LAPORAN PRAKTIKUM

DRY LAB BIOLOGI SEL DAN MOLEKULER

ACARA V
DESAIN PRIMER UNTUK PCR (Polymerase Chain Reaction) pada
Homo sapiens muscarinic reseptor (CHRM5) mRNA, complete cds

Disusun Oleh:

Maria Carolina Loy Nau 168114066

Maria Precilia 168114067
Winarti Rambu Tagu Dima 168114068
Susan Ayu Lestari 168114069

Hari/Tanggal : Rabu, 2 November 2016

Dosen Jaga : Ign. Sudaryadi, M.Kes
Asisten : Felicita eka
Reynaldo tiara

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2016
 ACARA V
DESAIN PRIMER UNTUK PCR (Polymerase Chain Reaction) pada
Homo sapiens muscarinic reseptor (CHRM5) mRNA, complete cds

TUJUAN PRAKTIKUM :

1. Memahami dan menjelaskan Polymerase Chain Reaction (PCR) dan

aplikasinya dalam bidang kefarmasian
2. Mendesain urutan DNA primer sesuai dengan urutan gen yang
diinginkan

Dasar teori
PCR (Polymerase Chain Reaction), merupakan teknik perbanyakan
(amplifikasi) potonan DNA secara In vitro. Teknik PCR ini sangat
berguna untuk berbagai macam analisis DNA untuk berbagai macam
kepentingan antara lain penelitian, forensic dan diagnosis penyakit.
Jumlah DNA yang diisolai dari jumlah sampel jumlahnya terbatas
sehingga tidak dapat langsung dideteksi. Dalam bidang penelitian, PCR
dapat digunakan untuk membandingkan urutan nukleotida pada
spesies yang berbeda. Dalam bidang forensik, PCR dapat
memperbanyak DNA yang digunakan untuk identifikasi pelaku atau
korban pembunuhan atau kecelakaan. Selain itu, PCR dapat membantu
untuk diagnosis penyakit yang terjadi akibat mutasi pada tingkat DNA.
Reaksi dalam PCR pada dasarnya adalah reaksi replikasi DNA
secara semi-konservatif. DNA memerlukan primer dalam sintesis strand
DNA baru karena enzim DNA polymerase tidak dapat mensintesis DNA
secara de novo. Mekanisme PCR sebagai berikut: DNA cetakan
dikendorkan dengan enzim topoisomerase dan dibuka oleh enzim
helikase, DNA baru disintesis oleh enzim DNA polymerase. Seperti
halnya replikasi DNA, reaksi dalam PCR membutuhkan primer. Selain
 itu juga dibutuhkan DNA sampel yang digunakan sebagai template,
Taq polymerase, deoksiribonukleotida (dNTP) dan buffer.
Perbedaannya, pada PCR pembukan double strand DNA dilakukan
dengan manipulasi suhu reaksi. PCR tergantung kemampuan primer
berhibridisasi secara spesifik pada DNA target. Secara umum, proses
PCR dibagi menjadi 3 tahap yaitu:
1. Denaturasi
Adalah pemisahan double stranded DNA menjadi single stranded
DNA. Denaturasi dilakukan dengan menaikkan suhu tabung reaksi
sampai dengan 95º C. tabung reaksi ini berrisi DNA yang
diamplifikasi, primer, enzim Taq polymerase dan buffer.
2. Penempelan primer (annealing/ hibridisasi)
Suhu rekasi diturunkan hingga antara 37-60º C. pada tahap ini
diperlukan optimasi suhu supaya primer dapat menempel pada
sekuen DNA target yang akan diamplifikasi. Hibridisasi primer pada
oligonukleotida target dipengaruhi oleh kekuatan ionic (konsentrasi
ion K+ dan Mg2+ dalam buffer) dan suhu. Suhu hibridisasi perlu
dioptimasi supaya primer dapat menempel tepat pada DNA target.
Suhu hibridisasi sangat dipengaruhi oleh desain primer yang
digunakan oleh PCR.
3. Polimerisasi
Pada tahap ini terjadi perpanjangan rantai DNA pada ujung 3-OH
bebas pada primer. Suhu reaksi kembali dinaikkan menjadi 72º C.

Jenis PCR ada 4 macam; antara lain: Real time/quantitative PCR, Nested
PCR, Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) PCR dan Reserve
transcript (RT) PCR. Real time PCR merupakan PCR yang dapat digunakan
untuk tujuan kuantitatif sehingga disebut kuantitatif PCR (q-PCR). Pada
PCR konvensional, data yang diperoleh berupa data kuantitatif. Real time
PCR merupakan PCR yang dapat digunakan untuk tujuan kuantitatif
sehingga disebut kuantitatif PCR yang bertujuan untuk mengurangi resiko
kontaminasi akibat primer salah menempel. Pada PCR kovensional, primer
menempel pada terminasi DNA target. Problem yang sering muncul adalah
penempelan primer pada sekuen non spesifik sehingga kemungkinan
terjadi positif palsu. Nested PCR menggunakan 2 pasang primer selama
proses PCR, primer kedua bertujuan mengamplifikasi DNA target yang
berada diantara DNA target amplifikasi pertama. Dengan demikan, sekuen
DNA yang diperbanyak lebih spesifik.
Reverse transcript-PCR ( RT-PCR ) merupakan PCR yang
mengunakan sampel mRNA untuk diamplifikasi. Molekul mRNA kemudian
ditranskripsi balik menjadi cDNA yang kemudian diamplifikasi
menggunakan teknik PCR. Teknik PCR yang lain adalah retriction fragmen
length polymorphism PCR (RFLP PCR) menggunakan teknik ampifikasi PCR
secara umum. Pada akhir proses PCR, DNA hasil PCR dipotong
menggunakan enzim retriksi. RFLP PCR beruna untuk membedakan DNA
yang mengalami mutasi pada basa tertentu. Berbagai macam penyakit
yang disebabka oleh mutasi dapat dideteksi menggunakan RFLP PCR.
Dilakukan desain primer dengan tujuan untuk mendapatkan primer
yang spesifik supaya hanya dapat memperbanyak daerah DNA yang
diinginkan. Metode PCR dapat meningkatkan jumlah urutan DNA ribuan
bahan jutaan kali dai jumlah semula. Primer dapat disusun secara manual.
Primer akan disintesis sebagai oligonukleotida sepanjang 15-32 bp dengan
urutan dari ujung 5’ ke ujung 3’ dan primer ini harus mampu mengenali
urutan yang diamplifikasi. Untuk standar amplifikasi sepanjang primer
mempunyai kisaran pasangan basa sekitar 20 basa panjangnya pada tiap
primernya.
Beberapa syarat yang harus dipenuhi oleh primer yang baik antara
lain: urutan primer mengandung basa GC sebanyak 45-60%. Primer yang
kandungan GCnya kurang dari 50% perlu diperpanjang menjadi lebih dari
18 basa sehingga Tm menjadi diatas 50ºC. presentase GC, selain
mempengaruhi Tm juga suhu annealing (temperature annealing-TA).
Ujung-3’ dari setiap primer harus G atau C, tetapi hindari susunan
nukleotida G/C berturut-turut tiga pada ujung ini, misal CCG, GCG, GGC,
GGG, CCC, GCC. Ujung 3’ penting untuk menghindari miss-priming.
Urutan basa dalam primer tidak saling komplementer sehingga
membentuk dimer-primer, berikatan satu sama lain, atau membentuk
hairpins. Selain itu, untuk menghindari menyusun primer pada daerah
DNA repetitive. Selain itu, faktor homologi urutan nukleotida dengan
urutan DNA target sangat mempengaruhi kestabilan ikatan keduanya.
Semakin tinggi presentase homologi semakin stabil ikatan yang terbentuk.
Penempelan (annealing) suatu primer terhadap DNA target
tergantung pada ujung untai, banyaknya kandungan GC, dan konsentrasi
primer itu sendiri. Optimalisasi annealing temperature dihitung dengan
kalkulasi melting temperature (Tm) dari ikatan primer dan DNA tempelate.
Annealing temperature sangat tergantung pada primer dengan Tm
tertentu. Cara melting temperature dapat menggunakan persamaan
matematika sebagai berikut:
Tm= {(G+C)x4} + {(A+T)x2}
Annealing temperature umumnya 5ºC kebawah Tm primer yang
sebenarnya. Secara praktis, Tm ini dipengaruhi oleh komponen uffer,
konsentrasi primer, dan DNA template.
Dewasa ini, desain primer dilakukan dengan menggunakan
software baik pada computer maupun website secara online. Software
yang digunakan untuk bidang biologi memberikan wacana tersendiri pada
bidang bioinformatika. Dalam buku ini ditunjukkan salah satu cara
mendesain primer yang sederhana menggunakan basis data online tidak
berbayar.
Hasil praktikum dan pembahasan

Buka situs NCBI http://www.ncbi.nlm.nim.gov/

Pada kolom search pilih Nucleotide karena kita akan mencari DNA.
Jika ingin mencari asam amino maka bisa mengklik pilihan protein pada
kolom search. Karena pada praktikum kali ini untuk mencari DNA maka
pilih Nucleotide pada kolom search dan isi nama gen yang ingin dicari
yaitu Muscarinic Receptor

Hasil pencaharian akan muncul. Klik salah satu gen yang

diinginkan. Untuk mengetahui Muscarinic Receptor pada manusia, pilih
hasil pencaharian tentang gen yang dicari pada Homo Sapiens.

Reseptor Muscarinic merupakan membrane ikatan protein dengan

domain ekstraseluler yang berisi situs pengenalan untuk asetilkolin (Ach);
Kombinasi Ach dengan reseptor memulai perubahan fisiologis
(memperlambat denyut jantung, peningkatan aktivitas sekretori kelenjar,
dan stimulasi kontraksi otot polos); Perubahan diamati setelah
pengobatan dengan muscarine jamur alkaloid. Reseptor muscarinic harus
dibedakan dari reseptor nicotinic. Reseptor muscarinic secara luas
didistribusikan ke seluruh tubuh manusia memperantai fungsi fisiologis
yang berbeda sesuai dengan lokasi dan reseptor subtipe ( Caulfield &
Birdsall, 1998). Sampai saat ini ada lima subtipe berbeda dari reseptor
muscarinic (M1-M5), meskipun lokasi yang tepat dan peran fungsional
semua subtipe ini sampai saat ini belum dijelaskan secara penuh. Secara
khusus, reseptor ini mungkin memiliki peran yang berbeda-beda namun
penting dalam sistem tubuh yang sama, dengan potensi interaksi antara
subtipe. Dengan demikian, pemahaman yang menyeluruh tentang
perbedaan subtipe reseptor muscarinic sangat penting.

Pilih pick primers yang terdapat pada bagian kanan. Maka jendela
primer BLAST akanterbuka.
 Scroll halaman hingga bagian terbawah. Klik get primers. Primer
merupakan untai pendek RNA atau DNA yang berfungsi sebagai titik awal
untuk sintesis DNA. Primer biasanya memiliki panjang 10-25 basa.

Tersedia 2 pilihan reseptor Muscarinic pada homo sapiens yaitu

variant 1 dan variant 2. Klik pada Homo sapiens cholinergic receptor
muscarinic 5 (CHRM5), transcript variant 1, mRNA. Homo sapiens
cholinergic receptor muscarinic 5 (CHRM5), transcript variant 1, mRNA.
Merupakan Reseptor kolinergik muskarinik berasal keluarga besar
pasangan reseptor protein. Keragaman fungsional reseptor ini
didefinisikan oleh pengikatan asetil kolin dan termasuk respon seluler
seperti penghambatan adenilat siklase, phosphoinositide degenerasi, dan
saluran kalium mediasi. Reseptor muscarinic mempengaruhi banyak efek
asetilkolin di sistem saraf pusat dan perifer. Implikasi klinis reseptor ini
tidak diketahui; Namun, stimulasi reseptor ini dikenal untuk meningkatkan
tingkat AMP siklik.

Hasil pencaharian akan menampilkan grafik yang menunjukkan

beberapa pasangan primer pada gen Muscarinic Receptor
 Beberapa syarat yang harus dipenuhi primer yang baik antara lain :
Urutan primer mengandung urutan basa GC sebanyak 45-60% . Pada
forward primer diatas mengandung basa GC sebanyak 55,00 % dan
reserve primer mengandung 60,00% basa GC. Melting temperature nya
harus diatas 500C. Melting temperature forward primernya yaitu 59,960 C
dan melting temperature untuk reserve primernya yaitu 59,97 0 C.
memenuhi syarat karena diatas 50 0 C.
Ujung 3’ dari setiap primer harus G atau C, tetapi hindari susunan
nukleotida G/C berturut-turut tiga pada ujung ini misal CCG, GCG, GGC,
CCC, GGG, GCC. Pada primer pasangan 7 ujung 3’ nya berakhir dengan G
dan tidak bersusunan G atau C tiga berturut-turut.
Memiliki 17-28 basa. Pada Primer pasangan 7 Muscarinic Receptor
memiliki panjang 20 pasang basa. Jadi dapat disimpulkan bahwa primer
pasangan 7 merupakan primer yang baik karena memiliki syarat-syarat
sebagai primer yang baik.
 Beberapa syarat yang harus dipenuhi primer yang baik antara lain :
Urutan primer mengandung urutan basa GC sebanyak 45-60% .
Pada forward primer pasangan primer diatas mengandung basa GC
sebanyak 60,00 % dan reserve primer mengandung 60,00% basa GC.
Melting temperature nya harus diatas 500C
Melting temperature forward primernya yaitu 60 0 C dan melting
temperature untuk reserve primernya yaitu 59,96 0 C. memenuhi syarat
karena diatas 50 0 C.
Ujung 3’ dari setiap primer harus G atau C, tetapi hindari susunan
nukleotida G/C berturut-turut tiga pada ujung ini misal CCG, GCG, GGC,
CCC, GGG, GCC. Pada primer pasangan 8 ujung 3’ nya berakhir dengan G
dan bersusunan G atau C tiga berturut-turut yaitu pada reserve primernya
GGG.
Memiliki 17-28 basa. Pada Primer pasangan 8 Muscarinic Receptor
memiliki panjang 20 pasang basa. Jadi dapat disimpulkan bahwa primer
pasangan merupakan primer yang tidak baik karena melanggar salah
satu syarat primer yang baik yaitu susunan nukleotidanya.
 DISKUSI

1. Sebutkan aplikasi PCR dalam dunia kesehatan :

 Aplikasi PCR dalam dunia kesehatan identifikasi penyakit genetic:
Mengetahui segmen DNA dari pasien yang menderita penyakit mutasi
genetik, analisis fosil. Aplikasi yang menarik dari PCR adalah analisis DNA
dari fosil, seperti penemuan fosil Gajah purba di Belanda. Aplikasi DNA
biasa dilakukan dalam mempelajari susunan dari ekspresi gen.
2. Mengapa dalam PCR diperlukan Primer :
 Karena primer berfungsi sebagai pembatas fragmen DNA target yang akan
diamplifikasi dan sekaligus menyediakan gugus hidroksi pada ujung 3’
yang diperlukan untuk proses eksistensi DNA.
3. Sebutkan dan jelaskan 4 jenis PCR :
 Real time/quantitative PCR merupakan PCR yang dapat digunakan untuk
tujuan kuantitatif sehingga disebut quantitative PCR. Quantitative PCR
juga digunakan untuk pengukuran berulang dari hasil produk PCR. Metode
ini secara tidak langsung digunakan untuk mengukur kuantitas, dimulai
dari jumlah DNA, cDNA atau RNA. Hasil dari metode ini juga menunjukan
copy dari sampel.
 Nested PCR merupakan modifikasi PCR yang bertujuan untuk mengurangi
resiko kontaminasi akibat primer salah menempel. Proses ini juga
memungkinkan untuk menurangi kontaminasi pada produk selama
amplifikasi dari penyatuan primer yang tidak diperlukan. Dua set primer
digunakan untuk mendukung metode ini, set kedua mengamplifikasi
target kedua selama proses pertama berlangsung. Sekuens DNA target
dari satu set primer yang disebut primer inner disimpan diantara sekuens
target set kedua dari primer yang disebut sebagai outher primer. Pada
prakteknya, reaksi pertama dari PCR menggunakan outher primer, lalu
reaksi PCR kedua dilakukan dengan inner primer atau nested
primermenggunaan hasil dari produk reaksi yang pertama sebagai target
amplifikasi. Nested primer akan menyatu dengan produk PCR yang
 pertama dan menghasilkan produk yang lebih pendek dari produk yang
pertama.
 Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) PCR metode ini
digunakan untuk membedakan organisme berdasarkan analisis model
derifat dari perbedaan DNA.
 Reverse Transcript (RT) PCR merupakan PCR yang menggunakan sampel
mRNA untuk diamplifikasi. Molekul mRNA kemudian ditranskripsi balik
menjadi cDNA yang kemudian diamplifikasi menggunakan teknik PCR.
4. Mengapa mendesain primer adalah kunci keberhasilan proses PCR :
karena dilakukan desain primer dengan tujuan untuk mendapatkan primer
yang spesifik supaya hanya dapat memperbanyak daerah DNA yang
diinginkan.
5. Sebutkan syarat primer yang baik:
 Urutan primer mengandung urutan basa GC sebanyak 46-60%. Primer
yang kandungan GC-nya kurang dari 50% perlu diperpanjang menjadi
lebih dari 18 basa sehingga Tm menjadi diatas 500C.
 Ujung 3’ dari setiap primer harus G atau C, tetapi hindari susunan
nukleotida G/C berturut-turut tiga pada ujung ini, misal CCG, GCG, GGC,
CCC, GCC.
DAFTAR PUSTAKA

Chem, 2015, Jurnal J.Biol, Inggris, hal, 240-245.

Fatchiyah, 2014, Prinsip Dasar Bioinformatika, Universitas Brawijaya Press,
Malang, hal. 42-45.
Marchler, Bauer, 2015, NCBI database yang domain dilestarikan, Inggris,
hal. 200-220.
Setiawati, Agustina, 2015, Aplikasi NCBI Dalam Bioinformatika, Sanata
Dharma University Press, Yogyakarta, hal. 31-45.
Stansfield, William, 2003, Biologi molecular dan sel, Erlangga, Jakarta,
hal. 59-67.