LAMPIRAN

Lampiran A. Tahapan Penelitian

Pembuatan serbuk klobot jagung

Pembuatan media padat miring

Peremajaan biakan murni Trichoderma viride

Pembuatan media cair

Pembuatan inokulum (Biakan aktif)

Produksi dan isolasi enzim xilanase

Pemurnian xilanase

Penentuan aktivitas xilanase bebas

Penentuan kadar protein awal

Amobilisasi xilanase

Uji aktivitas xilanase amobil

41
 Uji kadar protein sisa

Penentuan Vm dan Km

Penentuan efisiensi penggunaan ulang xilanase amobil

Analisis data

Lampiran B. Preparasi larutan

B.1 Akuades steril
Akuades sebanyak 250 mL dimasukkan ke dalam erlenmeyer
250 mL dan ditutup dengan menggunakan kapas yang dilapisis
kertas coklat. Selanjutnya disterilisasi di dalam autoklaf pada
temperatur 1210C dengan tekanan 15 psi selama 15 menit.

B.2 Larutan asam asetat 0,2 M

Larutan asam asetat gasial 100% (berat jenis: 1,05 g/mL, BM:
60 g/mol, konsentrasi: 17,5 M) dipipet sebanyak 1,15 mL.
Dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL serta ditambahkan dengan
akuades hingga tanda batas.

B.3 Larutan natrium asetat 0,2 M

Serbuk natrium asetat dengan BM: 83,02 g/mol ditimbang
sebanyak 1,64 g dan dilarutkan dengan menggunakan akuades
secukupnya. Dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL dan
ditambahkan dengan akuades hingga tanda batas.

B.4 Buffer asetat pH 5 0,2 M

Larutan asam asetat 0,2 M dipipet sebanyak 50 mL dan
dimasukkan ke dalam gelas kimia 250 mL. Ditambahkan dengan
90,99 mL larutan natrium asetat 0,2 M serta diaduk hingga homogen.

42
B.5 Larutan stok glukosa 1500 µg/mL
Serbuk glukosa anhidrat ditimbang sebanyak 0,15 g dan
dilarutkan dengan menggunakan akuades secukupnya. Dimasukkan
ke dalam labu takar 100 mL serta ditambahkan dengan akuades
hingga tanda batas.

B.6 Pembuatan substrat xilan 1%

Serbuk xilan ditimbang sebanyak 1 g, dimasukkan ke dalam
gelas kimia 100 mL serta dilarutkan dengan menggunakan buffer
asetat pH 5 secukupnya. Selanjutnya dimasukkan ke dalam labu
takar 100 mL dan ditambahkan dengan buffer asetat pH 5 hingga
tanda batas.

B.7 Pembuatan air bebas reduktor

Akuades sebanyak 250 mL dimasukkan ke dalam erlenmeyer
250 mL serta ditambahkan beberapa tetes KMnO4 hingga berwarna
ungu. Selanjutnya larutan didestilasi dan destilat yang dihasilkan
merupakan air bebas reduktor.

B.8 Pembuatan reagen DNS

NaOH 1 g; NaKC4O6H4 18,2 g; kristal fenolin 0,2 g dan
Na2SO3 0,5 g dilarutkan dengan 50 mL akuades dalam gelas kimia
100 mL. Ditambahkan dengan 1 g asam dinitrosalisilat sedikit demi
sedikit sambil diaduk dengan menggunakan magnetik stirer. Setelah
larut dipindahkan ke dalam labu ukur 100 mL serta ditambahkan
dengan akuades hingga tanda batas.

B.9 Pembuatan larutan NaOH 1 M

Padatan NaOH ditimbang sebanyak 0,4 g serta dilarutkan
dengan menggunakan akuades sebanyak 50 mL. Dimasukkan ke
dalam labu takar 100 mL serta ditambahkan akuades hingga tanda
batas.

B.10 Larutan stok kasein 10000 µg/mL

Serbuk kasein ditimbang sebanyak 1 g dan dilarutkan dengan
50 mL akuades serta ditambahkan dengan larutan NaOH 0,1 M
sedikit demi sedikit hingga larut. Selanjutnya dimasukkan ke dalam

43
labu takar 100 mL serta ditambahkan dengan akuades hingga tanda
batas.
B.11 Larutan NaOH 10 %
Padatan NaOH ditimbang sebanyak 1 g dilarutkan dengan 50
mL akuades. Dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL dan
ditambahkan dengan akuades hingga tanda batas.

B.12 Reagen biuret

Ditimbang 0,15 g CuSO4.5H2O dan ditimbang 0,6 g
NaKC4O6H4, dilarutkan dengan menggunakan akuades sebanyak 30
mL dalam gelas kimia 100 mL. Larutan NaOH 10% ditambahkan
sebanyak 30 mL sambil diaduk dengan pengaduk. Larutan campuran
dimasukkan ke dalam labu ukur 100 mL dan diencerkan hingga
tanda batas.

B.13 Larutan HCl 0,1 M

Larutan HCl 37% dipipet sebanyak 0,96 mL dan dimasukkan
ke dalam gelas kimia yang berisi akuades secukupnya. Kemudian
dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL serta ditambahkan dengan
akuades hingga tanda batas.

B.14 Larutan BaCl2

Serbuk BaCl2 ditimbang sebanyak 2,445 g dan dilarutkan
dengan 50 mL akuades. Kemudian dimasukkan ke dalam labu takar
100 mL serta ditambahkan dengan akuades hingga tanda batas.

Lampiran C. Perhitungan Preparasi Larutan

C.1 Larutan asam asetat 0,2 M
Larutan asam asetat 0,2 M dibuat dari asam asetat glasial 100%
(Bj: 1,05 g/mol; BM: 60g/mol) dengan cara :
Berat jenis
Konsentrasi asam asetat glasial = BM
1,05 x 1000 g/L
= 60 g/mol
= 17,5 M
Untuk membuat konsentrasi 0,2 M dilakukan pengenceran
dengan rumus sebagai berikut :
V 1 x M1 = V 2 x M2
V1 x 17,5 = 100 x 0,2
V1 = 1,143 mL
44
 Dipipet larutan asam asetat dengan pipet ukur 5 mL sebanyak
1,15 mL, dimasukkan dalam labu ukur 100 mL dan diencerkan
dengan akuades sampai tanda batas.

C.2 Larutan natrium asetat 0,2 M

Larutan natrium asetat 0,2 M dibuat sebanyak 100 mL (BM
CH3COONa = 82,02 g/mol) :
Mol CH3COONa = [CH3COONa] x V larutan
= 0,2 mol/L x 0,1 L
= 0,02 mol
Berat CH3COONa = mol CH3COONa x BM CH3COONa
= 0,02 mol x 80,02 g/mol
= 1,6 gram

C.3 Larutan buffer asetat pH 5

Larutan buffer asetat pH 5 dibuat dengan mencampurkan larutan
asam asetat dengan larutan natrium asetat berdasarkan persamaan di
bawah ini :
[CH3 COOH]
pH = pKa – log −
[CH3 COO ]
Untuk membuat larutan buffer asetat pH 5 maka 50 mL larutan
asam asetat ditambah dengan 90,99 mL larutan natrium asetat
dengan perhitungan sebagai berikut
pKa asam asetat = 4,74
mmol
(50 mL x 0,2 )/(50+V)mL
5 = 4,74 – log mL
mmol
V mL x 0,2 /(50+V)mL
mL
50
5 = 4,74 – log
V
V = 90,99 mL

C.4 Larutan HCl 0,4 M

Larutan HCl 0,4 M dibuat dari larutan HCl 37% (37g/100 mL)
massa 1000
M= ×
Mr 100
37
= 35,5 ×10 = 10,423 M

M1 x V 1 = M2 x V 2
10,423 M x V1 = 0,4 M x 100 mL
45
 V1 = 3,84 mL

C.5 Larutan NaOH 0,1 M

Larutan NaOH 0,1 M (Mr 40 g/mol) dibuat sebanyak 100 mL
Mol NaOH = [NaOH] x V larutan
= 0,1 mol/L x 0,1 L
= 0,01 mol
Massa NaOH = mol NaOH x Mr NaOH
= 0,01 mol x 40 g/mol
= 0,4 g
Jadi untuk membuat laruitan NaOH 0,1 M sebanyak 100 mL
dibutuhkan 0,4 g padatan NaOH.

Lampiran D. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum dan

Kurva Baku Gula Pereduksi
Tabel D.1 Data Absorbansi Larutan Glukosa pada λ (480-550) nm
λ (nm) Ᾱ λ (nm) Ᾱ
480 0,046 520 0,050
485 0,045 525 0,042
490 0,074 530 0,029
495 0,067 535 0,046
500 0,057 540 0,047
505 0,054 545 0,048
515 0,056 550 0,044

Tabel D.2 Absorbansi Gula Pereduksi pada λ 490 nm

Konsentrasi glukosa (µg/mL) A1 A2 A3 Ᾱ
0 0 0 0 0
12 0,217 0,215 0,220 0,217
24 0,449 0,448 0,446 0,448
36 0,600 0,599 0,597 0,599
40 0,630 0,633 0,636 0,633
48 0,815 0,815 0,815 0,815

46
 1
0.8
Absorbansi 0.6
y = 0.0168x
0.4 R² = 0.9913
0.2
0
0 10 20 30 40 50 60
Konsentrasi Glukosa (μg/mL)

Gambar D.1 Kurva Baku Gula Pereduksi

Lampiran E. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum dan

Kurva Baku Kasein
Tabel E.1 Data Absorbansi Larutan Kasein pada λ (460-640) nm
λ (nm) A λ (nm) A
460 0,085 560 0,170
480 0,109 580 0,147
500 0,141 600 0,118
520 0,169 620 0,081
540 0,180 640 0,048

Tabel E.2 Absorbansi Kasein pada λ 540 nm

Konsentrasi Kasein A1 A2 A3 Ᾱ
0 0 0 0 0
1000 0,021 0,023 0,021 0,022
2000 0,050 0,050 0,050 0,050
3000 0,077 0,078 0,077 0,077
4000 0,120 0,119 0,119 0,119
5000 0,149 0,149 0,152 0,150
6000 0,184 0,185 0,186 0,185
7000 0,222 0,222 0,224 0,223
8000 0,246 0,245 0,245 0,245
9000 0,270 0,270 0,270 0,270

47
 0.3

0.25

0.2 y = 3E-05x
R² = 0,9937
Absorbansi

0.15

0.1

0.05

0
0 2000 4000 6000 8000 10000
Konsentrasi kasein (ppm)
Gambar E.1 Kurva Baku Kasein

Lampiran F. Aktivitas Enzim Xilanase Bebas

F.1 Aktivitas Ekstrak Kasar Xilanase
Uji aktivitas enzim xilanase bebas menggunakan kurva baku
gula pereduksi dengan persamaan garis linier y = 0,0168x dan nilai
koefisien korelasi 0,9913. Sehingga dapat ditentukan konsentrasi
xilosa. Pada ekstrak kasar xilanase diperoleh absorbansi sebesar
0,107, maka konsentrasi xilosa dapat dihitung sebagai berikut:
y = 0,0168x
0,107 = 0,0168x
x = 6,349 µg/mL
Sehingga aktivitas xilanase bebas dihitung sebagai berikut:
X x V x fp Mr xilosa
AE = pxq
x Mr glukosa

25
6,349 µg/mL x 6 mL x 150,13 g/mol
6
= 1 mL x 55 menit
x 180 g/mol

= 2,407 µg/mL.menit

48
Tabel F.1 Aktivitas Ekstrak Kasar Xilanase
Absorbansi Konsentrasi Aktivitas
A1 A2 A3 Ᾱ Enzim (µg/mL) Enzim
(µg/mL.menit)
0,105 0,107 0,108 0,107 6,349 2,407

F.2 Aktivitas Xilanase Hasil Pemurnian

Uji aktivitas enzim xilanase bebas menggunakan kurva baku
gula pereduksi dengan persamaan garis linier y = 0,0168x dan nilai
koefisien korelasi 0,9913. Sehingga dapat ditentukan konsentrasi
xilosa. Pada xilanase hasil pemurnian diperoleh absorbansi sebesar
0,526, maka konsentrasi xilosa dapat dihitung sebagai berikut:
y = 0,0168x
0,526 = 0,0168x
x = 31,290 µg/mL
Sehingga aktivitas xilanase bebas dihitung sebagai berikut:
X x V x fp Mr xilosa
AE = x
pxq Mr glukosa

25
31,290 µg/mL x 6 mL x 150,13 g/mol
6
= 2,544 mg/mL x 55 menit
x 180 g/mol

= 4,663 µg/mg.menit

Tabel F.2 Aktivitas Xilanase Hasil Pemurnian

Absorbansi Konsentrasi Aktivitas Enzim
A1 A2 A3 Ᾱ Enzim (µg/mL) (µg/mg.menit)
0,525 0,525 0,527 0,526 31,290 4,663

Lampiran G. Kadar Protein Awal

G.1 Kadar Protein Awal
Uji kadar protein awal menggunakan kurva baku kasein
dengan persamaan garis linier y = 0,00003x, sehingga dapat
diketahui konsentrasi protein. Data absorbansi rata-rata xilanase hasil
pemurnian pada λ 540 nm adalah 0,226, maka dapat dihitung:
y = 3x10-5x
0,226 = 3x10-5x
49
 x = 7544,4 µg/mL
Kadar protein awal = konsentrasi protein total – konsentrasi kasein
= 7544,4 μg/mL – 5000 μg/mL
= 2544,4 μg/mL = 2,544 mg/mL

Tabel G.1 Kadar Protein Awal

Absorbansi Kadar Protein
A1 A2 A3 Ᾱ (µg/mL)
0,226 0,226 0,23 0,226 2,544

Lampiran H. Aktivitas Xilanase yang Diamobilkan pada

Matriks Bentonit
H.1 Aktivitas Xilanase Amobil
Uji aktivitas enzim xilanase amobil menggunakan kurva
baku gula pereduksi dengan persamaan garis linier y = 0,0168x dan
nilai koefisien korelasi 0,9913. Sehingga dapat ditentukan
konsentrasi xilosa. Pada xilanase amobil diperoleh absorbansi
sebesar 0,325, maka konsentrasi xilosa dapat dihitung sebagai
berikut:
y = 0,0168x
0,325 = 0,0168x
x = 19,345 µg/mL

X x V x fp Mr xilosa
AE = pxq
x Mr glukosa

10
19,345 µg/mL x 1 mL x 150,13 g/mol
1
= 6,784 mg x 55 menit
x 180 g/mol

= 0,432 µg/mg.menit

Tabel H.1 Aktivitas Xilanase Amobil

Absorbansi Konsentrasi Enzim Aktivitas
A1 A2 A3 Ᾱ (µg/mL) Enzim
(µg/mg.menit)
0,323 0,32 0,332 0,325 19,345 0,432

50
Lampiran I. Kadar Protein Sisa
I.1 Kadar Protein Sisa
Uji kadar protein sisa menggunakan kurva baku kasein
dengan persamaan garis linier y = 0,00003x, sehingga dapat
diketahui konsentrasi protein. Data absorbansi rata-rata xilanase hasil
pemurnian pada λ 540 nm adalah 0,153, maka dapat dihitung:
y = 3x10-5x
0,153 = 3x10-5x
x = 5100 µg/mL
Kadar protein sisa = konsentrasi protein total – konsentrasi kasein

= 5100 μg/mL – 5000 μg/mL

= 100 μg/mL = 0,1 mg/Ml

Tabel I.1 Kadar Protein Sisa

Absorbansi Kadar Protein (µg/mL)
A1 A2 A3 Ᾱ
0,153 0,153 0,153 0,153 0,1

Massa enzim yang teradsorpsi = V x kadar protein awal

(dalam 0,8 g matriks) =24 mL x 2,544 mg/mL
= 61,056 mg (awal)

0,061056 g
Massa enzim yang terdsorpsi = 0,9 g
x 0,1 g = 0,006784 g
(dalam 0,1 g matriks) = 6,784 mg
Massa enzim setelah amobil = V x kadar protein sisa
= 2 mL x 0,1 mg/mL
= 0,2 mg
Massa enzim yang teradsorpsi = 61,056 mg - 0,2 mg
= 60,856 mg

51
Lampiran J. Parameter Kinetika Enzimatis
Tabel J.1 : Data Absorbansi Xilanase Bebas pada Variasi
Konsenrasi xilan
Xilan (%) A1 A2 A3 Ᾱ
0,1 0,177 0,178 0,179 0,178
0,5 0,341 0,341 0,342 0,341
1 0,525 0,525 0,527 0,526
1,5 0,514 0,514 0,513 0,514
2 0,5 0,505 0,51 0,505

Tabel J.2 : Aktivitas Xilanase Bebas pada Variasi Konsentrasi Xilan

Xilan (%) [Gula Pereduksi] AE (µg/mg.menit) 1/[S] 1/V
0,1 10,595 1,579 10 0,633
0,5 20,317 3,028 2 0,330
1 31,290 4,663 1 0,214
1,5 30,575 4,556 0,667 0,219
2 30,060 4,479 0,5 0,223

Tabel J.3 : Data Absorbansi Xilanase Amobil pada Variasi

Konsenrasi xilan
Xilan (%) A1 A2 A3 Ᾱ
0,1 0,294 0,295 0,294 0,294
0,5 0,326 0,323 0,324 0,324
1 0,342 0,341 0,343 0,342
1,5 0,335 0,336 0,336 0,336
2 0,334 0,335 0,335 0,335

52
Tabel J.4 : Aktivitas Xilanase Amobil pada Variasi Konsentrasi
Xilan
Xilan (%) [Gula Pereduksi] AE (µg/mg.menit) 1/[S] 1/V
0,1 17,520 0,392 10 2,554
0,5 19,306 0,432 2 2,317
1 20,357 0,455 1 2,198
1,5 19,980 0,447 0,667 2,239
2 19,921 0,445 0,5 2,246

Perhitungan Nilai Vm dan KM

Nilai Vm dan KM xilanase bebas dan amobil ditentukan dari
persamaan garis pada kurva hubungan antara 1/[S] dengan 1/V
 Enzim Xilanase Bebas
Y = 0,0438x + 0,1999
1
𝑉
= 0,1999
𝑚

Vm = 5,003 µg/mg.menit
𝐾𝑀 𝐾𝑀
𝑉
= 5,003 = 0,0438
𝑚
KM = 0,219 %
 Enzim Xilanase Amobil
Y = 0,0343x + 2,2135
1
𝑉
= 2,2135
𝑚

Vm = 0,452 µg/mg.menit
𝐾𝑀 𝐾𝑀
𝑉
= 0,452 = 0,0343
𝑚
KM = 0,015 %

53
Lampiran K. Efisiensi Penggunaan Ulang Xilanase Amobil
Tabel K.1 : Data Absorbansi Penggunaan Ulang Xilanase Amobil
Pengulangan A1 A1 A3 Ᾱ
1 0,455 0,454 0,455 0,455
2 0,412 0,417 0,414 0,414
3 0,386 0,387 0,387 0,387
4 0,379 0,379 0,38 0,379
5 0,347 0,347 0,346 0,347
6 0,245 0,245 0,243 0,244

Tabel K.2 : Efisiensi Penggunaan Ulang Xilanase Amobil

Pengulangan [Gula Pereduksi] AE (µg/mg.menit) Efisiensi
1 27,063 0,605 100,00
2 24,663 0,551 91,13
3 23,016 0,514 85,04
4 22,579 0,505 83,43
5 20,635 0,461 76,25
6 14,544 0,325 53,74

Lampiran L. Analisis Statistika

L.1 Penentuan Vm dan KM pada enzim bebas

ANOVA

Sum of Squares df Mean Square F Sig.

Between Groups 21,630 4 5,407 12256,118 ,000

Within Groups ,004 10 ,000
Total 21,634 14
Fhitung > Ftabel (p=0,05), sehingga dapat dikatakan bahwa variasi
konsentrasi xilan yang diterapkan berpengaruh terhadap aktivitas
xilanase bebas.

54
Tukey HSDa

Subset for alpha = 0.05

bebas N 1 2 3 4 5

,10 3 1,57900
,50 3 3,02767
2,00 3 4,47933
1,50 3 4,55600
1,00 3 4,66267
Sig. 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

L.2 Penentuan Vm dan KM pada enzim amobil

ANOVA

Sum of Squares df Mean Square F Sig.

Between Groups ,008 4 ,002 1292,432 ,000

Within Groups ,000 10 ,000
Total ,008 14
Fhitung > Ftabel (p=0,05), sehingga dapat dikatakan bahwa variasi
konsentrasi xilan yang diterapkan berpengaruh terhadap aktivitas
xilanase amobil.

55
Tukey HSDa

Subset for alpha = 0.05

amobil N 1 2 3 4

,10 3 ,39167
,50 3 ,43167
2,00 3 ,44533
1,50 3 ,44667
1,00 3 ,45500
Sig. 1,000 1,000 ,670 1,000

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

56