pertama adalah reaksi biuret, yang menghasilkan warna
biru samar hasil dari pengurangan ion cupri ke ion cuprous. Yang kedua adalah
pengkhelatan BCA dengan ion tembaga, menghasilkan warna ungu yang lebih jelas.
Kompleks BCA / tembaga larut dalam air dan menunjukkan absorbansi linier yang kuat
pada λ 562 nm dengan meningkatnya konsentrasi protein. Produk atau hasil reaksi dari
metode Bicinchoninic Acid Assay (BCA) adalah larutan yang berwarna ungu dibentuk
oleh pengkhelatan dua molekul BCA dengan satu ion cuprous.

Cara membuat kurva standar protein adalah menambahkan 1,0 ml setiap pengenceran
standar, dan sampel yang mengandung protein yang tidak diketahui, atau buffer (sebagai
control negatif) ke 0,90 ml reagen A dalam tabung reaksi terpisah dan campurkan dengan
baik. Menginkubasikan tabung selama 10 menit pada water bath pada suhu 50 C, lalu
mendinginkannya hingga suhu kamar. Menambahkan 0,1 ml reagen B ke setiap tabung lalu
mencampur dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu kamar. Dengan cepat
menambahkan 3 ml reagen C ke setiap tabung, lalu mencampurnya dengan baik dan
diinkubasi 10 menit dalam rendaman 50 C, setelah itu didinginkan hingga suhu kamar.
Volume pengujian akhir adalah 5 ml. Mengukur absorbansi pada λ 750 nm dalam cuvette 1
cm. Kemudian memplotkan Absorbansi sebagai sumbu Y dan konsentrasi sebagai sumbu
X untuk memperoleh kurva standar BSA.

Kelebihan dari metode pengujian Biuret adalah reagen yang digunakan hanya satu macam,
tidak memerlukan biaya yang mahal, mengefisiensikan waktu karena berlangsung cepat,
penyimpangan warna yang hampir tidak pernah ditemukan dibandingkan metode lain,
sangat sedikit substansi lain yang terdeteksi, dan N dari non peptide dan non peptide tidak
terdeteksi.Kelebihan dari metode pengujian Lowry yaitu pengujian yang bersifat sangat
sensitif (50-100× lebih sensitif daripada metode Biuret dan 10-20× lebih sensitif dari UV
absorption method), kurang dipengaruhi oleh turbiditas sampel, pengujiannya lebih
spesifik, dan pereaksian yang sederhana dapat dilakukan 1-1,5 jam.

Kelebihan dari metode pengujian Bradford adalah mengefisiensikan waktu karena

pereaksiannya berlangsung cepat (2 menit), tidak terpengaruh ammonium sulfat, sukrosa
atau kation, dapat mengukur protein dengan BM lebih dari 4000 da, dan pereaksi yang
digunakan sangat sederhana dan mudah untuk disiapkan. Selain itu, kompleks warna biru
pada larutan yang diberi reagen bardford sangat cepat terbentuk dan bersifat stabil.
Kestabilan warna biru coomasie ini dikarenakan adanya interaksi antara lapisan hidrofobik
dari protein dengan bentuk anion dari zat warna coomaise brilliant blue G250 yang
menstabilkan bentuk anion tersebut. Kelebihan dari metode pengujian Bicinchoninic Acid
Assay (BCA) adalah metode ini sangat sensitif dengan kemampuan pengukuran protein
dari 0,5 µg/mL hingga 1,5 mg/mL, warna kompleks yang terbentuk stabil, tidak rentan
terhadap detergen, dan dapat diterapkan pada rentang yang luas pada konsentrasi protein.

TANDA TANGAN NILAI DAN PENGESAHAN PENGESAHAN DOSEN

PRAKTIKAN ASISTEN

Nama : Nabila Rifa Anisa

NPM : 1917021031