I.

TUJUAN PERCOBAAN
Menentukan kadar gula reduksi dari suatu bahan yang mengandung
karbohidrat dengan metode DNS dan Nelson-Somoyogi.

II. PENDAHULUAN
Karbohidrat merupakan suatu polihidroksi aldehid atau
polihidroksi keton dan meliputi kondensat polimer-polimernya yang
terbentuk. Karbohidrat memiliki rumus empiris CnH2nOn. Karbohidrat
banyak terdapat dalam bahan nabati, baik berupa gula sederhana ataupun
karbohidrat dengan berat molekul yang tinggi. Karbohidrat merupakan
sumber kalori yang utama bagi mahluk hidup. Secara alami, terdapat tiga
bentuk karbohidrat yang terpenting, yaitu monosakarida, oligosakarida
(terdiri atas 2-10 unit monoskarida), dan polisakarida (terdiri lebih dari 10
unit monosakarida). Contoh monosakarida adalah glukosa. Contoh
oligosakarida adalah sukrosa. Contoh polisakarida adalah pati, amilum,
selulosa, pektin.
Gula reduksi merupakan monosakarida atau disakarida yang
mengandung gugus aldehid atau keton bebas. DNS (Dinitrosalycilic acid)
merupakan metode untuk menentukan gula reduksi dalam suatu bahan.
Sampel gula pereduksi akan mengalami oksidasi sedangkan gugus NO2
pada senyawa DNS mengalami reduksi. Metode Nelson-Somogyi juga
merupakan salah satu metode penentuan gula pereduksi. Namun, dasar
reaksi metode ini berbeda dengan DNS. Analisa secara kuantitatif
didasakan pada hukum Lambert-Beer yang menyatakan bahwa intensitas
cahaya yang diserap berbanding lurus dengan konsentrasi senyawa, atau
dirumuskan: A= ε x b x c, dengan ε adalah koefisien ekstingsi molar, b
adalah tebal larutan (kuvet), c adalah konsentrasi larutan, dan A adalah
absorban (Khopkar,1990).
Metode Nelson-Somogyi merupakan metode penetapan kadar gula
pereduksi, dimana prinsipnya, gula pereduksi akan mereduksi ion Cu2+
menjadi Cu+ , kemudian ion Cu+ akan mereduksi senyawa arsenomolibdat
membentuk kompleks warna biru kehijauan (Nelson,1944; Sadasivam dan
Manickam,1996). Metode Nelson-Somogyi lebih spesifik untuk
menetapkan kadar gula pereduksi pada sampel yang memiliki senyawa
gula campuran di dalamnya. Reaksi yang terjadi antara reagen Cu alkalis
(Cu2+) spesifik dengan gula pereduksi menjadi Cu+ (endapan merah bata)
kemudian ketika ditambahkan arsenomolibdat endapan tersebut akan larut
dan membentuk kompleks [AsMo4 VMo8 VIO40] 7- berwarna biru
kehjauan (Cu+ diubah menjadi Cu2+). Gula-gula non pereduksi yang telah
ada didalam sampel tidak mempengaruhi reaksi yang terjadi. Metode
Nelson-Somogyi menyajikan presentase total karbohidrat didalam sampel
(Kautsar,2011).

1
 Dilakukan pengukuran absorbansi pada anjang gelombang 540 nm
yang dinilai memberikan serapan optimal dari kompleks berwarna antara
kuprooksida gula dan arsenomolybdate. Reagen Nelson-Somogyi
berfungsi sebagai oksidator antara kupri oksida yang bereaksi dengan gula
pereduksi pada bahan dan memberuk endapan merah bata, merupakan
pereaksi tembaga alkali yang mengandung Na2PO4 anhidrat dengan
Kalium Natrium Tartrat (garam Rochelle). Pereaksi arsemonolybdate
mengandung ammonium monolybdate H2SO4, NaHAsO4.7H2O. Kadar
gula dapat ditentukan dengan mengukur serapan warna kompleks dan
dibandingkan dengan standar (Fauzi,1994).
Metode alternatif yang dapat digunakan selain metode Nelson-
Somogyi adalah metode DNS yang lebih sederhana, sensitf, dan dapat
digunakan untuk sampel dalam jumlah besar (Sadasivam dan
Manickam,1996). Prinsip metode ini adalah dalam suasana alkali gula
pereduksi akan mereduksi asam 3,5-dinitrosalisilat (DNS). Metode 3,5-
dinitrosalicylic acid (DNS) melibatkan deteksi kolorimetri berdasarkan
oksidasi gugus karbonil dan reaksi dengan molekul penyerap UVVis.
Dalam reaksinya terjadi oksidasi gugus aldehid/keton dari gula pereduksi
dan DNS tereduksi menjadi 3-amino-5-notrisalicylic acid. Banyak reaksi
sampingan (seperti dekomposisi gula yang bersaing dengan
jumlah/ketersediaan DNS) yang bergantung pada karakter gula pereduksi,
gula yang berbeda akan menghasilkan intensitas warna yang berbeda,
sehingga perlu dikalibrasi untuk tiap gula. Karena spesifitas rendah, harus
ada blanko untuk hasilkan tes yang akurat dan tepat (Miller,1959). Reagen
DNS mengandung 1% DNS, 0.2% fenol, 0.05% Sodium bisulfit, dan 1%
Sodium hidroksida. Fenol digunakan untuk meningkatkan warna yang
dihasilkan, bisulfit untuk menstabilkan warna, dan alkali berperan dalam
reaksi reduksi, penambahan NaOH digunakan untuk menciptakan suasana
basa agar reaksi dapat terjadi. Pemanasan sampel dengan reagen DNS
hingga muncul warna merah kecoklatan dan didinginkan karena suhu
dapat mempengaruhi absorbansi. Tanpa garam Rochelle yang ditambahkan
setelah munculnya warna dan pendinginan, warna yang dihasilkan tidak
akan stabil, selain itu juga berfungsi untuk mencegah reagen melarutkan
O2. Absorbansi diukur pada panjang gelombang 575 nm yang dinilai
memberikan serapan paling maksimal untuk warna yang dihasilkan.
Hilangnya karbohidart dapat diatas dengan sodium bisulfit dan garam
Rochelle, konsentrasi sulfit yang ditambahkan jika kurang dari 0.05%
menyebabkan kurva tidak linier namun jika berlebih dapat menyebabkan
depresi intensitas warna. Kadar NaOH tinggi dapat berdampak pada
hilangnya karbohidrat (Miller,1959).

III. ALAT DAN BAHAN

2
 Alat :

1. Tabung reaksi
2. Rak tabung reaksi
3. Beaker gelas 50 ml,100 ml dan 500 ml
4. Pipet ukur 10 ml
5. Pipet ukur 1 ml
6. Pipet pasteur atau tetes
7. Aluminuim foil
8. Label
9. Spektrofotometer
10. Kuvet
11. Waterbath
12. Filler
13. Labu ukur 100ml
14. Gelas ukur 50ml & 100ml
15. Pengaduk kaca

Bahan :
1. Aquades
2. Glukosa
3. DNS
4. NaOH
5. Kalium Tartarat 40% (garam rochelle)
6. Sodium Sulfit
7. Nelson A
8. Nelson B
9. Sampel Buavita leci
10. Arsenomolibda

3
IV. SKEMA KERJA
4.1. Penyiapan Reagen DNS 1%

DNS 1 gram

Sodium sulfit 50 mg NaOH 1 gram

Dilarutkan dalam labu ukur 100 ml

Reagen DNS 1%

IV.2. Pembuatan larutan sodium potassium tartat 40%

Sodium potassium tartat 20 gram

Akuades 50 ml

Dilarutkan dalam labu ukur 50 ml

Larutan Sodium potassium tartat 40%

IV.3. Penyiapan kurva standar DNS

4
 Glukosa 100 gram

Akuades 50 ml

Dilarutkan dalam labu ukur 50 ml

Larutan glukosa standar (2000 µg/ml)

Akuades

Diencerkan

Larutan Larutan Larutan Larutan

Larutan Larutan
glukosa glukosa glukosa glukosa
glukosa glukosa
200 400 1000 1200
600 µg/mL 800 µg/mL
µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL

Dimasukkan masing-masing 3 ml dalam tabung reaksi berbeda

Reagen DNS 1% 3 ml

Ditutup aluminium foil. Dipanaskan 15 menit pada suhu 90◦C

Garam Rochelle 40% 1
ml

Didinginkan sampai suhu ruang dan diamati absorbansinya pada

panjang gelombang 575 nm

5
IV.4. P
enyiapan kurva standar Nelson-Somogyi
Larutan Larutan Larutan Larutan Larutan Larutan
glukosa 20 glukosa 40 glukosa 60 glukosa 80 glukosa glukosa
µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL 100 µg/mL 120 µg/mL

Dimasukkan masing-masing 1 ml dalam tabung reaksi berbeda

Reagen Nelson 1 ml

Dipanaskan selama 20 menit lalu didinginkan sampai suhu ruang

Reagen Arsenomolybad 1 ml

Diamati absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm

IV.5. Pengukuran kadar gula reduksi sampel

Metode DNS

3 ml sampel

Dimasukkan dalam tabung reaksi

Reagen DNS 1% 3 ml

Ditutup aluminium foil. Dipanaskan 15 menit pada suhu 90◦C

Garam Rochelle 40% 1 ml

Didinginkan dan diamati absorbansinya dengan panjang gelombang

575 nm

6
 Metode Nelson

1 ml sampel

Dimasukkan dalam tabung reaksi

Reagen Nelson 1 ml

Dipanaskan selama 20 menit

Reagen Arsenomolybad 1 ml

Diamati absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm

V. DATA HASIL PENGAMATAN DAN PERHITUNGAN

5.1. Tabel kurva standar DNS

Konsentrasi (µg/ml) Absorbansi (575 nm)

1200 0.557
1000 0.473
800 0.351
600 0.267
400 0.149
200 0.072

A = (-0.0366)
B = 4.972857143 x 10-4
R2 = 0.9968078749
Y = (-0.0366) + 4.972857143 x 10-4 x

Absorbansi sampel = 0.239 (kadar pengenceran 600 kali)

Kadar gula reduksi sampel setelah hidrolisis:
Y = A + Bx
0.239 = (-0.0366) + 4.972857143 x 10-4 x
0.2756 = 4.972857143 x 10-4 x
X = 554.2085607 µg/ml

5.2. Tabel kurva standar Nelson Somogyi

7
 Konsentrasi (µg/ml) Absorbansi (540 nm)
120 1.544
100 1.258
80 1.168
60 0.812
40 0.523
20 0.335

A = 0.0794
B = 0.01229428571
R2 = 0.9849418729
Y = 0.0794 + 0.01229428571 x

Absorbansi sampel = 0.981 (kadar pengenceran 1000 kali)

Kadar gula reduksi sampel setelah hidrolisis:
Y = A + Bx
0.981 = 0.0794 + 0.01229428571 x
0.9016 = 0.01229428571 x
X = 73.33488267 µg/ml

kurva standar DNS

1.8
1.6
1.4 f(x) = 0.01x + 0.08
Absorbansi (575 nm)

1.2 R² = 0.98
1 absorbansi
0.8 Linear (absorbansi)
0.6
0.4
0.2
0
0 20 40 60 80 100120140
Konsentrasi (µg/ml)

8
 kurva standar Nelson-Somogyi
1.8
1.6
1.4 f(x) = 0.01x + 0.08

Absorbansi (540 nm)

1.2 R² = 0.98
1 absorbansi
0.8 Linear (absorbansi)
0.6
0.4
0.2
0
0 20 40 60 80 100120140
Konsentrasi (µg/ml)

VI. PEMBAHASAN
Pada percobaan kali ini bertujuan untuk menentukan kadar gula
reduksi dari bahan yang mengandung karbohidrat dengan dua metode
yaitu metode DNS dan metode Nelson-Somogyi, dimana dengan panjang
gelombang dan pengenceran yang berbeda setiap metode. Metode DNS
menggunakan panjang gelombang 575 nm sedangkan metode Nelson 540
nm. . Pengenceran yang dilakukan lebih besar di metode Nelson-Somogyi,
karena metode Nelson somogyi mempunyai kepekatan yang tinggi,
dimana hal ini dapat menyebabkan tidak terbacanya nilai absorbansi pada
spektrofotometer, sehingga harus di lakukan pengenceran yang tinggi
untuk memudahkan spektrofotometer membaca absorbansi pada larutan
untuk kurva standar maupun sampel. Sedangkan pada metode DNS sendiri
digunakan pengenceran kecil karena dasar larutannya tidak terlalu pekat.
Langkah awal yang dilakukan adalah pembuatan kurva standar yang
bertujuan untuk mendapatkan hubungan antara absorbansi dan konsentrasi
sehingga pengukuran absorbansi larutan dapat digunakan untuk penentuan
kadar gula sampel. Pada metode DNS digunakan Reagen DNS yang terdiri
atas 3,5-dinitrosalicylic acid yang berfungsi sebagai oksidator untuk
mendeteksi adanya gugus pereduksi (gula pereduksi) pada larutan uji dan
akan tereduksi menjadi 3-amino-5- nitrosalicilyc acid, yang memiliki
warna merah kecoklatan sehingga bisa mengindikasikan adanya reaksi
redoks dan memiliki serapan sehingga cocok untuk kolorimetri. Tujuan
penambahan DNS untuk membentuk NO2 tereduksi dan menghasilkan
warna merah bata yang dapat diukur dengan spektrofotometer UV-VIS.
Agar proses reduksi DNS terhadap gula pereduksi berjalan cepat dan
sempurna diperlukan pemanasan pada suhu 90oC selama 15 menit
sehingga diperoleh pembentukan warna yang lebih jelas. Sebelum
pengukuran absoransi, ditambahkan garam Rochelle yang berfungsi untuk

9
 menjaga kestabilan warna yang terbentuk sehingga pengukuran
absorbansinya baik (Miller,1959). Dari kurva standar yang dibuat
2
dihasilkan nilai R sebesar 0.9968078749 dan melalui persamaan regresi
didapati kadar gula peredusi dalam sampel sebesar 554.2085607 µg/mL.
Metode Nelson-Somogyi digunakan untuk penentuan kadar gula
pereduksi. Penentuan gula pereduksi dengan metode Nelson-Somogyi
diawali dengan terjadinya reduksi komponen pereaksi Nelson oleh
glukosa. Ion tembaga (II) dari pereaksi Nelson akan tereduksi oleh glukosa
menjadi tembaga (I). Pemanasan campuran sampel dengan pereaksi
Nelson dimaksudkan untuk mempercepat reaksi dan mempertegas atau
memperjelas warna yang menunjukkan adanya gula pereduksi, adanya
gula pereduksi teridentifikasi dengan adanya endapan merah bata yang
berasal dari tembaga(I) oksida (Cu2O) (Hafimi, 2009). Penambahan
reagen Nelson bertujuan untuk mengoksidasi gua pereduksi yang ada
didalam sampel, sehingga menghasilkan endapan merah bata (Cu2O).
Pemanasan dilakukan untuk mempercepat reaksi. Penambahan reagen
arsenomolibdat ini bertujuan agar bisa bereaksi dengan endapan kupro
oksida. Pada peristiwa ini kupro oksida akan mereduksi kembali
arsenomolibdat menjadi molibdene blue yang berwarna biru, warna biru
inilah yang nantinya akan diukur absorbansinya dengan spektrofotometer.
Pembentukan warna pada metode Nelson-Somogyi lebih sensitif
dibandingkan dengan metode DNS, sehingga larutan diencerkan lebih
banyak yaitu 1000 kali dari larutan yang digunakan untuk metode DNS.
2
Dari kurva standar yang dibuat dihasilkan nilai R sebesar 0.9849418729
dan melalui persamaan regresi didapati kadar gula peredusi dalam sampel
sebesar 73.33488267 µg/mL.
Menurut pengukuran Nelson-Somogyi dan pengukuran DNS, metode
DNS cenderung memberikan hasil yang lebih besar dari pada metode
Nelson-Somogyi karena reagen DNS dapat memicu hidrolisis polisakarida
dalam suhu tinggi. Perbedaan hasil konsentrasi dari sampel dalam kedua
metode juga dapat di pengaruhi oleh serapan panjang gelombang yang
digunakan dimana DNS menggunakan 575nm dan Nelson-Somogyi
menggunakan 540nm sehingga mempengaruhi hasil dari penentuan
konsentrasi gula reduksi dari sampel, selain itu pula perbedaan
pengenceran yang dilakukan juga mempengaruhi hasil yang didapat dalam
penentuan konsentrasi dari gula reduksi.(Gusakov et al.,2011).

VII. KESIMPULAN

10
 Dari hasil percobaan dihasilkan kadar gula reduksi sampel yang
mengandung karbohidrat dengan metode DNS sebesar 554.2085607
µg/mL dan dengan metode Nelson-Somogyi sebesar 73.33488267 µg/mL.

VIII. DAFTAR PUSTAKA

Cox, M.M., dan D.L. Nelson. 2008. Lehninger Principles of
Biochemistry.New York: W.H. Freeman and Company.

Gusakov, A.V., E.G. Kondratyeva., A.P. Sinitsyn. 2011. “Comparison of

Two Methods for Assaying Reducing Sugar in theDetermination
of Carbohydrase Activities”. International Journal of Analytical
Chemistry, Colume 2011, Article ID 283658.
Hu, R., L. Lin., T. Liu., P. Ouyang., B, He., S. Liu. 2008. “Reducing
Sugar Content in Hemicellulose Hydrolysate by DNS Method:
A Revisit”. Journal of Biobased Materials and Bioenergy,
Volume 2, Issue 2, 156-161. Sand Lake City: American
Scientific Pubishers.

Khopkar, S.M. 1990. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta:

Universitas Indonesia.
Miller, G.L. 1959. “Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for
Determination of Reducing Sugar”. Analytical Chem.
31(3),426-428.
Nelson, N., 1944. “A Photometric Adaptation of the Somogyi Method
for the Determination of Glucose”. Journal Biol. Chem, 153(2),
375-379.
Neilson, S.S. 2010. “Introduction to Food Analysis”. Food Analysis,
th
4 Edition. USA: Springer.

11