LAPORAN PRAKTIKUM IV

BIOFARMASETIKA-FAMAKOKINETIKA

ANALISIS OBAT DALAM MATRIK BIOLOGI

NAMA : RAHYU LESTARI

NIM : 1601112

HARI / JAM PRAKTIKUM : RABU (10.00-13.00)

DOSEN : apt. Dr. GRESSY NOVITA, M.Farm

ASISTEN : 1). DHEA ANANDA

: 2). YULINDA ANGGRAINI

SEKOLAH TINGGI ILMU FARMASI RIAU

YAYASAN UNIV RIAU

PEKANBARU

2020
 ANALISIS OBAT DALAM MATRIK BIOLOGI

I. Tujuan

1. Memahami prinsip dan prosedur analisis obat dalam matrik biologi

II. Tinjauan pustaka

Kegiatan analisis obat semakin dikenal secara luas dan bahkan mulai dilakukan secara
rutin dengan metode yang sistematis. Hal ini juga didukung oleh perkembangan yang pesat
dari instrument analisis yang mampu mendeteksi kadar obat dalam konsentrasi yang sangat
rendah (mikro atau nanogram per mililiter) yang terdapat dalam matrik biologi.

Intensitas efek farmakologi suatu obat sering kali dikaitkan dengan dosis obat yang
dikonsumsi, namun sebenarnya konsentrasi obat bebas yang berikatan dengan reseptorlah
yang menentukan besarnya efek farmakologi yang diberikan oleh suatu obat. Reseptor
sebagian besar terdapat dalam sel sel jaringan, oleh karena sebagian besar sel sel jaringan
diperfusi oleh darah, maka pemeriksaan kadar obat dalam darah merupakan suatu metode
yang paling tepat untuk pemantauan pengobatan dan pengoptimalan manfaat terapi obat
dalam pelayanan farmasi.

Analisis obat pada umumnya dilakukan terhadap cairan biologis tubuh seperti plasma
atau serum, sebab terdapat hubungan yang baik antara konsentrasi obat dalam darah dengan
efek terapi yang ditimbulkan. Metode analisis yang digunakan untuk menentukan kadar obat
mempunyai peran yang penting dalam hal evaluasi, interpretasi bioavaibilitas dan
bioekivalensinya.

Untuk menetapkan kadar obat dalam plasma, diperlukan suatu metode analisis yang
tepat dengan tingkat selektivitas dan sensitivitas yang tinggi, gangguan yang sedikit mungkin,
dan nilai akurasi serta presisi yang tinggi. Untuk memperoleh hal tersebut, maka metode
analisis yang akan digunakan harus divalidasi terlebih dahulu. Metode validasi pada analisis
kimia terdiri dari beberapa seri percobaan laboratorium yang tujuannya adalah untuk
memastikan bahwa metode analisis yang akan divalidasi, parameternya harus memenuhi
persyaratan yang telah ditetapkan.

Suatu metode analisis baru dapat dipakai atau digunakan bila telah dilakukan validasi
yang kondisinya disesuaikan dengan laboratorium dan peralatan yang tersedia, meskipun
metode yang akan dipakai tersebut telah dipublikasikan pada jurnal, buku teks atau buku
resmi seperti farmakope (3). Hal ini dikarenakan adanya perbedaan dan keterbatasan alat,
bahan kimia atau kondisi lain yang menyebabkan metode tersebut tidak dapat diterapkan
secara keseluruhan. Sehingga sering dilakukan modifikasi, penyederhanaan maupun
perbaikan metode, akibatnya metode tersebut harus divalidasi dengan cara yang benar.
Apabila metode ini dapat dipertanggungjawabkan secara keseluruhan (presisi, akurasi,
selektivitas, batas deteksi, batas kuantitasi, stabilitas dan lain lain), tidak menyimpang dan
diakui oleh pihak yang berkompeten, maka metode yang dimodifikasi ini dianggap valid dan
dapat digunakan untuk analisis rutin.

Untuk memperoleh kadar obat total dalam plasma diperlukan perlakuan khusus
terhadap sampel plasma sebelum diinjeksikan, yang meliputi isolasi dari substansi matriks,
pembebasan obat dari ikatannya dengan protein dan pemisahan obat dari komponen lain atau
metabolit. Upaya upaya yang bisa dilakukan untuk mencapai tujuan diatas diantaranya adalah
dengan cara pengendapan protein, ultrafiltrasi, ekstraksi cair cair dan ekstraksi fase padat.

Analisis obat dalam matrik biologi diperlukan dalm studi farmakologi, farmakokinetik
dan pengembangan penggunaan obat. Pada tahap farmakokinetik penelitian meliputi aspek
absorbsi, biotransformasi, distribusi, biotransformasi dan eliminasi. Analisis obat dalam
cairan biologi ditujukan untuk memonitor penampilan sediaan obat yang ada dalam
perdagangan yang meliputi studi ketersediaan hayati, konfirmasi respon biologi,
mengkorelasikan level plasma obat dengan respon farmakologik, membuktikan adanya racun
atau keracunan serta monitoring obat pada kasus overdosis.

Agar hasil analisis dapat dipercaya, maka metode penetapan kadar harus memenuhi
kriteria antara lain perolehan kembali yang tinggi (75% - 90% atau lebih), kesalahan acak dan
sistematis kecil dari 10%, disamping itu perlu juga diperhatikan kepekaan dan selektivitas
yang nilainya tergantung kepada alat yang digunakan.

Untuk mendapatkan hasil analisis yang optimal, percobaan berikut perlu dilakukan :

1. Khusus untuk reaksi warna perlu penetapan jangka waktu larutan obat yang memberikan
respon tetap.

2. Penetapan jangka panjang gelombang larutan obat yang memberikan respon maksimum

3. Pembuatan kurva baku

4. Perhitungan nilai perolehan kembali, kesalahan acak dan kesalahan sistematik

Dalam percobaan ini akan dilakukan penetapan kadar theophillin dalam plasma secara in
vitro.

III. Alat dan bahan

Bahan :

-NaoH 0,1 N

-Alkohol 70%

-Heparin

-HCl 0,1 N

-Kloroform

-Isopropil alcohol

-Plasma kelinci/manusia

Alat

-Labu ukur 100 ml

-Pipet volume 0,1; 0,2; 1 dan 2 ml

-pH meter

- Alat suntik

-Termostat

-Vial

-Sentrifuge

-Lemari pendingin

-Pipet ukur 1 ml dan 5 ml

-Kuvet, spektrofotometer

-Kalkulator fx 3600

-Stop watch, kertas grafik semilog

IV. Cara kerja

a. Penentuan panjang gelombang serapan maksimal teofilin dalam NaoH 0,1N

- Buat larutan induk teofilin 50 mg/50 ml dalam NaOH 0,1 N

- Dari larutan induk tersebut diencerkan sehingga didapat larutan dengan konsentrasi 3,5
μg/ml

- Ukur serapan larutan pada panjang gelombang 200 sampai 400 nm menggunakan
spektrofotometer UV

- Tentukan panjang gelombang serapan maksimum teofilin

b. Pembuatan kurva kalibrasi teofilin dalam NaOH 0,1N

- Dari larutan induk teofilin dibuat satu deret larutan dengan konsentrasi 3,5 ; 5,5 ; 7,5 ; 9,5 ;
11,5 ; 13,5 μg/ml

- Ukur serapan masing- masing larutan tersebut pada panjang gelombang serapan maksimum

- Tentukan persamaan regresi

c. Penetapan kadar dilakukan berdasarkan metode Schack dan Waxler yang

dimodifikasikan oleh Jenne dkk serta Zudema

- Timbang 50 mg theopilin larutkan dalam 50 ml NaOH

- Dengan menggunakan larutan induk di atas , di buat satu seri larutan dalam plasma masing-
masing dengan kadar 2,5 ; 5,0 ; 7,5 ; 10 ; 12,5 ; dan 15 μg/ml sebanyak 10 ml

- 2 ml larutan obat dalam plasma ditambahkan kedalam 0,4 ml HCl 0,1N dan 20 ml campuran
kloroform-isopropil alkohol (2 : 1). Campuran dikocok 1 menit menggunakan corong pisah,
ambil lapisan organik pada bagian bawah, lalu saring

- Filtrat yang diperoleh dipipet sebanyak 5 ml dan dimasukkan kedalam tabung sentrifugasi,
kemudian ditambahkan 2 ml NaOH 0,1N, dikocok selama 1 menit dan disentrifugasi selama
10 menit dengan kecepatan 1500 rpm. Lapisan NaOH diambil (bagian atas)

- Nilai Absorbansi larutan diamati dengan spektrofotometer pada panjang gelombang

maksimum

- Buat kurva konsentrasi versus serapan

V. Hasil dan Pembahasan

a. Hasil Percobaan IV

Kurva Kalibrasi Teofilin dalam NaOH 0,1 N

Konsentrasi
Absorban
(ppm)
3,5 0,205
5,5 0,282
7,5 0,338
9,5 0,558
11,5 0,675
13,5 0,753

Absorban
0.8
0.7 f(x) = 0.06 x − 0.03
R² = 0.97
0.6
0.5 Absorban
Linear (Absorban)
0.4
0.3
0.2
0.1
0
2 4 6 8 10 12 14 16

Penetapan kadar teofilin dalam matrik biologi

Konsentrasi Absorban % Perolehan Kembali

2.5 0.993 695,16 %
5 0.248 95,46 %
7.5 0.586 139,893 %
10 0.374 69,05 %
12.5 0.643 91,648 %
15 0.748 88,22%

1. Penentuan panjang gelombang serapan maksimal teofilin dalam NaoH 0,1N

50 mg 50.000 mg
Larutan induk = =
50 ml 50 ml

= 1000 ppm
Panjang gelombang serapan maksimum teofilin 274 nm

2. Pembuatan kurva kalibrasi teofilin dalam NaOH 0,1N

5,5 ppm
3,5 ppm
V1.C1 = V2.C2
V1.C1 = V2.C2
V1. 1000 ppm = 10 ml. 5,5 ppm
V1. 1000 ppm = 10 ml. 3,5 ppm
1000. V1 = 55 ml
1000. V1 = 35 ml
V1 = 0,055 ml
V1 = 0,035 ml

7,5 ppm 9,5 ppm

V1.C1 = V2.C2 V1.C1 = V2.C2

V1. 1000 ppm = 10 ml. 7,5 ppm V1. 1000 ppm = 10 ml. 9,5 ppm

1000. V1 = 75 ml 1000. V1 = 95 ml

V1 = 0,075 ml V1 = 0,095 ml

11,5 ppm
13,5 ppm
V1.C1 = V2.C2
V1.C1 = V2.C2
V1. 1000 ppm = 10 ml. 11,5 ppm
V1. 1000 ppm = 10 ml. 13,5 ppm
1000. V1 = 115 ml
1000. V1 = 135 ml
V1 = 0,115 ml
V1 = 0,135 ml
3. Penetapan kadar dilakukan berdasarkan metode Schack dan Waxler yang dimodifikasikan

oleh Jenne dkk serta Zudema

Konsentrasi 2,5 ppm

V1.N1 = V2.N2

V1. 1000 ppm = 10 ml. 2,5 ppm

1000. V1 = 25 ml
V1 = 0,025 ml ̴ 25 μL

Absorbansi = 0,993

Persamaan regresi = y = 0,0591x - 0,0341

r² = 0,9679

y = 0,0591x - 0,0341

0,993 = 0,0591x - 0,0341

0,0591x = 0,993 + 0,0341

0,0591x = 1,0271

1,0271
x= = 17,379 μg/ml
0,0591

konsentrasi yang didapat

% perolehan kembali = x 100%
konsentrasi yang dipipet

17,379 μg /ml
= x 100%
2,5 μg /ml

= 695,16%

Konsentrasi 5 ppm

V1.N1 = V2.N2

V1. 1000 ppm = 10 ml. 5 ppm

1000. V1 = 50 ml

V1 = 0,05 ml ̴ 50 μL

Absorbansi = 0,248

Persamaan regresi = y = 0,0591x - 0,0341

r² = 0,9679

y = 0,0591x - 0,0341

0,248 = 0,0591x - 0,0341

0,0591x = 0,248 + 0,0341

0,0591x = 0,2821

0,2821
x= = 4,773 μg/ml
0,0591

konsentrasi yang didapat

% perolehan kembali = x 100%
konsentrasi yang dipipet

4,773 μg/ml
= x 100%
5 μg /ml

= 95,46 %

Konsentrasi 7,5 ppm

V1.N1 = V2.N2

V1. 1000 ppm = 10 ml. 7,5 ppm

1000. V1 = 75 ml

V1 = 0,075 ml ̴ 75 μL

Absorbansi = 0,586

Persamaan regresi = y = 0,0591x - 0,0341

r² = 0,9679

y = 0,0591x - 0,0341

0,586 = 0,0591x - 0,0341

0,0591x = 0,586 + 0,0341

0,0591x = 0,6201

0,6201
x= = 10,492 μg/ml
0,0591

konsentrasi yang didapat

% perolehan kembali = x 100%
konsentrasi yang dipipet

10,492 μg/ml
= x 100%
7,5 μg /ml

= 139,893 %

Konsentrasi 10 ppm
V1.N1 = V2.N2

V1. 1000 ppm = 10 ml. 10 ppm

1000. V1 = 100 ml

V1 = 0,1 ml ̴ 100 μL

Absorbansi = 0,374

Persamaan regresi = y = 0,0591x - 0,0341

r² = 0,9679

y = 0,0591x - 0,0341

0,374 = 0,0591x - 0,0341

0,0591x = 0,374 + 0,0341

0,0591x = 0,4081

0,4081
x= = 6,905 μg/ml
0,0591

konsentrasi yang didapat

% perolehan kembali = x 100%
konsentrasi yang dipipet

6,905 μg /ml
= x 100%
10 μg /ml

= 69,05 %

Konsentrasi 12,5 ppm

V1.N1 = V2.N2

V1. 1000 ppm = 10 ml. 12,5 ppm

1000. V1 = 125 ml

V1 = 0,125 ml ̴ 125 μL

Absorbansi = 0,643

Persamaan regresi = y = 0,0591x - 0,0341

r² = 0,9679
y = 0,0591x - 0,0341

0,643 = 0,0591x - 0,0341

0,0591x = 0,643 + 0,0341

0,0591x = 0,6771

0,6771
x= = 11,456 μg/ml
0,0591

konsentrasi yang didapat

% perolehan kembali = x 100%
konsentrasi yang dipipet

11,456 μg/ml
= x 100%
12,5 μg/ml

= 91,648%

Konsentrasi 15 ppm

V1.N1 = V2.N2

V1. 1000 ppm = 10 ml. 15 ppm

1000. V1 = 150 ml

V1 = 0,15 ml ̴ 150 μL

Absorbansi = 0,748

Persamaan regresi = y = 0,0591x - 0,0341

r² = 0,9679

y = 0,0591x - 0,0341

0,748 = 0,0591x - 0,0341

0,0591x = 0,748 + 0,0341

0,0591x = 0,7821

0,7821
x= = 13,233 μg/ml
0,0591

konsentrasi yang didapat

% perolehan kembali = x 100%
konsentrasi yang dipipet
 13,233 μg /ml
= x 100%
15 μg /ml

= 88,22%

b. Pembahasan

Pada praktikum kali ini dilakukan percobaan analisis kadar obat dalam matrik biologi.
Adapun tujuan dari percobaan kali ini adalah agar mahasiswa memahami prinsip dan
prosedur analisa obat dalam plasma. Sampel yang digunakan pada percobaan kali ini adalah
teofilin. Penetapan kadar teofilin dalam plasma ini bertujuan untuk mengetahui kadar teofilin
dalam matrik biologi. Matrik biologi yang digunakan pada percobaan kali ini adalah plasma
darah. Selain untuk mengetahui kadar, kita juga dapat memahami langkah langkah dalam
menganalisis obat dalam cairan biologi serta mengetahui prosedur obat didalam cairan
biologi dan dalam hayati agar nilai nilai parameter obat dapat dipercaya dimetode ini
sehingga harus memenuhi berbagai criteria yaitu perolehan kembali.

Persyaratan yang dituntut bagi suatu metode analisa adalah jika metode tersebut dapat
memperoleh nilai perolehan kembali yang tinggi. Pada praktikum kali ini dilakukan metode
perolehan kembali atau akurasi yang dimana merupakan metode analisis atau kedekatan
antara nilai terukur dengan nilai yang diterima baik nilai konvensi, nilai sebenarnya atau nilai
rujukan.

Pada percobaan ini, metode yang digunakan adalah spektrofotometer visible karena
ada gugus kromofor dengan gugus pembentuk kompleks warna yang dapat menyerap sinar
tampak. Pada percobaan ini, dilakukan penentuan panjang gelombang maksimum teofilin
dengan pembuatan larutan induk teofilin 50mg/50ml atau 1000 ppm didalam NaOH 0,1 N
dan diencerkan hingga konsentrasi 3,5 mg/ml. Setelah didapatkan panjang gelombang
maksimum, lalu dibuatkan kurva baku teofilin dalam darah yang bertujuan untuk
mendapatkan suatu persamaan garis yang menghubungkan antara luas area kadar teofilin
dalam darah. Metode ini dikatakan linier apabila hubungan antara respon metode dan
konsentrasi analit berbanding lurus dalam matriks.

Pada percobaan ini, analisa kadar obat dalam plasma dibuat dalam berbagai
konsentrasi yaitu 2,5ppm, 5ppm, 7,5ppm, 10ppm, 12,5ppm dan 15ppm. Tiap kelompok
mendapatkan 1 konsentrasi dan dikerjakan dengan tepat dan teliti. Sampel yang digunakan
diambil dari larutan induk sesuai dengan masing masing konsentrasi yang selanjutnya
dilarutkan dengan NaOH. Fungsi penambahan NaOH adalah untuk melarutkan teofilin dan
untuk meningkatkan sensitivitas penyerapan cahaya (absorban). Setelah dilarutkan dengan
NaOH, sampel diencerkan dengan HCL, dan lalu ditambahkan kloroform – isopropyl alcohol
yang berfungsi untuk membantu reaksi pembentukan dan proses penarikan komponen
organic maupun anorganik seperti like disol like. Larutan disentrifugasi yang berfungsi agar
diperoleh ekstrak bening dari sampel yang akan dianalisis. Larutan yang berada dibagian atas
dipipet dan selanjutnya diukur absorbannya dengan spektrofotometer UV.

Nilai absorban dari tiap tiap kelompok yang diperoleh selanjutnya digunakan untuk
menghitung kadar dari teofilin dengan menggunakan persamaan regresi linier sehingga
didapatkan masing masing kadar dari masing masing konsentrasi.

Teofilin adalah senyawa alkaloid turunan xanthum dan termasuk kedalam kelompok
purin. Teofilin digunakan sebagai obat untuk penyakit asma.

Adapun kesalahan yang terjadi yang dapat mempengaruhi percobaan :

- Kesalahan dalam pemipetan

- Kesalahan alat dan pereaksi
- Sampel mengandung banyak kotoran.

VI. Kesimpulan

- Pada praktikum kali ini dilakukan percobaan analisis kadar obat dalam matrik biologi.
Adapun tujuan dari percobaan kali ini adalah agar mahasiswa memahami prinsip dan
prosedur analisa obat dalam plasma

- Teofilin adalah senyawa alkaloid turunan xanthum dan termasuk kedalam kelompok
purin. Teofilin digunakan sebagai obat untuk penyakit asma.

- Adapun kesalahan yang terjadi yang dapat mempengaruhi percobaan :

 Kesalahan dalam pemipetan
 Kesalahan alat dan pereaksi
  Sampel mengandung banyak kotoran.

- Sampel yang digunakan pada percobaan kali ini adalah teofilin. Penetapan kadar
teofilin dalam plasma ini bertujuan untuk mengetahui kadar teofilin dalam matrik
biologi.
- Matrik biologi yang digunakan pada percobaan kali ini adalah plasma darah.

VII. Daftar pustaka

- FV. Mansur, Umar., dkk. 2011. Penuntun praktikum farmakokinetika. Depok : UI

- FW. Shargel, leon, et, al. 1988. Biofarmasetik dan farmakokinetika terapan, edisi
kedua. Surabaya : aquadestlangga university Press
- Ilmawati. Eldesi medisa. 2013. Validasi metode analisis obat dalam cairan hayati
(darah). Universitas muhamadiyah surakarta