BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 BAHAN PENELITIAN

Penelitian ini memerlukan daftar data senyawa aktif Herba Sambiloto dan
data protein target. Daftar data dari senyawa-senyawa aktif herba sambiloto
diperoleh dari database Dr. Duke’s Phytochemical and Ethnobotanical Database,
PubChem, Ijah, KNAPSACK, dan FoodDB, daftar protein-protein target
diperoleh dari Swiss TargetPrediction dan STITCH. Penelitian ini juga
memerlukan gambar struktur 3D senyawa-senyawa aktif yang diperoleh dari
database PubChem dan ligand yang diperoleh dari protein data bank (PDB).

3.2 ALAT PENELITIAN

Alat yang digunakan pada penelitian sebagai berikut antara lain Perangkat
komputer yang digunakan adalah Acer E 14 X dengan spesifikasi Intel Prosesor
Core™ i3-6006U, NVIDIA® GeForce™ 940mx, Ram 4GB, Windows 10.1;
database senyawa-senyawa aktif Dr. Duke’s Phytochemical and Ethnobotanical,
PubChem, IJAH, KNApSAcK; database protein-protein target Swiss
TargetPrediction, STITCH, KEGG Pathway; database fungsi aktivitas senyawa-
protein PASS Online dan STRING; Database protein ligand PDB (protein data
bank); Program Cytoscape versi 3.7.1; program molekular docking PyRx versi
0.8, PyMOL versi 2.3.1, BIOVIA 2017.

3.3 PROSEDUR KERJA PENELITIAN

3.3.1 Penyiapan Senyawa Aktif pada Herba Sambiloto
Senyawa aktif dibuat dalam bentuk berkas (file) dengan format file .xlsx,
senyawa aktif pada Herba Sambiloto didapatkan melalui database. Database yang
digunakan dalam penyiapan senyawa aktif pada Herba Sambiloto adalah Dr.
Duke’s Phytochemical and Ethnobotanical database, PubChem, Ijah,
KNAPSACK, dan FoodDB.
3.3.2 Pengecekkan Nama Lain dari Senyawa Aktif yang Ditentukan
Pengecekkan nama lain dari senyawa aktif Herba Sambiloto yang
ditemukan bertujuan agar data dari senyawa aktif tidak bias. Nama senyawa aktif
yang telah ditemukan dari database seperti Dr. Duke’s Phytochemical and
Ethnobotanical, IJAH, KNApSAcK dicek kembali kesamaannya dengan
menggunakan bantuan PubChem.

3.3.3 Penyiapan Protein Target yang Berperan dalam imunomodulator

Senyawa aktif yang telah ditemukan kemudian di masukan ke database
pencarian protein seperti Swiss TargetPrediction dan STITCH database, lalu
dilakukan pengecekan informasi protein yang berikatan dengan senyawa aktif
menggunakan databse seperti GeneCards, dan KEGG Pathway sehingga
ditemukan protein target yang berperan dalam imunomodulator. Data protein
target yang akan digunakan sebagai reseptor uji diunduh dari situs resmi Swiss
TargetPrediction (new.swisstargetprediction.ch) dengan format “.pdf”, dan
STITCH database (stitch.embl.de) dengan format “.pdf”. Cara pencarian pada
database Swiss TargetPrediction dilakukan dengan memasukan canocial SMILES
senyawa aktif yang diperoleh dari database PubChem, sedangkan pada database
STITCH dilakukan pencarian dengan menggunakan seluruh senyawa aktif.
Bentuk struktur dari protein target di unduh dari situs resmi protein data bank
(www.rscb.org) dengan format “.pdb”.

3.3.4 Intergrasi Senyawa Aktif dengan Protein Target Menggunakan

Program Cytoscape
Data protein target dan senyawa aktif yang telah di peroleh melalui
database dicek topologi dan analisis network melalui aplikasi Cytoscape. Dan
didapatkan data berupa format “csv”.
3.3.4.1 Import Data Senyawa Protein
Import data network senyawa-protein yang telah diperoleh dari berbagai
database, kemudian pilih create new network collection dan definisikan tipe data
untuk setiap atribut, ada tujuh atribut yaitu senyawa, protein, CAS_ID, CID,
molecular formula, Immunomodulator. Menghitung degree, betweenness,
closeness untuk interaksi senyawa protein dengan memilih menu tools, network
analyzer, network analysis, dan pilih analyze network. Untuk menampikan atribut
yang diinginkan pilih panel tabel lalu pilih atribut BetweennessCentrality,
ClosnessCentrality, Degree, Immunomodulator, name. Pengamatan dilakukan
dengan pengurutan pada atributnya.

3.3.4.2 Penyususnan Senyawa Utama

Langkah pertama yang dilakukan membuat filter dengan cara pada control
panel pilih menu select lalu create new filter diberikan nama “Protein_senyawa”,
lalu klik (+) dan pilih Column filter. Langkah selanjutnya pilih node
Immunomodulator, setelah itu kita filter degree-nya dengan cara klik (+), pilih
degree filter dengan between 25 dan 38, lalu klik apply maka akan muncul hasil
yang diinginkan. Langkah selanjutnya pemberian warna cara pada control panel
pilih style ubah warna pada fill color lalu isikan dengan column
Immunomodulator, dan Mapping Type diisi dengan Discrete Mapping maka akan
berubah tampilan warna senyawa utama.

3.3.4.3 Penyusunan Subnetwork Senyawa Utama dan Protein Dominan

Menyusun subnetwork dengan cara klik chain lalu klik Create New Filter
beri nama “Senyawa_protein” lalu ke menu start with kita pilih Protein_Senyawa,
klik (+), lalu pilih node adjacency transformer, lalu klik apply, langkah terakhir
pilih menu file dan pilih from selected nodes, selected edges dari menu new
network, lalu hasil akan muncul.

3.3.5 Pencarian Aktivitas Biologi Senyawa dengan Database PASS Online

Proses pencarian aktivitas biologi senyawa di awali dengan membuka web
PASS Online (pharmaexpert.ru/passonline) dan memasukan canocial SMILES
senyawa aktif, lalu memilih aktivitas biologi senyawa yang memiliki aktivitas
terhadap imunomodulator dan kita ambil nilai Pa. Data yang telah di ambil lalu di
simpan dalam exel.
3.3.6 Pencarian Aktivitas Biologi Protein dengan Database STRING
Proses pencarian aktivitas biologi protein di awali dengan membuka web
STRING (string-db.org) dan memasukkan daftar protein ke database STRING,
lalu pilih biological process pada menu analysis, dan kita pilih aktivitas protein
yang memiliki aktivitas terhadap imunomodulator dan download network image
pada menu exports. Data yang telah di ambil lalu di simpan dalam exel.

3.3.7 Molecular Docking dengan Menggunakan Program PyRx, PyMOL,

dan BIOVA
Langkah pertama yang dilakukan untuk docking yaitu dengan preparasi
protein dengan program PyMOL. Proses docking memerlukan 2 hal preparasi
yaitu preparasi protein yang terbersihkan dari air, residu, dan ligan, lalu preparasi
ligan tanpa protein. Pertama dilakukan preparasi protein dengan cara struktur 3D
protein yang telah di download dari PDB di masukan ke dalam PyMOL dengan
cara klik menu file lalu open, langkah selanjutnya klik action pada nama protein
lalu pilih remove waters. Lalu klik sequence untuk menghilangkan residu atau
rantai protein dan ligan yang tidak diperlukan dalam proses docking. Kedua
dilakukan preparasi ligan dengan cara klik sequence remove waters dan remove
chain protein dan residu, sehingga didapatkan ligan yang telah terbersihkan, lalu
protein dan ligan yang telah terbersihkan disimpan dengan cara klik file lalu
export molecul dengan format file “.pdb”.

Langkah selanjutnya setelah preparasi protein adalah proses docking

dengan menggunakan program PyRx. Langkah selanjutnya add macromolecule
dan add ligan pada menu select molecules di vina wizard. Memasukan struktur 3D
senyawa dengan cara klik insert item pada menu open babel. Lalu langkah
selanjutnya klik foward pada menu vina wizard, lalu atur grid box agar kita
mengetahui area yang akan di docking dengan cara pindahkan titik inti grid box

Ke tengah struktur ligan lalu mampatkan grid box lalu catat size x,y,z dan
central x,y,z. Langkah selanjutnya klik foward dan proses docking berjalan,
tunggu hingga 100% maka hasil docking muncul, simpan hasil docking yang
berupa nilai binnding afinity, simpan hasil dalam bentuk format ”.csv”, dan
simpan pula struktur protein hasil docking dan struktur senyawa hasil docking
dengan format “.pdb”.
Menentukan nilai RMSD dengan menggunakan program PyMOL, langkah
pertama memasukan struktur protein hasil docking dan struktur ligan yang telah
terbersihkan dengan cara kili menu file lalu open, langkah selanjutnya setelah
kedua strukur telah keluar menyimpan kedua struktur dengan cara klik file lalu
export dan diberi nama “kompleks” dan di beri format “.pdb”. langkah selanjutnya
memasukan struktur kompleks dan struktur senyawa hasil docking lalu
mengetikkan “align (kompleks),(senyawa hasil docking) pada command input
area tekan enter maka akan muncul nilai RMSD, catat nilai RMSD dan simpan
gambar struktur 3D dengan cara klik draw, lalu draw fast, dan save image to file.
Visualisasi interaksi ligan dengan asam amino dengan menggunakan
program BIOVIA discovery studio versi 2017, langkah pertama membuka
program lalu klik file lalu open makromolekul (protein), lalu klik file, insert from
file, pilih senyawa yang ingin dilihat interaksinya, lalu pilih ligand interaction,
lalu show types, lalu show 2D diagram. Interaksi dengan asam amino akan
muncul, untuk ligan dilakukan cara yang sama.
 3.3.8 Skema Kerja

Senyawa aktif pada sambiloto Menyiapkan protein target melalui

Swiss TargetPrediction dan
Pubchem, Dr. Duke, IJAH, STITCH database
KNApSAcK

Mencari nama lain Dicek melalui KEGG

PubChem dari senyawa aktif Pathway

Menyusun dan mencari aktivitas biologi

Menyusun dan Mencari protein
aktivitas biologi senyawa

STRING
PASS Online

Analysis network

Crystope versi 3.7.1

Preparasi Protein

PyMOL versi 2.3.1

Molecular docking

PyRx versi 0,8

Binding affinity (kcal/mol)

Menentukan nilai RMDS

PyMOL versi 2.3.1

Nilai RMDS
Asam Amino
(Root Mean Square Deviation)

Gambar 3.1 Skema Kerja