Pembahasan

1. PCR
2. Dot blok
2. DOT BLOT
 1. TUJUAN mengetahui protein
2.PENGERTIAN DOT BLOT
 Dot Blot adalah sebuah teknik untuk mendeteksi,
menganalisis, dan mengidentifikasi protein. Teknik ini
menyerupai Western Blot namun perbedaannya
adalah protein sampel tidak dipisahkan melalui
elektroforesis akan tetapi ditandai dengan template
sirkuler secara langsung pada substrat kertas.
Konsentrasi protein dalam preparasi mentah atau
kasar (misalnya kultur supernatan) dapat diperkirakan
secara semikuantitatif dengan menggunakan teknik
ini jika dimiliki protein yang terpurifikasi dan antibodi
untuk protein tersebut.
3. METODE
 Menggunakan Metode DOT BLOT
4. PRINSIP
 a) Merupakan metode western blot yang sederhana
 b) Biomolekul dideteksi tanpa pemisahan elektroforesis
seperti pada western blot, tetapi dapat dideteksi langsung
pada sampel yang masih crude.
 c) Sampel diteteskan pada membran, kemudian dideteksi
menggunakan antibodi (primer atau sekunder) seperti
pada western blot.
 d) Teknik ini menghemat waktu, tetapi : tidak diketahui
ukuran dari molekul target dan 2 molekul yang berbeda
terdeteksi sebagai 1 blot.
 e) Dot blot hanya mengkonfirmasi ada atau tidak ada
terhadap molekul target.
5. PENGENALAN ALAT DAN BAHAN
YANG DIGUNAKAN
 1. mikrotube,mikro tip. Mikropipet, disposable spuite,
sentrifus, 1 set alat dot blot,labu ukur, kuvet, gelas
beker.
6. CARA KERJA
 Sampel DNA dimasukkan dalam Eppendorf dengan dibuat seri pengenceran

1ng/µL, 100 pg/µL, 50 pg/µL, 1 pg/µL, 0,1 pg/µL, 0 pg/µL dan dilarutkan sampai

volume 20 µL dengan 6µL 20xSSC fsn 18 µL DW. Sampel cDNA/DNA terlabel

didenaturasi selama 10 menit pada suhu 95°C kemudian segera diambil dan

dimasukkan dalam es agar tidak terjadi reannealing. Membran NC dipasang

pada dot blotter dan sebanyak 1µL DNA/cDNA terlabel (terdenaturasi)

diaplikasikan pada dot blotter. Dot-blotter dihubungkan dengan vacuum

pump selama 15-30 menit sampai semua sampel menempel pada NC. Sampel

diimobilisasi dengan cara menginkubasi NC dalam oven pada suhu 100°C

selama 30 menit. Membran NC direhidrasi dalam DW beberapa menit pada

suhu 37°C.
 1. Tempatkan 1-2 mikroliter antigen ke selaput, biarkan
udara kering selama 30 menit atau lebih.
 2. Diinkubasi dengan buffer pemblokir selama 3o menit
sampai 2 jam.
 3. Bilas dengan penyangga pembilasan 3 x5 menit.
 4. diinkubasi dengan antibodi primer , 30 menit sampai 2
jam.
 5. Bilas dengan penyangga pembilasan 3x5 menit.
 6. Diinkubasi dengan antibodi sekunder berlabel enzim, 30
menit sampai 2jam.
 7. Bilas dengan penyangga pembilasan 3 x5 menit.
 8.Tambahkan substrat enzim, tunggu 5-10 menit.
 9. deteksi dengan mata atau dengan sistem pencitraan
kolorimetri atau chemiluminescent.
7. KESULITAN YANG DIHADAPI
 Tidak memberikan informasi mengenai ukuran bio
molekul target
 Jika dua molekul dengan ukurran yang berbeda
terdeteksi,mereka akan tetap muncul sebagai titik
tunggal
 Dot blot hanya dapat mengkonfirmasi adanya atau
tidak adanya biomolekul yang dapat di deteksi oleh
probe DNA atau antibodi
TERIMA KASIH