PRAKTIKUM I

PENGEMBANGAN METODE ANALISIS OBAT

DALAM SAMPEL BIOLOGIS
(Limit Of Detection, Limit Of Quantification, Linieritas)

I. TUJUAN
Melakukan validasi metode analisis sampel, penentuan kalibrasi dengan
spektrofotometri untuk memastikan bahwa metode tetap yang digunakan sudah sesuai
dengan tujuan penggunaannya dan selalu memberikan hasil yang akurat dan dapat
dipercaya.
II. PRINSIP
Mampu menentukan validasi metode analisis obat dalam sampel biologis
berdasarkan parameter validasi metode analisis dengan melihat LOD & LOQ yang
dihasilkan.
III. DASAR TEORI
Tahap awal dalam penelitian farmakokinetik yang sangat menentukan adalah
penetapan kadar obat dalam sampel biologis, karena parameter farmakokinetik obat
diperoleh berdasarkan hasil pengukuran kadar obat utuh dan atau hasil uraian (metabolik)
dalam sampel biologsi seperti darah, urine, saliva, dan lain-lain. Metode analisis yang
digunakan untuk menentukan kuantitatif kadar obat dalam suatu sampel biologis
merupakan hal yang sangat penting dalam evaluasi dan interpretasi data farmakokinetik.
Oleh karena itu metode analisis yang tervalidasi merupakan suatu kebutuhan mutlak untuk
memperoleh hasil yang dapat dipecaya.
Tahap untuk mendapat motede analisis yang valid untuk diaplikasikan dalam suatu
penelitian farmakokinetik meliputi:
1. Pengembangan metode analisis
2. Validasi metode analisis yang digunakan
Validasi metoda analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu,
berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa parameter tersebut
memenuhi persyaratan untuk penggunaannya. Validasi metode analisis bertujuan untuk
memastikan dan mengkonfirmasi bahwa metode analisis tersebut sudah sesuai untuk
peruntukannya (Harmita, 2004).
Validasi suatu metode anlisis dilakukan untuk menjamin bahwa metode yang akan
digunakan adalah valid dan terpercaya. Beberapa parameter digunakan untuk mengevaluasi
validitas dan metode yang dikembangkan, antara lain: perolehan kembali (recovery) obat
dari matriks biologi yang digunakan, presisi dan akurasi. Persyartan yang dituntut bagi
suatu metode tersebut dapat memberikan nilai perolehan kembali yang tinggi (75-90% atau
lebih), kesalahan acak dan kesalahan sistemik kurang dari (10%). Kepekaan dan
selektivitas peralatan merupakan kriteria lain yang penting, hal mana nilainya akan sangat
tergantung dari alat pengukur yang digunakan. Stabilitas obat akan diteliti dalam matriks
sampel juga harus diperhatikan (Riyadi, 2009).
Parameter Validasi Metode Analisis
Prosedur analisis yang harus divalidasi meliputi beberapa jenis pengujian,
yaitu adanya pengotor, uji limit untuk mengendalikan keberadaan pengotor, serta uji
kuantitatif komponen aktif atau komponen lain dalam produk obat-obatan. Selain itu,
terdapat 8 parameter validasi metode analisis yaitu spesifisitas, presisi/ ketelitian, akurasi/
ketepatan, linieritas, kisaran, limit deteksi, limit akurasi, dan ketangguhan. Pemilihan
parameter yang akan diuji tergantung dari jenis dan metode pengujian yang akan
divalidasi.
Limit Deteksi dan Limit Kuantitasi
Limit deteksi merupakan jumlah atau konsentrasi terkecil analit dalam sampel yang
dapat dideteksi, namun tidak perlu diukur sesuai dengan nilai sebenarnya. Limit kuantitasi
adalah jumlah analit terkecil dalam sampel yang dapat ditentukan secara kuantitatif pada
tingkat ketelitian dan ketepatan yang baik. Limit kuantitasi merupakan parameter
pengujian kuantitatif untuk konsentrasi analit yang rendah dalam matriks yang kompleks
dan digunakan untuk menentukan adanya pengotor atau degradasi produk. Limit deteksi
dan limit kuantitasi dihitung dari rerata kemiringan garis dan simpangan baku intersep
kurva standar yang diperoleh.
Spektrofotometri UV-Visible
Spektrofotometer UV-Vis adalah pengukuran panjang gelombang dan intensitas sinar
ultraviolet dan cahaya tampak yang di absorbsi oleh sampel. Spektrofotometer UV-Vis
biasanya digunakan untuk molekul dan ion anorganik atau kompleks dalam larutan. Sinar
 ultraviolet berada pada panjang gelombang 200-400 nm, sedangkan sinar tampak berada
pada panjang gelombang 400-800 nm. Sebagai sumber cahaya biasanya di gunakan lampu
hydrogen atau deuterium untuk pengukuran UV dan lampu tungsten untuk pengukuran
pada cahaya tampak (Dachriyanus, 2004).
IV. TUGAS PENDAHULUAN
1. Tuliskan pembuatan dapar phospat pH 7,4 dan perhitungannyaa !
a. 50 mL KH2PO4 0,2 M
b. 39,1 mL NaOH 0,2 N
c. Dicampurkan dan ditambahkan air bebas CO2 add 200 mL, atur pH 7,4 ± 0,05
Cara pembuatan dapar phospat pH 7,4 :
Melakukan kalibrasi wadah, kemudian memasukan 50 mL KH2PO4 0,2 M dan 39,1 mL
NaOH 0,2 N. Lalu dicampurkan dan ditambahkan air bebas CO2 add 200 mL dan atur
pH sampai 7,4 ± 0,05
2. Jelaskan perhitungan dan pembuatan larutan induk Paracetamol 1000 bpj sebanyak 100
mL!
Jawab :
1000 bpj / 100 mL = 1000 µg x 100 mL
= 100.000 µg/mL
= 100 mg/mL
Cara pembuatan larutan induk Paracetamol :
Menimbang sebanyak 100 mg Paracetamol, dimasukkan kedalam labu ukur 100 mL,
kemudian ditambahkan pelarut sampai tanda batas dan kocok hingga terlarut!
3. Jelaskan perhitungan pengenceran dari larutan induk 1000 bpj ke 100 bpj dalam 100
mL. Dari 100 bpj diencerkan ke larutan dengan konsentrasi 2,4,6,10 dan 12 ppm dalam
50 mL!
Jawab :
V1. N1 = V2. N2
V1. 1000 bpj = 100 mL. 100 bpj
V1 = 10 mL
Pengenceran larutan induk dengan konsentrasi 2,4,6,10 dan 12 ppm sebanyak 50 mL
 a. 2 ppm
V1. N1 = V2. N2
V1. 100 bpj = 50 mL. 2 ppm
V1 = 1 mL
b. 4 ppm
V1. N1 = V2. N2
V1. 100 bpj = 50 mL. 4 ppm
V1 = 2 mL
c. 6 ppm
V1. N1 = V2. N2
V1. 100 bpj = 50 mL. 6 ppm
V1 = 3 mL
d. 10 ppm
V1. N1 = V2. N2
V1. 100 bpj = 50 mL. 10 ppm
V1 = 5 mL
e. 12 ppm
V1. N1 = V2. N2
V1. 100 bpj = 50 mL. 12 ppm
V1 = 6 mL
V. ALAT DAN BAHAN
a. Alat
1. Mikropipet
2. Vortex
3. Spektrofotometri UV-Vis
4. Labu ukur
5. Gelas ukur
6. Beaker glass
7. pH meter
8. Tabung reaksi
9. Pipet ukur
 b. Bahan
1. Paracetamol
2. KH2PO4 0,2 M
3. NaOH 0,2 N
4. Aquadest
5. HCl 6 N
6. NaNO2 10%
7. Asam amidosulfonat 15%
8. NaOH 10%
VI. PROSEDUR
1. Pembuatan larutan baku dapar phospat pH 7,4
Kalibrasi wadah 2 L dan hitung jumlah volume larutan KH2PO4 dan
NaOH yang diperlukan

50 mL KH2PO4 0,2 M 39,1 mL NaOH 0,2 N

Dicampurkan dan ditambahkan air bebas CO2 add 200 mL, atur pH 7,4 ± 0,05
2. Pembuatan pereaksi warna
HCl 6 N NaNO2 10% Asam amidosulfonat 15% NaOH 10%

Masing-masing dalam 100 mL

Campurkan masing-masing larutan dan aduk hingga homogen
3. Pembuatan kurva kalibrasi Paracetamol 1
Membuat larutan induk Paracetamol 1000 bpj sebanyak 50 mL

Pengenceran larutan induk Paracetamol 100 mL sebanyak 10 mL (menjadi 100 ppm)

2 ppm 4 ppm 6 ppm 10 ppm 12 ppm

Ditambahkan dapar phospat pH 7,4 sebanyak 10 mL

 Ukur A dengan λmaks 243 nm dengan spektrofotometri UV-Vis
4. Pembuatan kurva kalibrasi Paracetamol 2
Membuat larutan induk Paracetamol 1000 bpj sebanyak 50 mL

2 ppm 4 ppm 6 ppm 10 ppm 12 ppm

(0,2 mL) (0,4 mL) (0,6 mL) (1 mL) (1,2 mL)

Ditambahkan dapar phospat pH 7,4 sebanyak 10 mL

Ambil 1 mL tabung reaksi

Pereaksi warna :
+ 0,5 mL HCl 6 N
+ 1,0 mL NaNO2 10 %
Vortex 1 menit diamkan 5 menit
+ 1 mL Asam amidosulfonat 15%
+ 2,5 mL NaOH 10%
Diamkan 3 menit dalam es
Ukur A dengan λmaks 435 nm dengan spektrofotometri UV-Vis

VII. HASIL PENGAMATAN

A. Kurva Kalibrasi Paracetamol λ243 nm

Kurva Kalibrasi Paracetamol λ243 nm

0.8
0.7
A 0.6
b
0.5
s
0.4
o y = 0.0603x - 0.0115
0.3 R² = 0.9845
r
b 0.2
a 0.1
n 0
s 0 2 4 6 8 10 12 14
i Konsentrasi (bpj)
B. Hasi Pengamatan Absorbansi Paracetamol λ243 nm
Konsentrasi
Absorban (y) y1 y-y1 | y-y1|2
(bpj) (x)
Blanko (0) 0,000 0 0 0
2 0,098 0,1091 -0,0111 0,00012321
4 0,225 0,2297 0,0253 0,00064009
6 0,323 0,3503 -0,0273 0,00074529
8 0,506 0,4709 0,0351 0,00123201
10 0,558 0,5915 -0,0335 0,00112225
12 0,724 0,7121 0,0119 0,00014161
Total 0,00400446
SD 0,028300035
Y = 0,0603x-0,0115
LOD 1,407961957
LOQ 4,693206523

C. Kurva Kalibrasi Paracetamol λ435 nm

Kurva Kalibrasi Paracetamol λ435 nm

0.5
A
b 0.4
s
o 0.3
r
0.2
b y = 0.0039x - 0.0164
a 0.1 R² = 0.9931
n
s 0
i 0 20 40 60 80 100 120 140
Konsenterasi (bpj)
 D. Hasi Pengamatan Absorbansi Paracetamol λ435 nm
Konsentrasi
Absorban (y) y1 y-y1 | y-y1|2
(bpj) (x)
20 0,057 0,0616 -0,0046 0,00002116
40 0,135 0,1396 -0,0046 0,00002116
60 0,225 0,2176 0,0074 0,00005476
80 0,311 0,2956 0,0154 0,00023716
100 0,391 0,3736 0,0174 0,00030276
120 0,438 0,4516 -0,0136 0,00018496
Total 0,00082196
SD 0,012821544
Y = 0,0039x- 0,0164
LOD 9,862726438
LOQ 32,87575479

VIII. PEMBAHASAN
Pada praktikum kali ini dilakukan validasi metode spektrofotometri uv-vis pada dua
panjang gelombang yaitu 243 nm dan 435 nm yang bertujuan untuk memastikan dan
mengkonfirmasi bahwa metode analisis tersebut sudah sesuai untuk
peruntukannya (Gandjar & Rohman, 2017). Validasi suatu metode anlisis dilakukan untuk
menjamin bahwa metode yang akan digunakan adalah valid dan terpercaya. Terdapat 8
parameter validasi metode analisis digunakan untuk mengevaluasi validitas dan metode
yang dikembangkan, antara lain yaitu spesifisitas, presisi/ ketelitian, akurasi/ ketepatan,
linieritas, kisaran, limit deteksi, limit akurasi, dan ketangguhan. Pemilihan parameter yang
akan diuji tergantung dari jenis dan metode pengujian yang akan divalidasi (Chan, 2004).
Prinsip dasar Spektrofotometri UV-Vis adalah serapan cahaya. Bila cahaya jatuh
pada senyawa, maka sebagian dari cahaya diserap oleh molekul-molekul sesuai dengan
struktur dari molekul senyawa tersebut. Serapan cahaya oleh molekul dalam daerah
spektrum UV-Vis tergantung pada struktur elektronik dari molekul. Spektrofotometri UV-
Vis dari senyawa-senyawa organik berkaitan erat dengan transisi-transisi diantara
tingkatan-tingkatan tenaga elektronik. Radiasi ultraviolet dan sinar tampak diabsorpsi oleh
molekul organik aromatik, molekul yang mengandung elektron-π terkonjugasi dan atau
atom yang mengandung elektron-n, menyebabkan transisi elektron di orbital terluarnya
dari tingkat energi elektron tereksitasi lebih tinggi. Besarnya serapan radiasi tersebut
sebanding dengan banyaknya molekul analit yang mengabsorpsi sehingga dapat digunakan
untuk analisis kuantitatif. Dalam hal ini, hukum Lamber beer dapat menyatakan hubungan
antara serapan cahaya dengan konsentrasi zat dalam larutan (Dachriyanus, 2004).
Pengujian dilakukan dengan menggunakan sampel Paracetamol. Dimana paracetamol
mempunyai gugus kromofor dan auksokrom yang menyebabkan senyawa ini dapat
dianalisis karena dapat menyerap radiasi pada daerah UV.
Parameter yang di uji pada praktikum kali ini adalah linieritas batas deteksi dan batas
kuantifikasi. Linieritas suatu metode merupakan ukuran seberapa baik kurva kalibrasi yang
menghubungkan respon (y) dan konsenterasi (x). Liniertias yang baik adalah yang dimana
nilai yang diperoleh mendekati 1. Linieritas dapat diukur dengan pengukuran tunggal pada
konsentrasi sampel yang berbeda-beda. Pada percobaan yang dilakukan pada paracetamol
dengan panjang gelombang 243 nm nilai r yang diperoleh sebesar 0,9845 dengan
persamaan regresi linier yaitu y = 0,0603x - 0,0115 pada konsentrasi 2 ppm, 4 ppm, 6 ppm,
10 ppm dan 12 ppm dan pada paracetamol dengan panjang gelombang 435 nm nilai r yang
diperoleh sebesar 0,9931 pada konsentrasi 20 ppm, 40 ppm, 60 ppm, 100 ppm dan 120
ppm dengan persamaan regresi linier yaitu y = 0,0039x - 0,0164.
Dari persamaan ini dapat dihitung nilai batas deteksi dan batas kuantifikasi.
Konsentrasi sampel yang dibuat berdasarkan Hukum Lambert-Beer dimana menggunakan
absorptivitas dan range absorbansi 0,2-0,8. Dari hasil yang diperoleh nilai r sudah
mendekati 1. Liniertias merupakan kemampuan suatu metode analisis instrument untuk
memberikan respon yang profesional terhadap konsentrasi analit dalam suatu sampel.
Limit of detection merupakan konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih
dapat terdeteksi oleh suatu alat ataupun instrumen, meskipun tidak selalu dapat
dikuantifikasi. Hasil LOD yang diperoleh pada panjang gelombang 243 nm yaitu sebesar
1,4079 bpj dan diperoleh nilai batas kuantifikasi adalah sebesar 4,6932 bpj dimana nilai
tersebut merupakan konsenterasi terendah yang dapat dikuantifikasi oleh sepektrofotometri
uv pada rentang absorbansi λ200-400nm. Nilai LOD dan LOQ diperoleh dari perhitungan
SD (standar deviasi) dari hasil persamaan regersi linier yang diperoleh sebelumnya.
Pada konsenterasi paracetamol 20 ppm, 40 ppm, 60 ppm, 10 ppm dan 120 ppm
dilakukan pada absorbansi pada panjang gelombang 435 nm pada rentang absorbansi λ
409-800 nm dengan alat sperktrofotometri uv-vis. Paracetamol merupakan zat yang tidak
 berwarna dan memiliki serapan pada gelombang uv, oleh karena itu sampal paracetamol
terlebih dahulu diberikan pewarnaan menggunakan reaksi warna agar dapat diukur pada
rentang gelombang visible. Dimana syarat dari penggunaan spektrofotometri uv-vis adalah
pada rentang absorbansi λ409-800 nm ialah harus berwarna.
Pewarnaan pada sampel Paracetamol dilakukan dengan cara penambahan HCl 6 N
0,5 mL dan NaNO2 10% 1 mL, kemudian didiamkan selama 5 menit. Kemudian
ditambahkan Asam amidosulfonat 15% 1 mL dan ditambahkan NaOH 10% sebanyak 2,5
mL didiamkan dan didinginkan dengan es selama 3 menit, kemudian dilakukan
pengukuran absorbansinya.
Nilai SD (Standar deviasi) yang diperoleh sebesar 0,0128 dimana nilai yang
diperoleh <2 yang artinya memiliki standar deviasinya untuk konsentrasi pada absorbansi
λ435 nm sedangkan pada λ243 diperloeh nilai standar deviasinya sebesar 0,0283 dimana
nilai nilai yang diperoleh <2 yang dapat diartikan juga memenuhi syarat hasil dari standar
deviasi. Pada praktikum kali ini LOD yang berarti nilai terkecil yang masih dapat
terdeteksi pada sampel yaitu sebesar 9,8627 bpj dan nilai batas kuantifikasi pada sampel
yaitu sebesar 32,8757 bpj yang merupakan konsenterasi terendah yang dapat
dikuantifikasikan oleh alat spektrofotometri visible.
IX. KESIMPULAN
Dari hasil yang diperoleh dapat disimpulkan bahwa hasil validasi spektrofotometri uv
pada λ243 nm diperoleh nilai persamaan regresi linier yaitu y=0,0603x - 0,0115 dengan
linieritas sebesar 0,0283, LOD 1,4079 ppm dan LOQ 4,6932 ppm. Dan hasil validasi
spektrofotometri visible pada λ435 nm diperoleh nilai persamaan regresi linier yaitu
y=0,0039 - 0,0164 dengan linieritas sebesar 0,0128, LOD 9,8627 ppm dan LOQ
32,8757ppm.
LOD merupakan konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat
dideteksi meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi. Sedangkan nilai LOQ merupakan
konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat ditentukan. Dari nilai yang
diperoleh dapat disimpulkan bahwa nilai batas kuantifikasi selalu lebih besar dari nilai
batas deteksi.
X. DAFTAR PUSTAKA
Chan, C. C, Lam, Herman. Lee, Y. C. and Zhang, Xue-Ming. 2004. Analytical Method
Validation and Instrument Performance Verification. John Wiley & Sons. Canada.
Dachriyanus. 2004. Analisis Struktur Senyawa Organik Secara Spektroskopi Edisi I.
Penerbit Andalas University Press. Padang.
Departemen Kesehatan RI. 1995. Farmakope Indonesia Edisi IV. Depkes RI. Jakarta.
Gandjar, G.I & Rohman, A. 2017. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Belajar. Yogyakarta.
Harmita. 2004. Petunujk Pelaksanaan Validasi Metode Dan Cara Perhitungannya. Review
Artikel. Departemen Farmasi FMIPA UI. Universitas Indonesia. Jakarta
Riyadi, Wahyu. 2009. Validasi Metode Analisis. Tersedia di http://www.chem-is-
try.org/artikel_kimia/kimia_analisis/validasi-metode-analisis/ [diakses tanggal 15
Oktober 2020].
XI. LAMPIRAN

Gambar 1. Gambar 2. Gambar 3.

Alat Spektrofotometri UV-Vis Kuvet berisi sampel Proses pengoperasian alat
Spektrofotometri UV-Vis