IDENTIFIKASI DAN PENETAPAN KADAR

VITAMIN C, B1, B2, Nikotinamida dan B6

DALAM SUPLEMEN KESEHATAN SEDIAAN CAIR
SECARA KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI
DENGAN DETEKTOR PHOTO DIODE ARRAY
14/PK/15

I. RUANG LINGKUP

Metode ini digunakan untuk penetapan kadar vitamin C, B1, B2,

Nikotinamida dan B6 dalam suplemen kesehatan sediaan cair secara
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dengan detektor Photo Diode Array.

II. PUSTAKA

a. SK Kepala Badan POM No. HK.00.05.23.3644 Tahun 2004.

b. Anonim, 2012, USP Dietary Supplement, Volume I, United Stated

Pharmacopeia Convention Inc, Twinbrook Parkway, Rockville.

c. Novi Yantih, dkk, Pemisahan delapan vitamin larut air secara

kromatografi pasangan ion, Fakultas Farmasi Universitas Pancasila,
Jakarta.

d. Miller, J.C dan J.N. Miller, 1993. Statistics for Analytical Chemistry,
3rd ed. Ellis Horwood PTR Prentice hall, London: 40-44 dan 75-77.

III. PRINSIP

Vitamin C, B1, B2, Nikotinamida dan B6 dipisahkan dari matriks sampel

dan ditetapkan kadarnya secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
menggunakan fase terbalik dan teknik KCKT pasangan ion.

IV. BAHAN DAN BAKU PEMBANDING

1. Bahan
-

2. Baku Pembanding
Vitamin C, B1, B2, Nikotinamida dan B6 BPFI.

V. PEREAKSI

Asetonitril berderajat KCKT, Asam Asetat, NaOH, Natrium Heksan

Sulfonat.

Pembuatan Larutan:
 - Larutan asam asetat 1%
- Larutan natrium hidroksida 0,01 N
- Larutan natrium heksan sulfonat : sejumlah 941,1 mg natrium heksan
sulfonat dilarutkan dalam larutan asam formiat 0,1% hingga 1000,0 mL
kemudian pH diatur hingga 3,5 dengan penambahan larutan kalium
hidroksida 10%.

VI. PERALATAN

Seperangkat alat KCKT dengan kolom C8 dan detektor UV; sonikator;

penyaring membran.

VII. PROSEDUR

1. Larutan Uji
Dipipet sejumlah satu dosis sampel atau 5,0 mL untuk sampel sirup ke
dalam tabung sentrifus, ditambahkan 10 mL larutan NaOH 0,01 N dan
dikocok dengan vortex selama 1 menit. Kemudian ditambahkan 10 mL
larutan asam asetat 1% dan dikocok dengan vortex selama 1 menit.
Larutan dituang ke dalam labu tentukur 100,0 mL, ditambahkan air
sampai tanda dan dikocok hingga homogen. Larutan sampel dipipet
sejumlah 1,0 mL ke dalam labu tentukur 5,0 mL, ditambahkan air
sampai tanda dan dikocok homogen. Larutan disaring dengan penyaring
membran 0,45 µm.

2. Larutan Baku
a. Larutan Baku Induk Vitamin C :
Sejumlah 10 mg Vitamin C BPFI ditimbang saksama dan
dimasukkan ke dalam labu tentukur 10,0 mL, dilarutkan dan
diencerkan dengan larutan asam asetat 1% sampai tanda.
b. Larutan Baku Induk Vitamin B1, Nikotinamida dan B6 :
Sejumlah 5 mg Vitamin B1, Nikotinamida dan B6 BPFI ditimbang
saksama dan dimasukkan ke dalam labu tentukur 10,0 mL,
dilarutkan dan diencerkan dengan larutan asam asetat 1% sampai
tanda.
c. Larutan Baku Induk Vitamin B2 :
Sejumlah 5 mg Vitamin B2 BPFI ditimbang saksama dan
dimasukkan ke dalam labu tentukur 10,0 mL, dilarutkan dan
diencerkan dengan larutan NaOH 0,01 N sampai tanda.

Larutan Seri Baku Kerja :

Sejumlah tertentu larutan baku induk vitamin C, B1, B2, Nikotinamida
dan B6 dipipet ke dalam labu tentukur 5,0 mL dan encerkan dengan
aquadem sampai tanda, yaitu:
- Baku seri 1 : 100 µL larutan baku induk masing-masing
vitamin
- Baku seri 2 : 200 µL larutan baku induk masing-masing
vitamin
- Baku seri 3 : 300 µL larutan baku induk masing-masing
vitamin
- Baku seri 4 : 400 µL larutan baku induk masing-masing
vitamin
 - Baku seri 5 : 500 µL larutan baku induk masing-masing
vitamin
Masing-masing larutan disaring dengan penyaring membran 0,45 µm.

Catatan.
Linieritas baku vitamin berada dalam rentang sebagai berikut :
a. Vitamin C : 20 – 100 ppm
b. Vitamin B1, B2, Nikotinamida dan B6 : 10 – 50 ppm
Sehingga pengenceran sampel agar disesuaikan supaya berada dalam
rentang baku tersebut di atas.

3. Cara penetapan
Larutan sampel dan larutan seri baku kerja disuntikkan secara terpisah
ke dalam alat kromatograf cair kinerja tinggi dengan kondisi sebagai
berikut:

Fase Gerak Asetonitril dan larutan heksan sulfonat pH 3,5

dengan sistem gradien sbb :

Komposisi fase gerak (%)

Menit Asetonitril Larutan natrium
heksan sulfonat
0,01 0 100
4,00 7,5 92,5
23,00 7,5 92,5
23,01 0 100
30,00 Stop

Kolom C8 (4,6 x 250 mm), ukuran partikel 5 µm.

Suhu kolom -
Laju Alir 1,0 mL/menit
Volume Penyuntikan 20 L
Detektor UV pada panjang gelombang 254 dan 275 nm
(254 untuk vitamin C, B1, Nikotinamida; 275
untuk vitamin B2 dan B6)

4. Interpretasi Hasil
Perhitungan kadar :
Kurva kalibrasi dibuat dengan plot konsentrasi larutan seri baku kerja
terhadap respon puncak.

yi  a
Kurva kalibrasi: y = bx + a, maka xi =
b

Kandungan vitamin (mg/5 mL) =  xi . 5 . 100 .

1
mg
1000

Keterangan :
yi = luas puncak larutan uji
xi = konsentrasi larutan uji hasil plot terhadap kurva baku (µg/mL)
a = intersep
b = slope
5 = faktor pengenceran sampel
 100 = volume labu tentukur

Kadar sampel (%) =

Kandungan vita min dalam sampel (mg / 5 mL)

x 100%
Kandungan vita min pada etiket (mg / 5 mL)

VIII. PERSYARATAN

Vitamin B1 : 90,0 – 250,0 %

Vitamin B2 : 90,0 – 150,0 %
Nikotinamida : 90,0 – 150,0 %
Vitamin B6 : 90,0 – 150,0 %
Vitamin C : 90,0 – 250,0 %
IX. HASIL VALIDASI

1. Spesifisitas/Selektivitas
a. Kromatogram pelarut pada 254 nm

b. Kromatogram pelarut pada 275 nm

c. Kromatogram baku pada 254 nm

d. Kromatogram baku pada 275 nm

e. Kromatogram sampel pada 254 nm

f. Kromatogram sampel pada 275 nm

g. Kromatogram spiked sample pada 254 nm

h. Kromatogram spiked sample pada 275 nm

i. Spektrum baku
a. Vitamin B6 b. Vitamin B2
194

m AU mAU
12.45/ 1.00 21.97/ 1.00
450
600
400

500
350

400
300
220

250
290

300
200

200
267

200 150

100
242

100
373
251

50
304

0
0

200 250 300 350 nm

200 250 300 350 nm

c. Vitamin C d. Vitamin B3
195

mAU mAU
3.27/ 1.00 9.25/ 1.00
1100 700

1000
600
900

800 500

700
400
244

600

500 300
400
261
207

200
300
244

200
100
100
318
329
339
351
356

0 0

-100
200 250 300 350 nm 200 250 300 350 nm
 e. Vitamn B1
m AU
16.08/ 1.00
450

400

350

300

250

200

243
231
150

100

50

339
0

200 250 300 350 nm

2. Linieritas
a. Vitamin B6
r = 0,99993; Vx0 = 0,7
b. Vitamin B2
r = 0,99993; Vx0 = 0,6
c. Vitamin C
r = 0,99546; Vx0 = 5,0
d. Vitamin B3
r = 0,99972; Vx0 = 1,3
e. Vitamin B1
r = 0,99912; Vx0 = 2,2
(Syarat r ≥ 0,995; Vx0 ≤ 5)

3. Presisi
a. Vitamin B6
Kadar 30,79 μg/mL : Nilai Horrat = 0,184; n = 7
RSD = 1,169%; RSD Horwitz = 6,368%
b. Vitamin B2
Kadar 10,94 μg/mL : Nilai Horrat = 0,097; n = 7
RSD = 0,719%; RSD Horwitz = 7,441%
c. Vitamin C
Kadar 86,52 μg/mL : Nilai Horrat = 0,248 n = 7
RSD = 1,350%; RSD Horwitz = 5,451%
d. Vitamin B3
Kadar 45,47 μg/mL : Nilai Horrat = 0,126; n = 7
RSD = 0,759%; RSD Horwitz = 6,005%
e. Vitamin B1
Kadar 27,28 μg/mL : Nilai Horrat = 0,230; n = 7
RSD = 1,490%; RSD Horwitz = 6,485%
(Syarat : Horrat ≤ 2,0)

4. Akurasi
a. Vitamin B6
Konsentrasi dalam sirup : 0,30% (b/v),
rentang rekoveri = 98,90 - 102,41%.
b. Vitamin B2
Konsentrasi dalam sirup : 0,10% (b/v),
rentang rekoveri = 103,27 - 104,75%.
c. Vitamin C
 Konsentrasi dalam sirup : 0,83% (b/v),
rentang rekoveri = 102,19 - 104,67%.
d. Vitamin B3
Konsentrasi dalam sirup : 0,45% (b/v),
rentang rekoveri = 100,64 - 103,01%.
e. Vitamin B1
Konsentrasi dalam sirup : 0,21% (b/v),
rentang rekoveri = 98,57 - 103,03%.
Syarat rekoveri : 95 - 105%.

5. LOD
a. Vitamin B6
LOD = 0,04 mg/mL
b. Vitamin B2
LOD = 0,49 mg/mL
c. Vitamin C
LOD = 1,30 mg/mL
d. Vitamin B3
LOD = 0,10 mg/mL
e. Vitamin B1
LOD = 0,16 mg/mL

6. LOQ
a. Vitamin B6
LOQ = 0,13 mg/mL
b. Vitamin B2
LOQ = 1,65 mg/mL
c. Vitamin C
LOQ = 4,32 mg/mL
d. Vitamin B3
LOQ = 0,33 mg/mL
e. Vitamin B1
LOQ = 0,55 mg/mL