Penetapan Kadar Siklamat dalam Pangan secara KCKT

Tanggal Percobaan

Rabu – Kamis, 18 Februari – 25 Februari 2019

Pustaka

i. Anonim, 2011. Laporan Penelitian dan Pengembangan Metode

Analisis Pangan. PPOMN Badan POM RI, Jakarta (tidak
dipublikasikan)
ii. Serdar, M. & Z. Knezevic. 2011. Determination of Artificial
Sweeteners in Beverages and Special Nutrition Products Using High
Performance Liquid Chromatogh.

Ruang Lingkup

Metode ini digunakan untuk penetapan kadar siklamat dalam marmalade, saos,
dan softcake dan produk makanan lainnya secara KCKT

Prinsip

Siklamat diderivatisasi menjadi N,N-dikloro-sikloheksilamin dengan

menggunakan natrium hipoklorit dalam suasana asam dan ditepatkan secara
KCKT menggunakan detektor UV pada panjang gelombang 314 nm.

Peralatan

Seperangkat alat KCKT yang dilengkapi dengan detektor UV-Vis, tabung

sentrifuga 50 mL, corong pisah 250 mL, labu tantukur, gelas ukur bertutup, pipet
volumetrik, neraca analitik dan peralatan gelas lainnya.

Pereaksi

1. Larutan Carez I (15 g kalium heksasianoferrat (II) K4(Fe(CN)6) dalam

100 mL)
 2. Larutan Carez II (30 g seng sulfat (ZnSO4) / seng asetat (Zn(CH3COO)2)
dalam 100 mL)
3. Larutan H2SO4 6 N (ke dalam gelas piala yang berisi 200 mL Aquadest,
ditambahkan 40 mL H2SO4 pekat, kadar 95 – 97 %. Diaduk hingga
homogen
4. Larutan NaHCO3 1 % (ditimbang 10 g natrium bikarbonat, dimasukkan
ke dalam gelas piala bertutup 1 L, dilarutkan dan diencerkan dengan
Aquadest hingga tanda.
5. Larutan NaCIO 3 % (dibuat segar) (ditimbang 3 g natrium hipoklorit,
diencerkan dengan aquades hingga 100 mL

Prosedur

1. Larutan Uji
Ditimbang seksama lebih kurang 2 g sampel makanan, dimasukkan dalam
tabung sentrifuga 50 mL, ditambahkan 0,5 mL larutan Carez I, 0,5 mL
larutan Carez II, dan 20 mL Aquadest. Dihomogenkan dengan alat vortex
selama 1 menit, kemudian disentrifugasi pada laju 6000 rpm selama 10
menit pada suhu 5 ˚C. Dipipet 5 mL supernatan dan dimasukkan ke dalam
corong pisah 250 mL. Ditambahkan secara berturut-turut ke dalam corong
pisah 40 mL Aquadest, 5 mL larutan H2SO4 6 N, 10 mL sikloheksan dan 2
mL larutan NaCIO 3 % melalui dinding corong pisah secara perlahan.
Diekstraksi dengan cara mengocok kuat corong pisah selama 1 menit.
Setelah ke dua fase terpisah, fase pada lapisan bawah (fase Aquadest)
dibuang. Ditambahkan 25 mL larutan NaHCO3 1 % ke dalam corong pisah
dan dikocok selama 1 menit. Setelah kedua fase memisah, fase pada
lapisan bawah (fase Aquadest) dibuang. Ditambahkan 25 mL Aquadest ke
dalam corong pisah dan dikocok selama 1 menit. Setelah kedua fase
memisah, fase pada lapisan bawah (fase Aquadest) dibuang. Ditambahkan
100 mg Natrium Sulfat Anhidrat ke dalam corong pisah untuk menyerap
Aquadest yang tersisa. Corong pisah dikocok dan lapisan jernih disaring
ke dalam vial meggunakan saringan 0,45 µm. (Larutan A)
 2. Larutan Baku

a. Larutan Baku Induk

Ditimbang seksama Natrium Siklamat yang setara dengan 100 mg

Siklamat, dimasukkan ke dalam labu ukur 50 mL, dilarutkan dan
diencerkan hingga tanda dengan Aquadest
b. Larutan Baku Kerja

Dipipet 10 mL larutan baku induk, dimasukkan ke dalam corong pisah

250 mL, ditambahkan 5 g sampel bebas siklamat (blangko sampel),
diperlakukan seperti larutan uji dengan penambahan 20 mL
sikloheksan. Larutan baku kerja dibuat dengan cara dipipet 0,5 mL, 1,0
mL, 2,0 mL, 4,0 mL, 8,0 mL lapisan jernih hasil derivatisasi (lapisan
sikloheksan) ke dalam labu tantukur 10 mL dan diencerkan hingga
tanda dengan sikloheksan (larutan B)
3. Larutan Blangko

Larutan blangko dibuat dengan cara yang sama seperti larutan uji tanpa
sampel. (larutan C)

Cara Penetapan

Larutan C, B, A disuntikkan secara terpisah ke dalam Kromatografi Cair Kinerja

Tinggi dengan kondisi sebagai berikut :

Fase gerak : Metanol : Aquadest (90 : 10)

Kolom : C18 (25 cm x 4,6 mm) ukuran partikel 5µm

Detektor : UV, pada panjang gelombang 314 nm

Laju alir : 1,2 mL / menit

Volume penyuntikkan : 20 µL
Prosedur Miniaturisasi

Larutan Baku

a. Larutan Baku Induk

Ditimbang seksama Natrium Siklamat yang setara dengan 50 mg

Siklamat, dimasukkan ke dalam corong pisah , diperlakukan seperti
larutan uji dengan penambahan 20 mL sikloheksan.
b. Larutan Baku Kerja

Larutan baku kerja dibuat dengan cara dipipet 0,125 mL mL lapisan

jernih hasil derivatisasi (lapisan sikloheksan) ke dalam labu tantukur 5
mL dan diencerkan hingga tanda dengan sikloheksan, dan 0,125 mL,
0,25 mL, 0,5 mL, 1 mL, 2 mL, 2,5 mL dan 3 mL lapisan jernih hasil
derivatisasi (lapisan sikloheksan) ke dalam labu tantukur 10 mL dan
diencerkan hingga tanda dengan sikloheksan (larutan B)

Langkah kerja

Larutan uji

1. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan

2. Dilakukan organoleptik dan dihomogenkan
3. Ditimbang sampel sejumlah seksama kurang lebih 2 g dengan wadah
tabung sentrifus 50 mL
4. Ditambahkan masing-masing 0,5 mL larutan carez I dan carez II, dan 20
mL aquades
5. Dilakukan homogenisasi dengan vortex selama 1 menit
6. Dilakukan sentrifus pada sampel dengan kecepatan 6000 rpm, dengan
suhu 5 ˚C selama 10 menit
7. Dilakukan proses ekstraksi sampel dengan cara :
a. Dipipet 5,0 mLsupernatan ke dalam corong pisah 250 mL
 b. Ditambahkan 40 mL aquades, 5 mL H2SO4 6 N, 10,0 mL
sikloheksan dengan menggunakan pipet volume, dan 2 mL NaCIO
3%
c. Diekstraksi kuat selama 1 menit hingga terjadi dua fase
d. Fase aquades dibuang, ditambahkan 25 mL NaHCO3 1 %
e. Diekstraksi kuat selama 1 menit hingga terjadi 2 fase
f. Fase aquades dibuang, ditambahkan 25 mL aquades ke dalam
corong pisah
g. Diekstraksi kuat selama 1 menit hingga terjadi dua fase
h. Fase aquaades dibuang, fase sikloheksan disaring dengan
menggunaka natrium sulfat anhidrat hingga sampel bebas dari air,
dimasukkan ke dalam tabung reaksi bertutup
8. Disaring sampel dalam sikloheksan dengan menggunakan membran filter
berukuran 0,45 µm dengan wadah vial
9. Dilakukan pengukuran pada alat KCKT

Larutan baku

1. Ditimbang secara seksama kurang lebih 50 mg baku siklamat, dimasukkan

ke dalam corong pisah.
2. Dilakukan langkah ekstraksi yang sama dengan larutan uji namun berbeda
dengan banyaknya jumlah larutan pereaksi yang digunakan :
a. Ditambahkan 40 mL aquades, 50 mL H2SO4 6 N, 25,0 mL
sikloheksan dengan menggunakan pipet volume, dan 2 mL NaCIO
3%
b. Diekstraksi kuat selama 1 menit hingga terjadi dua fase
c. Fase aquades dibuang, ditambahkan 25 mL NaHCO3 1 %
d. Diekstraksi kuat selama 1 menit hingga terjadi 2 fase
e. Fase aquades dibuang, ditambahkan 25 mL aquades ke dalam
corong pisah
 f. Diekstraksi kuat selama 1 menit hingga terjadi dua fase
g. Fase aquades dibuang, fase sikloheksan disaring dengan
menggunaka natrium sulfat anhidrat hingga sampel bebas dari air,
dimasukkan ke dalam erlenmeyer 50 mL.
h. Dilakukan pembuatan baku kerja dengan cara dipipet 0,125 mL ad
10 mL, dipipet 0,125 mL ad 5 mL, dipipet 0,25 mL ad 5 mL,
dipipet 0,5 mL ad 5 mL, dipipet 1,0 mL ad 5mL, dipipet 2,0 mL ad
5 mL, dipipet 2,5 mL ad 5 mL, dipipet 3,0 mL ad 5 mL dengan
sikloheksan
3. Dilakukan pengukurn dengan alat KCKT

Data percobaan

1. Uji Kesesuaian Sistem

Tabel Hasil Uji Kesesuaian Sistem

UKS Waktu Retensi Area Faktor Ikutan

UKS 1 4,136 2310207 1,128

UKS 2 4,139 2306617 1,098

UKS 3 4,141 2312446 1,120

UKS 4 4,136 2308094 1,135

UKS 5 4,137 2308146 1,121

UKS 6 4,14 2313231 1,125

Mean 4,138 2309790 1,121

% RSD 0,054 0,114 1,131

Std. Dev 0,02 2635 0,013

Simpangan Baku Relatif

Tabel Perhitungan Presisi berdasarkan waktu retensi

Waktu
𝑋 − 𝑋̅
Keterangan Retensi d²
(d)
(X)

UKS 1 4,136 0,0021 0,00000441

UKS 2 4,139 0,001 0,000001

UKS 3 4,141 0,0029 0,00000841

UKS 4 4,136 0,0021 0,00000441

UKS 5 4,137 0,0011 0,00000121

UKS 6 4,14 0,0019 0,00000361

∑ 24,829 0,0111 0,00002305

𝑋̅ 4,1381 0,00185 0,00000384

Simpangan Baku ( SD)

∑( 𝑋− ̅𝑋)
̅̅̅2
SD = √ 𝑛−1

Keterangan :
SD = Standar Deviasi
RSD = Rata – rata StandarDeviasi
̅̅̅2
∑( 𝑋 − 𝑋) ̅̅̅2
= Penjumlahan dari ( 𝑋 − 𝑋)
n = jumlah data

0,00002305
SD =√ = 0,00214709
6−1

Simpangan Baku Relatif (RSD)

 𝑆𝐷
RSD = x 100%
𝑋̅

SD = StandarDeviasi

𝟎,𝟎𝟎𝟐𝟏𝟒𝟕𝟎𝟗
= x 100% = 0,052 %
𝟒,𝟏𝟔𝟖𝟓

Keterangan: SBR : simpangan baku relatif.

Persyaratan %RSD dalam Farmakope Indonesia edisi IV halaman 1537-
1538 tidak boleh lebih dari 2%

Nilai SBR ≤ 2% maka sistem memenuhi persyaratan

Luas Area

Tabel Perhitungan Presisi berdasarkan Area

𝑋 − 𝑋̅ |𝑋 − 𝑋|2
Keterangan Area (X)
(d) (d²)

UKS 1 2310207 416,833 173750,028

UKS 2 2306617 -3173,167 10068986,7

UKS 3 2312446 2655,833 7053450,69

UKS 4 2308094 -1696,167 2876981,36

UKS 5 2308146 -1644,167 2703284,03

UKS 6 2313231 3440,833 11839334

∑ 13858741 -0,02 34715786,8

𝑋̅ 2309790 -0,00033 5785964,47

 Simpangan Baku ( SD)

∑( 𝑋− ̅𝑋)
̅̅̅2
SD =√ 𝑛−1

Keterangan :
SD = StandarDeviasi
RSD = Rata – rata Standar Deviasi
∑( 𝑋 − ̅̅̅
𝑋)2 = Penjumlahan dari ( 𝑋 − ̅̅̅
𝑋)2
n = jumlah data

34715786,8
=√ 6−1

= 2634,9871

Simpangan Baku Relativ (RSD)

𝑆𝐷
RSD = x 100%
𝑋̅

SD = StandarDeviasi

2634,9871
= 2309790 x 100%

= 0,1140%

Keterangan: SBR : simpangan baku relatif.

Persyaratan %RSD dalam Farmakope Indonesia edisi IV halaman 1537-

1538 tidak boleh lebih dari 2%

Nilai SBR ≤ 2% maka sistem memenuhi persyaratan.

1. Pembuatan Kurva Baku Linearitas

 Bobot
Nama No. BW + BW + Kemurnian Kadar
BW Sampel
baku Kontrol Baku Sisa baku (%) air (%)
(mg)
Siklamat
B0315244 49,6 99,74 0,11
Na.

Perhitungan Baku
BAKU Konsentrasi Konsentrasi Baku Seri =
Baku Induk Pemipetan baku seri X Konsentrasi Baku
Intermediet atau Baku Induk ) X Kadar Baku
(101,99/100) X Kadar Air ((100-2,04)/100)
1 0,125 𝑚𝑙 99,74 100 − 0,11
𝑋 2480 𝑝𝑝𝑚 𝑋 ( )X
10 𝑚𝑙 100 100
= 30,8854 𝑝𝑝𝑚

2 0,125 𝑚𝑙 99,74 100 − 0,11

𝑋 2480 𝑝𝑝𝑚 𝑋 ( )X
5 𝑚𝑙 100 100
= 61,7708 𝑝𝑝𝑚
3 0,25 𝑚𝑙 99,74 100 − 0,11
𝑋 2480 𝑝𝑝𝑚 𝑋 ( )X
5 𝑚𝑙 100 100
= 123,5416 𝑝𝑝𝑚

4 49,6 𝑚𝑔 0,5 𝑚𝑙 99,74 100 − 0,11

𝑋 2480 𝑝𝑝𝑚 𝑋 ( )X
20 𝑚𝑙 5 𝑚𝑙 100 100
= 247,0831 𝑝𝑝𝑚
= 2480 ppm
5 1 𝑚𝑙 99,74 100 − 0,11
𝑋 2480 𝑝𝑝𝑚 𝑋 ( )X
5 𝑚𝑙 100 100
= 494,1662 𝑝𝑝𝑚

6 2 𝑚𝑙 99,74 100 − 0,11

𝑋 2480 𝑝𝑝𝑚 𝑋 ( )X
5 𝑚𝑙 100 100
= 988,3324 𝑝𝑝𝑚
7 2,5 𝑚𝑙 99,74 100 − 0,11
𝑋 2480 𝑝𝑝𝑚 𝑋 ( )X
5 𝑚𝑙 100 100
= 1235,4156 𝑝𝑝𝑚
 8 0,3 𝑚𝑙 99,74 100 − 0,11
𝑋 2480 𝑝𝑝𝑚 𝑋 ( )X
5 𝑚𝑙 100 100
= 1482,4987 𝑝𝑝𝑚

Data Waktu Retensi dan Luas Area Baku

Keterangan Waktu retensi Luas area Konsentrasi
Baku 1 4,290 81906 1,998 𝑝𝑝𝑚
Baku 2 4,185 157453 3,996 𝑝𝑝𝑚
Baku 3 4,141 386286 9,991 𝑝𝑝𝑚
Baku 4 4,109 628043 15,986 𝑝𝑝𝑚
Baku 5 4,055 774740 19,982 𝑝𝑝𝑚
Baku 6 4,015 1159787 29,973 𝑝𝑝𝑚
Baku 7 3,981 1531232 39,964 𝑝𝑝𝑚
Baku 8 3,917 1922788 49,955 𝑝𝑝𝑚
Baku 9 3,920 2315380 59,946 𝑝𝑝𝑚

Konsentrasi
Baku Area (Y) X.Y X² Y²
(X)

30,8854 29478 910439,8212 953,9079332 868952484

B1
61,7708 92691 573912,5028 3815,631733 8591621481
B2
123,5416 208036 25701100,3 15262,52693 43278977300
B3
247,0831 469027 115888645,1 61050,05831 219986326700
B4
494,1662 995504 491944428,8 244200,2332 991028214000
B5
988,3324 1800394 1779387723 976800,9329 3241418555000
B6
 1235,4156 2311863 2856111615 1526251,705 5344710531000
B7
1482,4987 2698418 4000401177 2197802,396 7281459703000
B8

∑ 4663,6924 8605411 9276070727 5026137 17131342880965

582,96155 1075676,375 1159508841 628267,125 2141417860121

𝑋̅

Persamaan Garis
Rumus Persamaan Garis
Y = a + bx
a = 𝑦̅ - b𝑥̅
∑𝒙∑𝒚
∑𝒙𝒚−( )
𝒏
b= ∑𝒙𝟐 −(∑𝒙)𝟐 /𝒏

Keterangan :
∑ 𝑥𝑦= Jumlah seluruh Area dikalikan Konsentrasi
∑ 𝑦 = Jumlah seluruh Area
∑ 𝑥 = Jumlah seluruh konsentrasi
X = Konsentrasi baku (mg/mL)
Y = Luas Area
𝑦̅ = Rata rata Area
𝑥̅ = Konsentrasi rata rata
n = Jumlah pengenceran
a = Intersep (Intercept)
b = Kemiringan (Slope)
r = Regresi

a. Perhitungan Kemiringan ( Slope )

4663,6924 x 8605411)
9276070726 − (
𝑏= 8
(4663,6924)²
5026137 − ( )
8

4259446992
b=𝑏= = 1846,007
2307383,65

b. Perhitungan Intersep (Intercept)

̅ - b𝒙
𝒂 = 𝒚 ̅
 𝑎 = 1075676,375 − (1846,007 𝑥 582,96155) = −474,726

c. Perhitungan Regresi

∑𝒙𝒚
r=
(√∑𝒙𝟐 ) ( √∑𝒚𝟐 )

9276070727
= 9279249771 = 0,9996574

Jadi Didapat Persamaan Garis yaitu y = 1846x – 474,726

Pembuatan Kurva Baku Aspartam

𝒚+𝒂
𝑿=
𝒃

Keterangan :

X = Titik garis X
a = Intersep (Intercept)
b = Kemiringan (Slope)
y = Area Baku
29478 − 474,726
𝑋1 =
1846

= 15,7114

92691 − 474,726
𝑋2 =
1846

= 49,9546

208036 − 474,726
𝑋3 =
1846

= 112,4383

469027 − 474,726
𝑋4 =
1846
 = 253,8203

995504 − 474,726
𝑋5 =
1846

= 539,0191

1800394 − 474,726
𝑋6 =
1846

= 975,0375

2311863 − 474,726
𝑋7 =
1846

= 1252,1063

2698418 − 474,726
𝑋8 =
38436,93634

= 1461,5077

y = bx + a

y1 = 1846 X (15,7114) - 474,726

= 28528,5184

y2 = 1846 X (49,9546) - 474,726

= 91741,4656

y3 = 1846 X (112,4383) - 474,726

= 207086,37

y4 = 1846 X (253,8203) - 474,726

= 468077

y5 = 1846 X (539,0191) - 474,726

= 994554,5326
y6 = 1846 X (975,0375) - 474,726

= 1799444,499

y7 = 1846 X (1252,1063) - 474,726

= 2310913,504

y8 = 1846 X (1461,5077) - 474,726

= 2697468

Titik Kurva

B1 = (15,7114; 28528,5184)
B2 = (49,9546; 91741,4656)
B3 = (112,4383; 207086,37)
B4 = (253,8203; 468077)
B5 = (539,0191; 994554,5326)
B6 = (975,0375; 1799444,499)
B7 = (1252,1063; 2310913,504)
B8 = (1461,5077; 2697468)

Setelah diketahui nilai sumbu X dan sumbu Y, dapat dibuat kurva baku
seperti pada gambar dibawah ini

KURVA KALIBRASI BAKU SIKLAMAT

3000000

2500000

2000000
AREA (Y)

y = 1846x - 475.41
1500000 R² = 0.9985

1000000

500000

0
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
Konsentrasi ()PPM
2. Data Penimbangan Sampel
Tabel Penimbangan Sampel

Nama Sampel BW BW + Sampel Bobot Sampel

91 A (Permen) 10,2811 12,4102 2,1291
91 B (Permen) 10,8544 12,8961 2,0417
92 A (Kacarng) 10,6231 12,6928 2,0697
92 B (Kacang) 10,8733 12,9703 2,0970
104 A (Permen) 10,2770 12,3041 2,0271
104 B (Permen) 10,6216 12,6496 2,0280
105 A (Permen) 10,9051 12,9703 2,0652
105 B (Permen) 10,7008 12,7047 2,0039
106 A (Permen) 10,0053 12,0091 2,0038
106 B (Permen) 10,5662 12,5937 2,0275

3. Perhitungan Kadar Siklamat

Setelah didapat nilai a dan b dari persamaan garis selanjutnya dilakukan
perhitungan kadar aspartam sebagai berikut :
𝑦−𝑎 𝑝𝑒𝑛𝑔𝑒𝑛𝑐𝑒𝑟𝑎𝑛 𝑙𝑎𝑟𝑢𝑡𝑎𝑛 𝑢𝑗𝑖
kadar siklamat mg/kg (x) = 𝑥
𝑏 𝑝𝑒𝑛𝑖𝑚𝑏𝑎𝑛𝑔𝑎𝑛 𝑙𝑎𝑟𝑢𝑡𝑎𝑛 𝑢𝑗𝑖

y = Area Sampel
a = Intersep (Intercept)
b = Kemiringan (Slope)

Perhitungan Kadar Siklamat

Sampel (92 A)

(78198−(−474,726) 10 𝑚𝑔
Kadar Sampel 92A = 𝑥 = 205,9128 𝑘𝑔
1846,007 2,0697

Sampel (92 B )

79411− (−474,726) 10 𝑚𝑔
Kadar Sampel 92B = 𝑥 = 206,3652 𝑘𝑔
1846,007 2,0970
 205,9128 + 206,3652 𝑚𝑔
Rata − rata kadar Sampel 92 = = 206,139
2 𝑘𝑔

Tabel Hasil Perhitungan

Keterangan Waktu Luas Bobot Kadar Kadar

retensi Area penimbangan rata-
rata
91 A 0 0 2,1291 g 0 mg/kg 0
mg/kg
91 B 0 0 2,0417 g 0 mg/kg

92 A 4.112 78198 2,0697 g 205,9128

92 B 4,113 79411 2,0970 g 206,3652

104 A 0 0 2,0271 g 0 mg/kg 0

mg/kg
104 B 0 0 2,0280 g 0 mg/kg

105 A 0 0 2,0652 g 0 mg/kg 0

mg/kg
105 B 0 0 2,0039 g 0 mg/kg

106 A 0 0 2,0038 g 0 mg/kg 0

mg/kg
106 B 0 0 2,0275 g 0 mg/kg

Persyaratan

Kategori Pangan Batas Maksimum (mg /kg)

Kembang gula / permen meliputi 500
kembang gula / permen keras dan
lunak, nougat, dan lain-lain
 Kacang olahan, termasuk kacang yang Negatif
dilapis dan kacang campur
(misalnya dengan: buah kering)
(Persyaratan berdasarkan SNI No. 01-6993-2004 tentang bahan tambahan pangan
pemanis buatan)

Kesimpulan

Dari pengukuran yang telah dilakukan didapat kadar rata-rata sampel 92 yaitu
206,139 mg/kg Sehingga dapat dikatakan “Tidak Memenuhi Syarat” dikarenakan
kadar yang diperoleh lebih dari 0 mg/kg sesuai dengan persyaratan untuk Kacang
Olahan.

Pembahasan

Pada percobaan yang telah dilakukan saat di deteksi menggunakan KCKT, puncak
dan area pada sampel 91,104,105,106 tidak muncul,sehingga dapat dikatakan
sampel 91,104,105,106 tidak mengandung Siklamat. dan untuk sampel 92
(Kacang) didapat kadar rata-rata sampel 92 yaitu 206,139 mg/kg. Untuk sampel
92 (Kacang) dikatakan “Tidak Memenuhi Syarat” dikarenakan kadar yang
diperoleh lebih dari 0 mg/kg sesuai dengan persyaratan untuk Kacang Olahan.