ESAI

BIOTEKNOLOGI FARMASI
TOPIK : DNA Amplification (PCR)
JUDUL : Karakteristik primer pada Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk Sekuensing DNA

KELAS : A-B
Susan / 110116019
Rizka hasanah / 110116224
Sylvina herdianti /110116246
Pandora gracya .H. /110116454
Siyani/110116367
Arsymina magfirah .H. /110116066
Zulfikar ali akbar / 110116209

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SURABAYA

2017-2018

Karakteristik Primer pada Polymerase Chain Reaction (PCR)

untuk Sekuensing DNA
 Karakteristik Primer pada Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk Sekuensing DNA

Abstrak
Kesuksesan dalam melakukan desain primer pada Polymerse Chain Reaction (PCR) sangat
dipengaruhi oeh karakteristik primer yang digunakan. Beberapa penelitian mengenai desain primer
telah dilaukan menggunakan berbagai macam algoritma dan karakter primer yang berbeda-beda.
Dengan mengetahui karakteristik primer yang digunakan pada penelitian-penelitian sebelumnya,
diharapkan penelitian selanjutnya dapat lebih memberikan hasil yang kebih signifikan, khususnya
dalam bidang sekuensing DNA. Paper ini bertujuan untuk memberikan panduan untuk mengetahui
beberapa sifat/karakteristik primerr yang signifikan terhadap keoptimuman desain primer.
Harapannya, setelah mengetahui sifat/karakteristik yang signifikan peneliti dapat menghemat waktu
komputasi dengan halnya mempertahankan parameter primer yang memberikan nilai optimal.

Keywords : Polymerase Chain Reaction, desain primer, bioinformatika.

1. Pedahuluan
Bioinformatika adalah disiplin ilmu
baru yang menggabungkan ilmu
kommputer, kimia dan statistika untuk
mengatur, menganalisis, dan
mendistribusikan informasi biologis
untuk menjawab pertanyaan-
pertanyaan kompleks di bidang
biologi. Saat ini banyak tekhnik
analisis molekuler yang digunakan di
seluruh dunia di antaranya: PCR, flow
cutometry, tiddue microarray,
different blots, diagnosis genetic, dll.
Dari bberapa tekhnik tersebut, PCR
adalah tekhnik yang paling diterima
secara luas, umumnya digunakan
untuk melakukan diagnosis yang
membutuhkan spesifitas dan
sensitivitas yang sangat tinggi. PCR
umumnya digunakan dalam berbagai
tugas, seperti deteksi penyakit
keturunan, identifikasi sidik jari
genetik, diagnosis penyakit menular,
kloning gen, pengujian paternitas, dan
komputasi DNA. Untuk membuat
sebuah alat PCR yang spesifik, efektif
dan efesien bagi peneliti maupun
klinis, aspek yang paling penting
adalah melakukan desain pada primer
(desain primer). Primer adalah
molekul oligonukleutida untai tunggal
yang
terdiri atas sekitar 30 basa. Desain
primer yang tepat adalah salah satu
faktor yang paling penting dalam
keberhasilan sekuensing DNA.
Dalam beberapa tahun terakhir,
banyak publikasi yang membahs
telnik-teknik desain primer dalam
bidang sekuensing DNA. Karena
banyaknya penelitian mengenai desain
primer ini, maka perlu adanya literatur
review yang dapat digunakan sebagai
panduan bagi penelitian lain yang
akan meneliti pada bisang yang
sejenis. Khususnya desain primer
dalam sekuensing DNA. Beberapa
literatur review mengenai desain
primer pernah dilakukan sebelumnya.
Pada penelitian dilakukan review
tentang analisis algoritma dan
pembobotan parameter yang
digunakan pada beberapa tools desain
primer. Dari bebrapa literatur review
yang dilakukan sebelumnya belum ada
yang spesifik membahas karakter
primer yang digunakan pada penelitian
Desain Primer. Oleh karena itu,
review ini merangkum beberapa
penelitian sebelumnya untuk
memberikan panduan untuk
mengetahui beberapa sifat/karakter
primer yang signifikan terhadap
keoptimuman desain primer.
2. Materi dan Metode
Keberhasilan reaksi PCR sangat di
tentukan oleh beberapa; (1)
deoksiribonukleutida triphosphat
(dNTP), (2) oligonukleutida primer.
(3) DNA template (cetakan), (4)
komposisi larutan buffer, (5) jumlah
siklus reaksi, (6) enzim yang

2
 Karakteristik Primer pada Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk Sekuensing DNA

digunakan, dan (7) faktor tekhnis dan non-tekhnis lainnya,

misalnya kontaminsi. dan Thermodynamic Basis Sets for
Nearest Neighbor Interactions.
a. Panjang primer
Desain primer yang diperlukan c. Primer Annealing Temperature
untuk PCR adalah sepasang (Ta)
primer yang dikenal dengan Primer Annealing
forward primer dan reverse Temperature (Ta) merupakan suhu
primer.Primer yang diperoleh yang diperkirakan agar primer
merupakan rangkaian basa dapat berkaitan dengan template
nukleotida yang unik dan (DNA) secara stabil. Suhu aneling
diusahakan memiliki ukuran yang tinggi akan menyulitkan
pendek untuk meminimalkan terjadinya ikatan primer sehingga
biaya. Panjang primer berkisar 18- menghasilkan produk PCR yang
30 basa, didasarkan pada kurang efisien. Sebaliknya, suhu
pertimbangan kombinasi acak aneling yang terlalu rendah
yang mungkin ditemukan pada menyebabkan terjadinya
satu urutan genom. Probabilitas penempelan primer pada DNA di
menemukan 1 basa A, G, C atau T tempat yang tidak spesifik.Nilai
pada satu basa adalah ¼ (4-1), suhu aneling yang sebanding
probabilitas menemukan dua basa dengan suhu leleh menyebabkan
sequence (AG, AC, CG, dll) suhu aneling tidak dimasukkan
adalah 1/16 (4-2), probabilitas dalam perhitungan keoptimalan
menemukan 4 basa sequence desain primer.
(ACGT, CGAT, dll) adalah 1/256
(4-4). Sehingga 17 basa primer d. Selisih Primer Melting
secara statistik akan ditemukan Temperature (ΔTm)
sekali dalam setiap 417 basa Pasangan primer sebaiknya tidak
sequence, atau sekitar 17 miliar memiliki selisih suhu leleh yang
basa sequence. Primer dengan tinggi. Pasangan primer dengan
panjang lebih dari 30 basa tidak selisih suhu leleh yang lebih dari
disarankan, karena tidak 5°C menyebabkan penurunan
menunjukkan spesifisitas yang proses amplifikasi, atau bahkan
lebih tinggi. Selain itu, primer memungkinkan tidak terjadi
yang panjang dapat berakibat proses amplifikasi.
terhibridasi dengan primer lain
sehingga tidak membentuk e. GC Content
polimerisasi DNA. Aturan umum yang diikuti oleh
sebagian besar program desain
b. Primer Melting Temperature primer adalah menggunakan
(Tm) persen basa G dan C antara 40%
Primer Melting Temperature hingga 60%
(Tm) atau suhu leleh merupakan
temperatur yang diperlukan oleh f. GC Clamp
primer untuk mengalami Beberapa program mensyaratkan
disosiasi / lepas ikatan. Suhu leleh pasangan primer memiliki basa
primer yang digunakan harus GC pada ujung 3’ dari primer. GC
sama untuk memastikan kinerja Clamp yang dimaksud adalah
yang konsisten pada pasangan ujung C, G, CG atau GC, yang
primer. Terdapat beberapa diyakini membuat hibridisasi lebih
formula yang dapat digunakan stabil.Namun perlu dihindari lebih
untuk menghitung suhu leleh dari 3 basa G atau C pada 5 basa
primer, Wallace’s Formula, terakhir ujung 3′ karena ujung 3′-
Bolton and McCarthy’s Formula nya bisa melipat membentuk

3
 Karakteristik Primer pada Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk Sekuensing DNA

struktur dimer yang -5 kcal/mol dan self- dimer pada

mengakibatkan ujung 3′ primer bagian internal dengan ΔG= -6
tidak terikat pada template. kcal/mol masih dapat ditoleransi.
Penelitian yang Primer yang berikatan dengan
mempertimbangkan struktur primer pasangannya (reverse dan
hairpin untuk desain primer. forward) disebut dengan Cross-
Dimer. Cross-dimer pada ujung 3’
g. Secondary Structures dengan ΔG= -5 kcal/mol dan self-
Reaksi PCR sebaiknya tidak dimer pada bagian internal
mengandung secondary structures dengan ΔG= -6 kcal/mol masih
berupa hairpin atau dimer. dapat ditoleransi.
Stabilitas secondary structure
ditentukan oleh energi bebas (ΔG) h. Self-complementary (SC) dan
dan suhu lelehnya. Hal ini Pair-Complementary (PC)
menyebabkan primer tidak dapat Selain secondary structures,
menempel dengan template DNA. complementary pada primer dan
1) Hairpin pasangan primer juga harus
Hairpin adalah struktur dihindari. Self complementary
yang dibentuk oleh basis dapat menyebabkan struktur
pasangan asam hairpin yang stabil hanya dengan 4
polynucleic antara urutan pasangan basa GC pada ujung
komplementer untai maupun bagian tengah primer.
tunggal baik DNA Primer harus berisi kurang dari 4
maupun RNA. basa komplementer, terutama pada
Terbentuknya struktur ujung 3’. Pair complementary
loop /hairpin pada primer terutama pada ujung 3’ primer
sebaiknya dihindari, dapat menyebabkan struktur
namun sangat sulit untuk dimer.
memperoleh primer tanpa
memiliki struktur haripin. i. Repeats & Run
Hairpin pada ujung 3' Perulangan yang cukup
dengan ΔG(energy yang panjang dengan basa sama (lebih
dipelukan untuk memecah dari tiga basa berurutan sama,
struktur hairpin) = -2 misal basa AGCGGGGGATG
kcal/mol dan hairpin memiliki 5 basa berurutan G)
internal dengan ΔG = -3 harus dihindari karena dapat
kcal/mol masih dapat menyebabkan terjadinya breathing
ditoleransi. pada primer dan mispirming,
Kedua primer sebaiknya sehingga proses penempelan
tidak memiliki basa primer menjadi sulit. Primer
nukleotida T pada ujung sebaiknya juga tidak memiliki
3’-nya karena dapat urutan pengulangan dari 2 basa
menyebabkan dan maksimum pengulangan 2
mismatch/ketidakcocokan. basa sebanyak 4 kali masih dapat
Banyaknya mismatch atau di toleransi. Misalnya
mismatch pada ujung 3’- ATATATAT Hal ini juga
primer juga dapat menyebabkan terbentuknya
menyebabkan hairpin. struktur hairpin.
2) Self Dimer dan Cross
Dimer
Primer yang berikatan dengan j. Specificity atau keunikan
primer lainnya yang sejenis Primer merupakan rangkaian
disebut dengan self-dimer. Self- basa nukleotida yang berasal dari
dimer pada ujung 3’ dengan ΔG = template/DNA target. Primer yang

4
 Karakteristik Primer pada Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk Sekuensing DNA
baik adalah rangkaian basa
nukleotida yang unik pada
template tersebut, sehingga tidak
terdapat pada sequence atau lokasi
lain pada template. Bahkan
sebaiknya untuk menghindari
cross homologi, primer dilakukan
analsis melalui BLAST-NCBI
untuk mengetahui bahwa primer
yang digunakan benar-benar unik
dan tidak menempel pada
organisme lain. Penelitian yang
mempertimbangkan specificity
dalam desain primer.
k. Product Lenght
Jarak antara ujung 5’ kedua
primer dikenal dengan istilah
amplicon atau product length.
Pada umumnya, product length
product length yang digunakan
adalah <2000 basa. Jarak ini
dirasa cukup untuk proses
amplifikasi pada template.
l. Restriction Site
Restriction Site diberikan jika
diperlukan. Untuk kasus primer
yang memiliki restriction site,
algoritma tertentu digunakan
untuk memeriksa kesamaan pola
dari ujung 5’ ke ujung 3’ primer,
dan memproses apakah terdapat
enzim sesuai restriction yang
diberikan atau tidak. Seperti dalam
penelitian terdahulu [2], jika
terdapat restriction site yang sama
(panjang pola primer yang cocok,
kurang dari atau sama dengan
panjang enzim restriksi, dan lebih
dari atau sama dengan panjang
enzim restriksi minus 3 [(Le-3)≤|
Pm≤Le] ), maka algoritma yang
digunakan akan menyesuaian nilai
yang dimiliki untuk proses seleksi
primer yang optimal.
3. Hasil
Pada review ini, penulis
merangkum karakteristik primer yang
digunakan untuk masing-masing
penelitian sebelumnya. Materi
penelitian adalah penelitian terdahulu
sejak tahun 2001 hingga 2014.
5
Penelitian yang ditinjau adalah
penelitian-penelitian dari berbagai
jurnal, konferensi dan publikasi
internasional seperti jurnal
Bioinformatics, IEEE, GECCO, dll.
4. Diskusi
Diketahui bahwa GC Content dan
Struktur Dimer menjadi hal yang
selalu dilibatkan dalam penelitian. GC
Content berperan dalam meningkatkan
stabilitas primer. Ikatan hidrogen yang
kuat pada pasangan basa G dan C
menyebabkan primer lebih stabil
untuk menempel pada template,
sehingga GC Content disarankan
berkisar antara 40% hingga 60%.
Struktur dimer dapat terjadi apabila
primer memiliki banyak basa
komplementer. Jika ikatan basa
komplementer lebih stabil
dibandingkan ikatan primer dan
template, bahkan dengan suhu aneling
yang tinggi, maka primer tidak dapat
berikatan dengan template. Sehingga
produk PCR yang dihasilkan akan
berkurang secara signifikan.
Primer Annealing Temperature
(Ta) atau suhu aneling dan perulangan
basa secara berurut tidak digunakan
sebagai batasan desain primer pada
penelitian. Nilai suhu aneling yang
sebanding dengan suhu leleh
menyebabkan suhu aneling tidak
digunakan sebagai sifat/kriteria yang
dipertimbangkan dalam mendesain
primer oleh penelitian yang ditinjau.
Sementara perulangan basa secara
berurut hanya disarankan untuk
dihindari, dan lebih menekankan pada
terbentuknya struktur hairpin yang
menjadi akibat adanya perulangan
basa secara berurut.
Hal yang cukup menarik terjadi
karena beberapa penelitian sebelum
2007 mempertimbangkan karakteristik
panjang primer, namun selanjutnya
karakteristik panjang primer
digantikan dengan selisih panjang
forward primer dan reverse primer.
Pada penelitian yang dilakukan oleh
Kampke dkk dan Wu dkk
menggunakan panjang primer 16-28
basa. Penelitian dan tidak
 Karakteristik Primer pada Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk Sekuensing DNA

menyebutkan panjang primer yang harapan pasangan primer akan

digunakan, hanya menyarankan menempel di template pada suhu yang
meminimalkan panjang primer untuk sama. Penelitian Yang dkk
meminimalkan biaya. Sementara menggunakan kedua formula Bolton
penelitian lain tidak menggunakan and McCarthy’s dan Wallace’s,
panjang primer sebagai batasan bahkan membandingkan akurasi
langsung, melainkan menggunakan keduanya. Hasil penelitiannya
selisih panjang forward primer dan menyebutkan Wallace’s Formula
reverse primer. Primer yang panjang memberikan hasil yang lebih akurat
memiliki spesifisitas tinggi dan suhu dibandingkan Bolton and McCarthy’s
leleh yang tinggi dengan biaya yang Formula.
lebih mahal, namun primer yang lebih Secara algoritma, beberapa
pendek memiliki spesifisitas rendah penelitian tersebut dilakukan
dengan biaya yang lebih murah. Hal menggunakan berbagai algoritma
ini yang menjadi pertimbangan Yang untuk merancang desain primer PCR
dkk untuk tidak mempertimbangkan yang optimal. Penelitian terkait
panjang primer dalam penelitiannya. interaksi oligonukleotida untuk PCR
Sebagai penggantinya, untuk tetap pasangan primer, menjadi dasar dalam
mempertahankan stabilitas primer, pengembangan berbagai algoritma
Yang dkk mengganti sifat/kriteria yang digunakan untuk desain primer
menjadi selisih panjang primer dengan pada PCR. Penelitian terkait desain
batas optimum 3 basa. primer optimum yang memperhatikan
Selain itu, dari beberapa penelitian sifat-sifat / karakteristik yang
tersebut mempertimbangkan melting diperlukan dalam suatu primer telah
temperature / suhu leleh, sementara dilakukan menggunakan metode
beberapa lainnya memprioritaskan Genetic Algorithm, Memetic
pada selisih suhu leleh pasangan Algorithm, Gravitational Seacrh
primer. Hal in cukup menarik untuk Algorithm. Penelitian telah
dicari tahu mengenai formula mana dikembangkan hingga desain primer
yang lebih akurat untuk menghitung untuk modifikasi PCR, Multiplex
suhu leleh. Pada penelitiannya, PCR. Multiplex PCR merupakan
Kampke dkk menggunakan modifikasi PCR untuk mendeteksi
Thermodynamic Basis Sets for Nearest penghapusan atau duplikasi secara
Neighbor Interactions untuk cepat pada jumlah gen yang besar.
menghitung suhu leleh, sementara
penelitian lain lebih memilih PUSTAKA
menggunakan Wallace’s Formula.
Beberapa penelitian menganggap suhu T. Yuwono, Teori dan Aplikasi Polymerase
leleh sebagai salah satu Chain Reaction. Andi Publisher, 2007.
sifat/karakteristik yang perlu F. J. Burpo, “A critical review of PCR primer
dipertimbangkan, namun tidak design algorithms and cross- hybridization
menyebutkan metode yang digunakan case study,” pp. 1–12, 2001.
dalam penelitiannya. Selain itu juga K. A. Abd-elsalam, “Minireview
ada penelitian yang tidak Bioinformatic tools and guideline for PCR
menggunakan suhu leleh sebagai primer design,” vol. 2, no. May, pp. 91–95,
sifat/karakteristik desain primer yang 2003.
dipertimbangkan. Penelitian Wu dkk F.-M. Lin, H.-D. Huang, H.-Y. Huang, and J.-
tidak mempertimbangkan suhu leleh T. Horng, “Primer design for multiplex PCR
pada desain primer, namun using a genetic algorithm,” Proc. 2005 Conf.
menggantinya dengan selisih suhu Genet. Evol. Comput. - GECCO ’05, p. 475,
leleh. Wu dkk mempertimbangkan 2005.
bahwa selisih suhu leleh sepasang Seminar Nasional Informatika Medis
primer tidak boleh lebih dari 5°C. Hal (SNIMed) V 2014.
ini dijadikan pertimbangan dengan