Laporan Praktikum PJP Dr.

Inda Setyawati,
Karakterisasi Biomolekul S.T.P., M.Si.
Topik ke 5 Asisten Roro Intan Sasmaya
Akbar
Tanggal 22 Sept 2022 Nama Rama Vijaya Jhowry
Waktu 13.00-16.00 NIM/Kel G8401211093/K4

DENATURASI PROTEIN
PENDAHULUAN
Protein telah berevolusi untuk berfungsi pada kondisi lingkungan spesifik.
Parameter lingkungan di luar kondisi spesifik tersebut menyebabkan perubahan
struktural tiga dimensi yang disebut denaturasi (Nelson dan Cox 2017). Denaturasi
protein merupakan proses dimana protein mengalami perubahan konformasi dari
struktur asalnya sehingga mengalami pengurangan kelarutan dan kehilangan fungsi
biologis. Penyebab denaturasi protein dapat digolongkan menjadi agen fisik seperti
pemanasan, sinar UV, ultrasound, dan tekanan tinggi (Lukmana 2011), serta agen
kimia seperti suasana asam, suasana basa, dan alkohol (Anson dan Mirsky 1925).
Perubahan konformasi protein pada proses denaturasi juga mempengaruhi
absorbansi sinar UV dari protein tersebut (Melo et al. 1997). Praktikum ini
bertujuan mengukur kadar protein dalam larutan melalui spektrofotometri UV dan
mengamati perubahan absorbansi protein saat protein mengalami denaturasi.
METODE
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah spektrofotometer UV-Vis,
spektrofluorometer, timbangan analitik, pH meter, mikropipet, tip pipet, labu takar
100 ml, beaker 100 ml, tabung reaksi, dan kuvet quartz. Bahan yang digunakan
dalam praktikum ini adalah akuades, urea, garam 3-(N-
morpholino)propanesulfonic acid sodium (garam MOPS sodium), HCl 1 M,
sampel protein RNAse T1 komersial, dan larutan bovine serum albumin (BSA)
murni dalam 50 mM kPi pH 7.0.
Prosedur
Untuk percobaan kuantitasi protein dengan metode spektrofotometri UV,
jumlah residu triptofan, tirosin, dan ikatan disulfida dalam BSA ditentukan. Molar
absorption coefficient dari BSA dihitung dengan jumlah residu triptofan, tirosin,
dan ikatan disulfida. Larutan sampel BSA lalu diuji absorbansinya pada panjang
gelombang 280 nm dan 330 nm. Nilai absorbansi digunakan untuk menghitung
konsentrasi BSA dalam larutan.
Untuk percobaan denaturasi protein, larutan stok urea disiapkan dari 60 g
urea, garam sodium MOPS 0.694 g, 1 M HCl sebanyak 1.8 mL, dan akuades 45 mL
yang kemudian ditambah dengan akuades hingga volumenya 100 mL. Buffer
MOPS disiapkan dari 0.694 garam sodium MOPS yang dilarutkan dalam 90 mL
akuades, ditambah 1 N HCl untuk mengatur pH, dan ditambah akuades hingga
volumenya 100 mL. Stok larutan protein disiapkan dari RNAse T1 sebanyak 100
mg yang ditambahkan buffer MOPS sebanyak 10 mL. Tabung uji sebanyak 25 buah
diisi campuran larutan stok protein, stok urea, dan buffer MOPS dengan volume
stok urea dan buffer MOPS yang bervariasi. Emisi fluoresensi diukur untuk setiap
sampel selama 30 detik dan kurva emisi terhadap konsentrasi urea dibuat.
HASIL DAN DISKUSI
Bovine serum albumin (BSA) memiliki 3 residu triptofan (W), 21 residu
tirosin (Y), dan 35 residu sistein (C) dengan 17 ikatan disulfida. Jumlah residu asam
amino tersebut digunakan dalam perhitungan molar absorption coefficient dari
BSA. Berdasarkan hasil perhitungan, molar absorption coefficient dari BSA
bernilai 49915. Berikut merupakan sekuens asam amino BSA dan perhitungan
molar absorption coefficient BSA pada panjang gelombang 280 nm.

>sp|P02769|ALBU_BOVIN Albumin OS=Bos taurus OX=9913 GN=ALB PE=1

SV=4
MKWVTFISLLLLFSSAYSRGVFRRDTHKSEIAHRFKDLGEEHFKGLVLIAFSQYLQQCPF
DEHVKLVNELTEFAKTCVADESHAGCEKSLHTLFGDELCKVASLRETYGDMADCCEKQEP
ERNECFLSHKDDSPDLPKLKPDPNTLCDEFKADEKKFWGKYLYEIARRHPYFYAPELLYY
ANKYNGVFQECCQAEDKGACLLPKIETMREKVLASSARQRLRCASIQKFGERALKAWSVA
RLSQKFPKAEFVEVTKLVTDLTKVHKECCHGDLLECADDRADLAKYICDNQDTISSKLKE
CCDKPLLEKSHCIAEVEKDAIPENLPPLTADFAEDKDVCKNYQEAKDAFLGSFLYEYSRR
HPEYAVSVLLRLAKEYEATLEECCAKDDPHACYSTVFDKLKHLVDEPQNLIKQNCDQFEK
LGEYGFQNALIVRYTRKVPQVSTPTLVEVSRSLGKVGTRCCTKPESERMPCTEDYLSLIL
NRLCVLHEKTPVSEKVTKCCTESLVNRRPCFSALTPDETYVPKAFDEKLFTFHADICTLP
DTEKQIKKQTALVELLKHKPKATEEQLKTVMENFVAFVDKCCAADDKEACFAVEGPKLVV
STQTALA

Sekuens asam amino bovine serum albumin (BSA) telah didepositkan di UniProt
dengan nomor akses P02769.
𝜀280 = (5500 × 𝑛𝑇𝑟𝑝) + (1490 × 𝑛𝑇𝑦𝑟) + (125 × 𝑛𝑆 − 𝑆)
= (5500 × 3) + (1490 × 21) + (125 × 17) = 49915 𝑀−1 𝑐𝑚−1
Absorbansi sampel BSA pada panjang gelombang 280 nm dan 330 nm
berturut-turut bernilai 0.761 dan 0.186. Nilai absorbansi tersebut digunakan untuk
perhitungan absorbansi pada panjang gelombang 280 nm yang dikoreksi dari
scattering sinar dalam sampel. Nilai absorbansi yang dikoreksi digunakan untuk
perhitungan konsentrasi protein dalam sampel beserta dengan nilai panjang kuvet 1
cm.
𝐴280 (𝑐𝑜𝑟𝑟𝑒𝑐𝑡𝑒𝑑) = 𝐴280 − 1.929 × 𝐴330

= 0.761 − 1.929 × 0.186 = 0.402

𝐴280 (𝑐𝑜𝑟𝑟𝑒𝑐𝑡𝑒𝑑) 0.402
𝑐(𝑀) = = = 8.054 × 10−6 𝑀
𝜀𝑙 49915 × 1
Urea merupakan salah satu agen kimia pendenaturasi protein yang
mengganggu ikatan hidrogen. Menurut Bennion dan Daggett (2003), urea
menyebabkan hilangnya pelipatan protein secara langsung dan tidak langsung.
Dalam mekanisme langsung, urea berikatan hidrogen dengan bagian polar protein,
terutama gugus peptida sehingga mengeliminasi ikatan hidrogen intramolekul
protein. Hilangnya ikatan hidrogen intramolekul menyebabkan solvasi inti
hidrofobik protein melalui influks molekul air dan urea. Mekanisme tidak langsung
melibatkan perubahan struktur dan dinamika air oleh urea sehingga mengurangi
interaksi hidrofobik dan memfasilitasi penyingkapan residu hidrofobik inti protein
terhadap air. Bahan lain yang digunakan dalam percobaan denaturasi protein ini
adalah HCl untuk pencegahan hidrolisis dan garam MOPS sodium sebagai buffer
untuk menjaga pH saat proses denaturasi. Tabel dan grafik intensitas fluoresensi
RNAse T1 terhadap konsentrasi urea tertera sebagai berikut.
Tabel 1 Konsentrasi urea dan intensitas fluoresensi
No Konsentrasi urea (mM) AU
1 300 0.095
2 302 0.101
3 304 0.119
4 306 0.131
5 308 0.139
6 310 0.149
7 312 0.195
8 314 0.2
9 316 0.215
10 318 0.286
11 320 0.384
12 322 0.475
13 324 0.586
14 326 0.641
15 328 0.682
16 330 0.695
17 332 0.711
18 334 0.705
19 336 0.72
20 338 0.721
21 340 0.72
22 342 0.724
23 344 0.723
24 346 0.731
25 348 0.725
 Gambar 1. Grafik intensitas fluoresensi terhadap konsentrasi urea
Berdasarkan Gambar 1, intensitas fluoresensi RNAse T1 meningkat dengan
konsentrasi urea. RNAse T1 mengalami kenaikan intensitas fluoresensi secara
signifikan pada konsentrasi rentang urea 318-328 mM. Intensitas fluoresensi
cenderung konstan pada rentang konsentrasi urea 300-310 mM dengan nilai sekitar
0.1 AU dan rentang konsentrasi urea 330-350 mM dengan nilai sekitar 0.7 AU.
Peningkatan intensitas fluoresensi RNAse T1 dengan konsentrasi urea
menunjukkan peningkatan jumlah protein yang terdenaturasi oleh urea. Pola
peningkatan intensitas fluoresensi yang yang meningkat secara signifikan pada
rentang konsentrasi urea tertentu menunjukkan bahwa konformasi RNAse T1 tetap
stabil saat ditambahkan urea hingga mengalami denaturasi pada rentang konsentrasi
urea yang sempit, yaitu 318-328 mM pada percobaan ini. Perubahan konformasi
yang mendadak ini menunjukkan bahwa denaturasi RNAse T1 bersifat kooperatif.
Menurut Nelson dan Cox (2017), sifat kooperatif dari denaturasi protein
menjelaskan bahwa hilangnya konformasi native pada satu bagian protein
menyebabkan destabilisasi bagian-bagian protein lainnya. Peningkatan intensitas
fluoresensi dengan konsentrasi urea mengindikasikan adanya hyperchromic effect
pada RNAse T1. Hyperchromic effect merupakan peningkatan absorbansi protein
terhadap sinar ultraviolet akibat denaturasi atau degradasi (Lindy et al. 1986).
Peningkatan absorbansi RNAse T1 pada percobaan ini ditandai dengan peningkatan
intensitas fluoresensi.
SIMPULAN
Konsentrasi protein pada sampel bovine serum albumin (BSA) yang
digunakan dalam praktikum ini bernilai 8.054 x 10-6 M. Denaturasi protein oleh
urea disebabkan oleh terganggunya ikatan hidrogen intramolekuler pada protein
oleh urea. Berdasarkan uji emisi fluoresensi, denaturasi sampel protein RNAse T1
oleh urea bersifat kooperatif. RNAse T1 juga mengalami hyperchromic effect, yaitu
peningkatan absorbansi sinar UV dan intensitas fluoresensi ketika mengalami
denaturasi.
DAFTAR PUSTAKA
Anson ML, Mirsky AE. 1925. On some general properties of proteins. J Gen
Physiol. 9(2):169.
Bennion BJ, Daggett V. 2003. The molecular basis for the chemical denaturation
of proteins by urea. Proceedings of the National Academy of Sciences.
100(9):5142–5147.
Lindy S, Sorsa T, Suomalainen K, Lauhio A, Turto H. 1986. Hyperchromic effect
of collagen induced by human collagenase. Eur J Biochem. 156(1):1–4.
Lukmana A. 2011. Denaturasi protein. Jurnal Kimia Dan Kemasan. 1:1–12.
Melo EP, Aires-Barros MR, Costa SMB, Cabral JMS. 1997. Thermal unfolding of
proteins at high pH range studied by UV absorbance. J Biochem Biophys
Methods. 34(1):45–59.
Nelson DL, Cox MM. 2017. Lehninger Principles of Biochemistry Seventh Edition.
New York (NY): W.H. Freeman and Company.