Penetapan Kadar Aspartam dalam Permen Secara Kromatografi Cair

Kinerja Tinggi.

A. Tanggal Percobaan
Selasa, 21 Februari 2019

B. Ruang Lingkup
Metoda ini digunakan untuk Penetapan Kadar Aspartam dalam Permen Secara
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi.

C. Prinsip
Pemisahan aspartam dari senyawa lain secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
(KCKT) dalam kolom oktadesisilan menggunakan fase gerak campuran dapar
fosfat dan asetonitril dengan detektor UV pada panjang gelombang 210 nm.

D. Pustaka
MA PPOMN 23/PA/05

E. Prosedur Asli

1. Larutan Uji
Ditimbang saksama sejumlah lebih kurang 0,3 g contoh sirup; 1,3 g
minuman ringan atau 0,5 g minuman serbuk, dimasukkan ke dalam labu tentukur
50 ml, ditambah 25 ml fase gerak, kemudian dikocok dan ditambah fase gerak
sampai tanda, dikocok (untuk minuman serbuk, pipet 1,0 ml-5,0 ml, ditambah
fase gerak sampai 50 ml). Disaring dengan penyaring membran 0,45 𝜇𝑚 dan
diawaudarakan (A).

2. Larutan Baku
Sejumlah lebih kurang 50 mg aspartam baku, ditimbang saksama
dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml, ditambah 25 ml fase gerak, dikocok
sampai larut dan diencerkan dengan fase gerak sampai tanda (A). Dipipet 0,5;
1,0; 1,5; 2,0; dan 2,5 ml larutan A. Dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml,
 masing-masing ditambah fase gerak sampai tanda, dikocok, disaring dengan
penyaring membrane 0,45 µm dan diawaudarakan.

3. Penetapan Kadar
Larutan A dan B disuntikkan secara terpisah dan dilakukan kromatografi
cair kinerja tinggi dengan kondisi sebagai berikut:
Kolom : Oktadesil Silan (C18) pada partikel 100 µm; 150 x
4,60 mm atau kolom lain yang sesuai.
Fase Gerak : larutan dapar natrium dihidrogen fosfat 2𝐻2 O 10
Mm ( pH 2,6 ) – asetonitril (82,5 : 17,5 )
Laju alir : 1,2 ml/menit
Detektor : Ultraviolet pada panjang gelombang 210 nm.
Volume penyuntikan : 20 µl

4. Perhitungan
Kadar aspartam dihitung menggunakan persamaan garis linear Y= bx + a.

F. Prosedur Miniaturisasi

1. Larutan Uji
Ditimbang seksama sejumlah 2 g sampel permen, dimasukkan kedalam
erlenmeyer, ditambah 25 ml fase gerak, kemudian disonifikasi 5 menit,
dimasukkan kedalam labu tentukur 50 ml dan ditambah fase gerak sampai tanda,
dikocok. Disaring dengan kertas saring, selanjutnya larutan disaring dengan
penyaring membran 0,45 µm dan dimasukkan ke vial. (A)

2. Larutan Baku
Baku induk (1000 ppm)
Sejumlah lebih kurang 50 mg aspartam baku, ditimbang seksama
dimasukkan kedalam labu tentukur 50 ml, ditambah 5 ml campuran larutan dapar
natrium dihidrogen fosfat : acetonitril, dikocok sampai larut dan diencerkan
dengan pelarut sampai tanda.
 Baku Seri (5 ppm, 10 ppm, 40 ppm, 50 ppm, 60 ppm, 80 ppm, 100 ppm,
120 ppm) larutan (B)
1. 2 ppm = pipet 0,1 ml larutan baku induk, kemudian dimasukkan kedalam
labu ukur 50 ml , di add menggunakan pelarut hingga tanda batas. Kocok
Homogen
2. 4 ppm = pipet 0,2 ml larutan baku induk, kemudian dimasukkan kedalam
labu ukur 50 ml, di add hingga tanda batas menggunakan pelarut. Kocok
homogen.
3. 10 ppm = pipet 0,5 ml larutan baku induk, kemudian dimasukkan kedalam
labu ukur 50 ml, di add hingga tanda batas menggunakan pelarut. Kocok
homogen.
4. 16 ppm = pipet 0,8 ml larutan baku induk, kemudian dimasukkan kedalam
labu ukur 50 ml, di add hingga tanda batas menggunakan pelarut. Kocok
homogen.
5. 20 ppm = pipet 1,0 ml larutan baku induk, kemudian dimasukkan kedalam
labu ukur 50 ml, di add hingga tanda batas menggunakan pelarut. Kocok
homogen.
6. 30 ppm = pipet 1,5 ml larutan baku induk, kemudian dimasukkan kedalam
labu ukur 50 ml, di add hingga tanda batas menggunakan pelarut. Kocok
homogen.
7. 40 ppm = pipet 2,0 ml larutan baku induk, kemudian dimasukkan kedalam
labu ukur 50 ml, di add hingga tanda batas menggunakan pelarut. Kocok
homogen.
8. 50 ppm = pipet 2,5 ml larutan baku induk, kemudian dimasukkan kedalam
labu ukur 50 ml, di add hingga tanda batas menggunakan pelarut. Kocok
homogen.
9. 60 ppm = pipet 3 ml larutan baku induk, kemudian dimasukkan kedalam
labu ukur 50 ml, di add hingga tanda batas menggunakan pelarut. Kocok
homogen

Kemudian semua baku seri disaring dengan penyaring membrane

0,45 µm dan dimasukkan ke vial.
C. Penetapan Kadar

Larutan A dan B disuntikkan secara terpisah dan dilakukan kromatografi

cair kinerja tinggi dengan kondisi sebagai berikut:
Kolom : Oktadesil Silan (C18) pada partikel 100 µm; 150 x
4,60 mm atau kolom lain yang sesuai.
Fase Gerak : Larutan dapar natrium dihidrogen fosfat 2𝐻2 O 10
Mm ( pH 2,6 ) – asetonitril (82,5 : 17,5 )
Laju alir : 1,2 ml/menit
Detektor : Ultraviolet pada panjang gelombang 210 nm.
Volume penyuntikan : 20 µl

D. Perhitungan
Kadar aspartam dihitung menggunakan persamaan garis linear Y= bx + a.

E. Langkah Kerja

` Larutan Uji
1. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan

2. Ditimbang sampel permen lebih kurang 2 g

3. Dimasukkan kedalam Erlenmeyer

4. Ditambahkan 25 ml campuran larutan dapar natrium dihidrogen fosfat :

Acetonitril (82,5: 17,5), disonifikasi selama 10 menit

5. Larutan sampel dimasukkan ke labu tentukur 50 ml,Adkan hingga tanda

batas, kocok homogen

6. Saring larutan sampel menggunakan kertas saring whatman dengan

wadah erlenmeyer 100ml

7. Saring sampel menggunakan penyaring membran 0,45 µm

dan dimasukkan ke vial

 Larutan Baku
1. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan

2. Dibuat baku induk ( 1000 ppm) dengan cara:

- Ditimbang ± 50 mg baku aspartam
- Dimasukkan kedalam labu tentukur 50 ml
- Ditambahkan 5 ml campuran larutan dapar natrium dihidrogen
fosfat : Acetonitril (82,5: 17,5), kedalam labu tentukur 50 ml

Kocok sampai larut, encerkan dengan campuran larutan dapar natrium

dihidrogen fosfat : Acetonitril (82,5: 17,5), sampai tanda

3. Dibuat baku seri (2 ppm, 4 ppm, 10 ppm, 16 ppm, 20 ppm, 30 ppm, 40

ppm, 50 ppm, 60 ppm) dengan cara:
- Dipipet 0,1 ; 0,2 ; 0,5 ; 0,8 ; 1 ; 1,5 ; 2,0 ; 2,5 ; 3,0 ml larutan baku
induk, Dimasukkan kedalam labu tentukur 50 ml Ditambahkan 25 ml
campuran larutan dapar natrium dihidrogen fosfat : acetonitril (82,5:
17,5), dikocok sampai larut dan diencerkan dengan pelarut sampai
tanda batas

2. Pembuatan Fase Gerak

Dibuat larutan dapar natrium dihidrogen fosfat dengan cara:

-Ditimbang 1,3799 g Natrium Dihidrogen Fosfat

-Dimasukkan kedalam labu tentukur 1000 ml

-Ditambahkan aquadest hingga tanda batas, kocok homogen

-Ditambahkan asam fosfat 10% dan

-Diukur pH hingga tercapai pH 2,6 dengan alat pH meter

 Dibuat fase gerak larutan dapar natrium dihidrogen fosfat :
asetonitril

-Diukur dapar natrium dihidrogen fosfat sebanyak 500 ml

-Kemudian disaring menggunakan kertas whatman dengan wadah

erlenmeyer

-Diukur 500 ml asetonitril dimasukkan kedalam erlenmeyer 500

ml.Larutan dapar natrium dihidrogen fosfat dan asetonitril didigesti
selama 10 menit.

4. Cara Penetapan

Dilakukan penyuntikkan larutan A dan B pada alat kromatografi cair kinerja

tinggi, dengan detektor ultraviolet pada panjang gelombang 210 nm

F. Persyaratan

Perka BPOM N0. 4 Tahun 2014 batas penggunaan maksimum 3000 (mg/kg)
kategori pangan kembang gula.

G. Data Percobaan

1. Uji Kesesuaian Sistem

Tabel Hasil Uji Kesesuaian Sistem
UKS Waktu Retensi Area Faktor Ikutan

UKS 1 4,163 1171750 1,279

UKS 2 4,165 1168103 1,282

UKS 3 4,173 1174599 1,281

UKS 4 4,167 1170594 1,282

UKS 5 4,165 1170799 1,280

UKS 6 4,181 1172263 1,281

UKS 7 4,166 1164856 1,283

 Mean 4,169 1170423 1,281

% RSD 0,153 0,268 0.089

Std. Dev 0,006 3139 0,001

Simpangan Baku Relatif

Tabel Perhitungan Presisi berdasarkan waktu retensi

Waktu
𝑋 − 𝑋̅
Keterangan Retensi d²
(d)
(X)

UKS 1 4,163 0,005 0,000025

UKS 2 4,165 0,003 0,000009
UKS 3 4,173 0,0045 0,00002025
UKS 4 4,167 0,0015 0,00000225
UKS 5 4,165 0,0035 0,00001225
UKS 6 4,181 0,0125 0,0001562
UKS 7 4,166 0,0025 0,00000625
∑ 29,18 0,0325 0,0002312
𝑋̅ 4,1685 0,004643 0,000033028

Simpangan Baku ( SD)

∑( 𝑋− ̅𝑋)
̅̅̅2
SD = √ 𝑛−1

Keterangan :
SD = StandarDeviasi
RSD = Rata – rata StandarDeviasi
∑( 𝑋 − ̅̅̅
𝑋)2 = Penjumlahan dari ( 𝑋 − ̅̅̅
𝑋)2
n = jumlah data
 0,0002312
=√ = 0,0062075
7−1

Simpangan Baku Relatif (RSD)

𝑆𝐷
RSD = x 100%
𝑋̅

SD = StandarDeviasi

0,0062075
= x 100% = 0,1489 %
4,1685

Keterangan: SBR : simpangan baku relatif.

Nilai SBR ≤ 2% maka sistem memenuhi persyaratan

Luas Area

Tabel Perhitungan Presisi berdasarkan Area

Keterangan Area (X) 𝑋 − 𝑋̅ d²

(d)
UKS 1 1171750 1326,5714 1759791,679
UKS 2 1168103 -2320,429 5384390,744
UKS 3 1174599 4175,571 17435393,18
UKS 4 1170594 170,571 29094,46604
UKS 5 1170799 375,571 141053,576
UKS 6 1172263 1839,571 3384021,464
UKS 7 1164856 -5567,429 30996265,67
∑ 8192964 0,02 59130010,78
𝑋̅ 1170423,429 0,0033 8447144,397

Simpangan Baku ( SD)

 ∑( 𝑋− ̅𝑋)
̅̅̅2
SD =√ 𝑛−1

Keterangan :
SD = StandarDeviasi
RSD = Rata – rata Standar Deviasi
∑( 𝑋 − ̅̅̅
𝑋)2 = Penjumlahan dari ( 𝑋 − ̅̅̅
𝑋)2
n = jumlah data

59130010,78
=√ 7−1

= 3139,2677

Simpangan Baku Relativ (RSD)

𝑆𝐷
RSD = x 100%
𝑋̅

SD = StandarDeviasi

3139,267717
=1170423,429 x 100%

= 0,2682%

Keterangan: SBR : simpangan baku relatif.

Nilai SBR ≤ 2% maka sistem memenuhi persyaratan.

2. Pembuatan Kurva Baku Linearitas

Data Baku
Nama Baku : Aspartam
Nomor Kontrol : 210366
Kadar Baku : 101,99 %
Kadar Air : 2,04 %
 Data Penimbangan Baku
Keterangan Bobot Bobot Wadah Bobot Sisa Bobot Sampel
Wadah + Isi
Baku 0,1164 gram 0,1664 gram - 0,05 gram
Aspartam

Perhitungan Baku
BAKU Konsentrasi Konsentrasi Baku Seri =
Baku Induk Pemipetan baku seri X Konsentrasi Baku
Intermediet atau Baku Induk ) X Kadar Baku
(101,99/100) X Kadar Air ((100-2,04)/100)
1 0,1 𝑚𝑙 101,99 100 − 2,04
𝑋 1000 𝑝𝑝𝑚 𝑋 ( )X
50 𝑚𝑙 100 100
= 1,998 𝑝𝑝𝑚

2 0,2 𝑚𝑙 101,99 100 − 2,04

𝑋 1000 𝑝𝑝𝑚 𝑋 ( )X
50 𝑚𝑙 100 100
= 3,996 𝑝𝑝𝑚
3 0,5 𝑚𝑙 101,99 100 − 2,04
𝑋 1000 𝑝𝑝𝑚 𝑋 ( )X
50𝑚𝑙 100 100
= 9,991 𝑝𝑝𝑚
4 50 𝑚𝑔 0,8 𝑚𝑙 101,99 100 − 2,04
𝑋 1000 𝑝𝑝𝑚 𝑋 ( )X
50 𝑚𝑙 50 𝑚𝑙 100 100
= 1000 ppm = 15,986 𝑝𝑝𝑚
5 1,0 𝑚𝑙 101,99 100 − 2,04
𝑋 1000 𝑝𝑝𝑚 𝑋 ( )X
50 𝑚𝑙 100 100
= 19,982 𝑝𝑝𝑚
6 1,5 𝑚𝑙 101,99 100 − 2,04
𝑋 1000 𝑝𝑝𝑚 𝑋 ( )X
50 𝑚𝑙 100 100
= 29,973 𝑝𝑝𝑚
7 2,0 𝑚𝑙 101,99 100 − 2,04
𝑋 1000 𝑝𝑝𝑚 𝑋 ( )X
50 𝑚𝑙 100 100
= 39,964 𝑝𝑝𝑚
 8 2,5 𝑚𝑙 101,99 100 − 2,04
𝑋 1000 𝑝𝑝𝑚 𝑋 ( )X
50 𝑚𝑙 100 100
= 49,955 𝑝𝑝𝑚

9 3,0 𝑚𝑙 101,99 100 − 2,04

𝑋 1000 𝑝𝑝𝑚 𝑋 ( )X
50 𝑚𝑙 100 100
= 59,946 𝑝𝑝𝑚

Data Waktu Retensi dan Luas Area Baku

Keterangan Waktu retensi Luas area Konsentrasi
Baku 1 4,290 81906 1,998 𝑝𝑝𝑚
Baku 2 4,185 157453 3,996 𝑝𝑝𝑚
Baku 3 4,141 386286 9,991 𝑝𝑝𝑚
Baku 4 4,109 628043 15,986 𝑝𝑝𝑚
Baku 5 4,055 774740 19,982 𝑝𝑝𝑚
Baku 6 4,015 1159787 29,973 𝑝𝑝𝑚
Baku 7 3,981 1531232 39,964 𝑝𝑝𝑚
Baku 8 3,917 1922788 49,955 𝑝𝑝𝑚
Baku 9 3,920 2315380 59,946 𝑝𝑝𝑚

Konsentrasi
Baku Area (Y) X.Y X² Y²
(X)

B1 1,998 81906 163648,188 3,992004 6708592836

B2 3,996 157453 629182,188 15,968016 24791447210
B3 9,991 386286 3859383,426 99,820081 149216873800
B4 15,986 628043 10039895,4 255,552196 394438009800
B5 19,982 774740 15480854,68 399,280324 600222067600
B6 29,973 1159787 34762295,75 898,380729 1345105885000
 B7 39,964 1531232 61194155,65 1597,121296 2344671438000
B8 49,955 1922788 96052874,54 2495,502025 3697113693000
B9 59,946 2315380 138797769,5 3593,522916 5360984544000
∑ 231,791 8957615 360980059,3 9359,139587 13923252550000
𝑋̅ 25,75455556 995290,5556 40108895,48 1039,904399 1547028061000

Persamaan Garis
Rumus Persamaan Garis
Y = a + bx
a = 𝑦̅ - b𝑥̅
∑𝒙∑𝒚
∑𝒙𝒚−( )
𝒏
b= 𝟐 𝟐 /𝒏
∑𝒙 −(∑𝒙)

Keterangan :
∑ 𝑥𝑦= Jumlah seluruh Area dikalikan Konsentrasi
∑ 𝑦= Jumlah seluruh Area
∑ 𝑥= Jumlah seluruh konsentrasi
X = Konsentrasi baku (mg/mL)
Y = Luas Area
𝑦̅ = Rata rata Area
𝑥̅ = Konsentrasi rata rata
n = Jumlah pengenceran
a = Intersep (Intercept)
b = Kemiringan (Slope)
r = Regresi

a. Perhitungan Kemiringan ( Slope )

360980059,3 − (231,791) (8957615)/9

𝑏=
9359,139587 − (231,791)2 /9

130280665,8
b= 3389,4654

b = 38436,9363

b. Perhitungan Intersep (Intercept)

̅ - b𝒙
𝒂 = 𝒚 ̅

𝑎 = 995290,5556 − (38436,93634 𝑋 25,75455556)

 = 5364,343075

c. Perhitungan Regresi

∑𝒙𝒚
r=
(√∑𝒙𝟐 ) ( √∑𝒚𝟐 )

360980059,3
𝑟=
√9359,139587 × √13923252550000

r = 0,9999882552

Jadi didapatkan hasil persamaan garis yaitu y= 38436,9363x +5364,343075

Pembuatan Kurva Baku Aspartam

𝒚+𝒂
𝑿=
𝒃

Keterangan :

X = Titik garis X
a = Intersep (Intercept)
b = Kemiringan (Slope)
y = Area Baku
81906 − 5364,343075
𝑋1 =
38436,93634

= 1,9913

157453 − 5364,343075
𝑋2 =
38436,93634

= 3,9568

386286 − 5364,343075
𝑋3 =
38436,93634

= 9,9103

628043 − 5364,343075
𝑋4 =
38436,93634
 = 16,2000

774740 − 5364,343075
𝑋5 =
38436,93634

= 20,0165

1159787 − 5364,343075
𝑋6 =
38436,93634

= 30,0342

1531232 − 5364,343075
𝑋7 =
38436,93634

= 39,6979

1922788 − 5364,343075
𝑋8 =
38436,93634

= 49,8849

2315380 − 5364,343075
𝑋9 =
38436,93634

= 60,0988

y = bx + a

y1 = 38436,93634 X (1,991356862) + 5364,343075

= 82136,6216

y2 = 38436,93634 X (3,9568) + 5364,343075

= 157792,9328

y3 = 38436,93634 X (9,910302256) + 5364,343075

 = 386286

y4 = 38436,93634 X (16,2000075) + 5364,343075

= 628043,0001

y5 = 38436,93634 X (20,01657078) + 5364,343075

= 774739

y6 = 38436,93634 X (30,03420061) + 5364,343075

= 1159787

y7 = 38436,93634 X (39,69795208) + 5364,343075

= 1531232

y8 = 38436,93634 X (49,88492423) + 5364,343075

= 1922788

y9 = 38436,93634 X (60,09884962) + 5364,343075

= 2315380

Titik Kurva

B1 = (1,9913; 82136,6216)
B2 = (3,9568; 157792,9328)
B3 = (9,9103; 386286)
B4 = (16,2000 ; 628043,0001)
B5 = (20,0165 ; 20,01657078)
B6 = (30,0342 ; 1159787)
B7 = (39,6979 ; 1531232)
B8 = (49,8849 ; 1922788)
B9 = (60,0988 ; 2315380)
 Setelah diketahui nilai sumbu X dan sumbu Y, dapat dibuat kurva baku
seperti pada gambar dibawah ini

KURVA KALIBRASI BAKU ASPARTAM

2500000

2000000
LUAS AREA (Y)

1500000
y = 38437x + 5364.3
R² = 1
1000000

500000

0
0 10 20 30 40 50 60 70
Konsentrasi (PPM)

3. Data Penimbangan Sampel

Tabel Penimbangan Sampel

Keterangan Bobot Bobot Wadah Bobot Sisa Bobot Sampel

Wadah
Sampel 50A 35,3837 gram 37,3989 gram
Sampel 50B 35,4333 gram 37,4456 gram
Sampel 56A 34,6832 gram 36,6947 gram
Sampel 56B 34,7742 gram 36,7810 gram
Sampel 72A 32,9754 gram 34,0998 gram
Sampel 72B 33,1098 gram 35,1231 gram
+ Isi
- 2,0152 gram
- 2,0123 gram
- 2,0115 gram
- 2,0068 gram
- 2,0244 gram
- 2,0133 gram

4. Perhitungan Kadar Aspartam Dalam Permen

Setelah didapat nilai a dan b dari persamaan garis selanjutnya dilakukan
perhitungan kadar aspartam sebagai berikut :

𝑦−𝑎 𝑝𝑒𝑛𝑔𝑒𝑛𝑐𝑒𝑟𝑎𝑛 𝑙𝑎𝑟𝑢𝑡𝑎𝑛 𝑢𝑗𝑖

kadar aspartam mg/kg (x) = 𝑥
𝑏 𝑝𝑒𝑛𝑖𝑚𝑏𝑎𝑛𝑔𝑎𝑛 𝑙𝑎𝑟𝑢𝑡𝑎𝑛 𝑢𝑗𝑖

y = Area Sampel
 a = Intersep (Intercept)
b = Kemiringan (Slope)

(236137 −536,343075) 50
Kadar Sampel 50A = 𝑥 = 152,08 mg/kg
38436,93634 2,0152

(237549 −536,343075) 50
Kadar Sampel 50B = 𝑥 = 153,21 mg/kg
38436,93634 2,0123

(161420 −536,343075) 50
Kadar Sampel 56A = 𝑥 = 104,04 mg/ kg
38436,93634 2,0115

(157801 −536,343075) 50
Kadar Sampel 56B = 𝑥 = 101,94 mg/kg
38436,93634 2,0068

(113169 −536,343075) 50
Kadar Sampel 72A = 𝑥 = 72,37 mg/kg
38436,93634 2,0244

(114103 −536,343075) 50
Kadar Sampel 72B = 𝑥 = 73.37 mg/kg
38436,93634 2,0133

Keterangan Waktu Luas Bobot Kadar

retensi Area penimbangan
Sampel 50A 4,155 236137 2,0152 152,08
mg/kg
Sampel 50B 4,142 237549 2,0123 153,21
mg/kg
Sampel 56A 4,009 161420 2,0115 104,04 mg/
kg
Sampel 56B 3,9965 157801 2,0068 101,94
mg/kg
Sampel 72A 3,789 113169 2,0244 72,37
mg/kg
Sampel 72B 3,798 114103 2,0133 73.37
mg/kg
H. Pembahasan
Berdasarkan hasil percobaan yang dilakukan diketahui bahwa ketiga sampel
mengandung Aspartam tidak melebihi batas persyaratan yang telah ditetapkan,
sehingga sampel aman untuk dikonsumsi.

I. Kesimpulan
Berdasarkan hasil percobaan yang telah dilakukan, disimpulkan bahwa sampel No.
50A Mengandung Aspartam sebesar 152,08 mg/kg, No.50B Mengandung
Aspartam sebesar 153,21 mg/kg, No.56A Mengandung Aspartam sebesar 104,04
mg/ kg, No.56B Mengandung Aspartam sebesar 101,94 mg/kg, No.72A
Mengandung Aspartam sebesar 72,37 mg/kg dan sampel No.72B Mengandung
Aspartam sebesar 73.37 mg/kg