ESAI

BIOTEKNOLOGI FARMASI
TOPIK : DNA Amplification (PCR)
JUDUL : Karakteristik primer pada Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk Sekuensing DNA

KELAS : A-B
Rizka hasanah 110116224/KP-A
Zulfikar ali akbar 110116289/KP-A
Siyani 110116367/KP-A
Pandora gracya .H. 110116454/KP-A
Susan 110116019/KP-B
Arsymina magfirah .H. 110116066 KP-B
Sylvina herdianti 110116246/KP-B

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SURABAYA

2017-2018
 Karakteristik Primer pada Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk Sekuensing DNA

Karakteristik Primer pada Polymerase Chain Reaction (PCR)

Untuk Sekuensing DNA

Abstrak
Kesuksesan dalam melakukan desain primer pada Polymerse Chain Reaction (PCR) sangat
dipengaruhi oeh karakteristik primer yang digunakan. Beberapa penelitian mengenai desain primer
telah dilaukan menggunakan berbagai macam algoritma dan karakter primer yang berbeda-beda.
Dengan mengetahui karakteristik primer yang digunakan pada penelitian-penelitian sebelumnya,
diharapkan penelitian selanjutnya dapat lebih memberikan hasil yang kebih signifikan, khususnya
dalam bidang sekuensing DNA. Paper ini bertujuan untuk memberikan panduan untuk mengetahui
beberapa sifat/karakteristik primerr yang signifikan terhadap keoptimuman desain primer.
Harapannya, setelah mengetahui sifat/karakteristik yang signifikan peneliti dapat menghemat waktu
komputasi dengan halnya mempertahankan parameter primer yang memberikan nilai optimal.

Keywords : Polymerase Chain Reaction, desain primer, bioinformatika.

molekul oligonukleutida untai tunggal
yang

1. Pedahuluan

Bioinformatika adalah disiplin ilmu

baru yang menggabungkan ilmu
kommputer, kimia dan statistika untuk
mengatur, menganalisis, dan
mendistribusikan informasi biologis
untuk menjawab pertanyaan-
pertanyaan kompleks di bidang
biologi. Saat ini banyak tekhnik
analisis molekuler yang digunakan di
seluruh dunia di antaranya: PCR, flow
cutometry, tiddue microarray,
different blots, diagnosis genetic, dll.
Dari bberapa tekhnik tersebut, PCR
adalah tekhnik yang paling diterima
secara luas, umumnya digunakan
untuk melakukan diagnosis yang
membutuhkan spesifitas dan
sensitivitas yang sangat tinggi. PCR
umumnya digunakan dalam berbagai
tugas, seperti deteksi penyakit
keturunan, identifikasi sidik jari
genetik, diagnosis penyakit menular,
kloning gen, pengujian paternitas, dan
komputasi DNA. Untuk membuat
sebuah alat PCR yang spesifik, efektif
dan efesien bagi peneliti maupun
klinis, aspek yang paling penting
adalah melakukan desain pada primer
(desain primer). Primer adalah
terdiri atas sekitar 30 basa. Desain
primer yang tepat adalah salah satu
faktor yang paling penting dalam
keberhasilan sekuensing DNA.
Dalam beberapa tahun terakhir,
banyak publikasi yang membahs
telnik-teknik desain primer dalam
bidang sekuensing DNA. Karena
banyaknya penelitian mengenai desain
primer ini, maka perlu adanya literatur
review yang dapat digunakan sebagai
panduan bagi penelitian lain yang
akan meneliti pada bisang yang
sejenis. Khususnya desain primer
dalam sekuensing DNA. Beberapa
literatur review mengenai desain
primer pernah dilakukan sebelumnya.
Pada penelitian dilakukan review
tentang analisis algoritma dan
pembobotan parameter yang
digunakan pada beberapa tools desain
primer. Dari bebrapa literatur review
yang dilakukan sebelumnya belum ada
yang spesifik membahas karakter
primer yang digunakan pada penelitian
Desain Primer. Oleh karena itu,
review ini merangkum beberapa

1
 Karakteristik Primer pada Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk Sekuensing DNA

penelitian sebelumnya untuk deoksiribonukleutida triphosphat

memberikan panduan untuk (dNTP), (2) oligonukleutida primer.
mengetahui beberapa sifat/karakter (3) DNA template (cetakan), (4)
primer yang signifikan terhadap komposisi larutan buffer, (5) jumlah
keoptimuman desain primer. siklus reaksi, (6) enzim yang
2. Materi dan Metode digunakan, dan (7) faktor tekhnis dan
Keberhasilan reaksi PCR sangat di non-tekhnis lainnya,
tentukan oleh beberapa; (1)
misalnya kontaminsi. sama untuk memastikan kinerja
yang konsisten pada pasangan
a. Panjang primer primer.Terdapat beberapa formula
Desain primer yang diperlukan yang dapat digunakan untuk
untuk PCR adalah sepasang menghitung suhu leleh primer,
primer yang dikenal dengan Wallace’s Formula, Bolton and
forward primer dan reverse McCarthy’s Formula dan
primer.Primer yang diperoleh Thermodynamic Basis Sets for
merupakan rangkaian basa Nearest Neighbor Interactions.
nukleotida yang unik dan
diusahakan memiliki ukuran c. Primer Annealing Temperature
pendek untuk meminimalkan (Ta)
biaya. Panjang primer berkisar 18- Primer Annealing
30 basa, didasarkan pada Temperature (Ta) merupakan suhu
pertimbangan kombinasi acak yang diperkirakan agar primer
yang mungkin ditemukan pada dapat berkaitan dengan template
satu urutan genom. Probabilitas (DNA) secara stabil. Suhu aneling
menemukan 1 basa A, G, C atau T yang tinggi akan menyulitkan
pada satu basa adalah ¼ (4-1), terjadinya ikatan primer sehingga
probabilitas menemukan dua basa menghasilkan produk PCR yang
sequence (AG, AC, CG, dll) kurang efisien. Sebaliknya, suhu
adalah 1/16 (4-2), probabilitas aneling yang terlalu rendah
menemukan 4 basa sequence menyebabkan terjadinya
(ACGT, CGAT, dll) adalah 1/256 penempelan primer pada DNA di
(4-4). Sehingga 17 basa primer tempat yang tidak spesifik.Nilai
secara statistik akan ditemukan suhu aneling yang sebanding
sekali dalam setiap 417 basa dengan suhu leleh menyebabkan
sequence, atau sekitar 17 miliar suhu aneling tidak dimasukkan
basa sequence. Primer dengan dalam perhitungan keoptimalan
panjang lebih dari 30 basa tidak desain primer.
disarankan, karena tidak
menunjukkan spesifisitas yang d. Selisih Primer Melting
lebih tinggi. Selain itu, primer Temperature(ΔTm)
yang panjang dapat berakibat Pasangan primer sebaiknya tidak
terhibridasi dengan primer lain memiliki selisih suhu leleh yang
sehingga tidak membentuk tinggi. Pasangan primer dengan
polimerisasi DNA. selisih suhu leleh yang lebih dari
5°C menyebabkan penurunan
b. Primer Melting proses amplifikasi, atau bahkan
Temperature(Tm) memungkinkan tidak terjadi
Primer Melting Temperature proses amplifikasi.
(Tm) atau suhu leleh merupakan
temperatur yang diperlukan oleh e. GC Content
primer untuk mengalami Aturan umum yang diikuti oleh
disosiasi / lepas ikatan.Suhu leleh sebagian besar program desain
primer yang digunakan harus primer adalah menggunakan

2
 Karakteristik Primer pada Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk Sekuensing DNA

persen basa G dan C antara 40% nukleotida T pada ujung

hingga 60% 3’-nya karena dapat
menyebabkan
f. GC Clamp mismatch/ketidakcocokan.
Beberapa program mensyaratkan Banyaknya mismatch atau
pasangan primer memiliki basa mismatch pada ujung 3’-
GC pada ujung 3’ dari primer. GC primer juga dapat
Clamp yang dimaksud adalah menyebabkan hairpin.
ujung C, G, CG atau GC, yang 2) Self Dimer dan Cross
diyakini membuat hibridisasi lebih Dimer
stabil.Namun perlu dihindari lebih Primer yang berikatan dengan
dari 3 basa G atau C pada 5 basa primer lainnya yang sejenis
terakhir ujung 3′ karena ujung 3′- disebut dengan self-dimer. Self-
nya bisa melipat membentuk dimer pada ujung 3’ dengan ΔG =
struktur dimer yang -5 kcal/mol dan self- dimer pada
mengakibatkan ujung 3′ primer bagian internal dengan ΔG= -6
tidak terikat pada template. kcal/mol masih dapat ditoleransi.
Penelitian yang Primer yang berikatan dengan
mempertimbangkan struktur primer pasangannya (reverse dan
hairpin untuk desain primer. forward) disebut dengan Cross-
Dimer. Cross-dimer pada ujung 3’
g. Secondary Structures dengan ΔG= -5 kcal/mol dan self-
Reaksi PCR sebaiknya tidak dimer pada bagian internal
mengandung secondary structures dengan ΔG= -6 kcal/mol masih
berupa hairpin atau dimer. dapat ditoleransi.
Stabilitas secondary structure
ditentukan oleh energi bebas (ΔG) h. Self-complementary (SC) dan
dan suhu lelehnya. Hal ini Pair-Complementary (PC)
menyebabkan primer tidak dapat Selain secondary structures,
menempel dengan template DNA. complementary pada primer dan
1) Hairpin pasangan primer juga harus
Hairpin adalah struktur dihindari. Self complementary
yang dibentuk oleh basis dapat menyebabkan struktur
pasangan asam hairpin yang stabil hanya dengan 4
polynucleic antara urutan pasangan basa GC pada ujung
komplementer untai maupun bagian tengah primer.
tunggal baik DNA Primer harus berisi kurang dari 4
maupun RNA. basa komplementer, terutama pada
Terbentuknya struktur ujung 3’. Pair complementary
loop /hairpin pada primer terutama pada ujung 3’ primer
sebaiknya dihindari, dapat menyebabkan struktur
namun sangat sulit untuk dimer.
memperoleh primer tanpa
memiliki struktur haripin. i. Repeats & Run
Hairpin pada ujung 3' Perulangan yang cukup
dengan ΔG(energy yang panjang dengan basa sama (lebih
dipelukan untuk memecah dari tiga basa berurutan sama,
struktur hairpin) = -2 misal basa AGCGGGGGATG
kcal/mol dan hairpin memiliki 5 basa berurutan G)
internal dengan ΔG = -3 harus dihindari karena dapat
kcal/mol masih dapat menyebabkan terjadinya breathing
ditoleransi. pada primer dan mispirming,
Kedua primer sebaiknya sehingga proses penempelan
tidak memiliki basa primer menjadi sulit. Primer

3
 Karakteristik Primer pada Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk Sekuensing DNA
sebaiknya juga tidak memiliki
urutan pengulangan dari 2 basa
dan maksimum pengulangan 2
basa sebanyak 4 kali masih dapat
di toleransi. Misalnya
ATATATAT Hal ini juga
menyebabkan terbentuknya
struktur hairpin.
j. Specificity atau keunikan
Primer merupakan rangkaian
basa nukleotida yang berasal dari
template/DNA target. Primer yang
baik adalah rangkaian basa
nukleotida yang unik pada
template tersebut, sehingga tidak
terdapat pada sequence atau lokasi
lain pada template. Bahkan
sebaiknya untuk menghindari
cross homologi, primer dilakukan
analsis melalui BLAST-NCBI
untuk mengetahui bahwa primer
yang digunakan benar-benar unik
dan tidak menempel pada
organisme lain. Penelitian yang
mempertimbangkan specificity
dalam desain primer.
k. Product Lenght
Jarak antara ujung 5’ kedua
primer dikenal dengan istilah
amplicon atau product length.
Pada umumnya, product length
product length yang digunakan
adalah <2000 basa. Jarak ini
dirasa cukup untuk proses
amplifikasi pada template.
l. Restriction Site
Restriction Site diberikan jika
diperlukan. Untuk kasus primer
yang memiliki restriction site,
algoritma tertentu digunakan
untuk memeriksa kesamaan pola
dari ujung 5’ ke ujung 3’ primer,
dan memproses apakah terdapat
enzim sesuai restriction yang
diberikan atau tidak. Seperti dalam
penelitian terdahulu [2], jika
terdapat restriction site yang sama
(panjang pola primer yang cocok,
kurang dari atau sama dengan
panjang enzim restriksi, dan lebih
4
dari atau sama dengan panjang
enzim restriksi minus 3 [(Le-3)≤|
Pm≤Le] ), maka algoritma yang
digunakan akan menyesuaian nilai
yang dimiliki untuk proses seleksi
primer yang optimal.
3. Hasil
Pada review ini, penulis
merangkum karakteristik primer yang
digunakan untuk masing-masing
penelitian sebelumnya. Materi
penelitian adalah penelitian terdahulu
sejak tahun 2001 hingga 2014.
Penelitian yang ditinjau adalah
penelitian-penelitian dari berbagai
jurnal, konferensi dan publikasi
internasional seperti jurnal
Bioinformatics, IEEE, GECCO, dll.
4. Diskusi
Diketahui bahwa GC Content dan
Struktur Dimer menjadi hal yang
selalu dilibatkan dalam penelitian. GC
Content berperan dalam meningkatkan
stabilitas primer. Ikatan hidrogen yang
kuat pada pasangan basa G dan C
menyebabkan primer lebih stabil
untuk menempel pada template,
sehingga GC Content disarankan
berkisar antara 40% hingga 60%.
Struktur dimer dapat terjadi apabila
primer memiliki banyak basa
komplementer. Jika ikatan basa
komplementer lebih stabil
dibandingkan ikatan primer dan
template, bahkan dengan suhu aneling
yang tinggi, maka primer tidak dapat
berikatan dengan template. Sehingga
produk PCR yang dihasilkan akan
berkurang secara signifikan.
Primer Annealing Temperature
(Ta) atau suhu aneling dan perulangan
basa secara berurut tidak digunakan
sebagai batasan desain primer pada
penelitian. Nilai suhu aneling yang
sebanding dengan suhu leleh
menyebabkan suhu aneling tidak
digunakan sebagai sifat/kriteria yang
dipertimbangkan dalam mendesain
primer oleh penelitian yang ditinjau.
Sementara perulangan basa secara
berurut hanya disarankan untuk
 Karakteristik Primer pada Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk Sekuensing DNA

dihindari, dan lebih menekankan pada sifat/karakteristik yang perlu

terbentuknya struktur hairpin yang dipertimbangkan, namun tidak
menjadi akibat adanya perulangan menyebutkan metode yang digunakan
basa secara berurut. dalam penelitiannya. Selain itu juga
Hal yang cukup menarik terjadi ada penelitian yang tidak
karena beberapa penelitian sebelum menggunakan suhu leleh sebagai
2007 mempertimbangkan karakteristik sifat/karakteristik desain primer yang
panjang primer, namun selanjutnya dipertimbangkan. Penelitian Wu dkk
karakteristik panjang primer tidak mempertimbangkan suhu leleh
digantikan dengan selisih panjang pada desain primer, namun
forward primer dan reverse primer. menggantinya dengan selisih suhu
Pada penelitian yang dilakukan oleh leleh. Wu dkk mempertimbangkan
Kampke dkk dan Wu dkk bahwa selisih suhu leleh sepasang
menggunakan panjang primer 16-28 primer tidak boleh lebih dari 5°C. Hal
basa. Penelitian dan tidak ini dijadikan pertimbangan dengan
menyebutkan panjang primer yang harapan pasangan primer
digunakan, hanya menyarankan akanmenempel di template pada suhu
meminimalkan panjang primer untuk yang sama. Penelitian Yang dkk
meminimalkan biaya. Sementara menggunakan kedua formula Bolton
penelitian lain tidak menggunakan and McCarthy’s dan Wallace’s,
panjang primer sebagai batasan bahkan membandingkan akurasi
langsung, melainkan menggunakan keduanya. Hasil penelitiannya
selisih panjang forward primer dan menyebutkan Wallace’s Formula
reverse primer. Primer yang panjang memberikan hasil yang lebih akurat
memiliki spesifisitas tinggi dan suhu dibandingkan Bolton and McCarthy’s
leleh yang tinggi dengan biaya yang Formula.
lebih mahal, namun primer yang lebih Secara algoritma, beberapa
pendek memiliki spesifisitas rendah penelitian tersebut dilakukan
dengan biaya yang lebih murah. Hal menggunakan berbagai algoritma
ini yang menjadi pertimbangan Yang untuk merancang desain primer PCR
dkk untuk tidak mempertimbangkan yang optimal. Penelitian terkait
panjang primer dalam penelitiannya. interaksi oligonukleotida untuk PCR
Sebagai penggantinya, untuk tetap pasangan primer, menjadi dasar dalam
mempertahankan stabilitas primer, pengembangan berbagai algoritma
Yang dkk mengganti sifat/kriteria yang digunakan untuk desain primer
menjadi selisih panjang primer dengan pada PCR. Penelitian terkait desain
batas optimum 3 basa. primer optimum yang memperhatikan
Selain itu, dari beberapa penelitian sifat-sifat / karakteristik yang
tersebut mempertimbangkan melting diperlukan dalam suatu primer telah
temperature / suhu leleh, sementara dilakukan menggunakan metode
beberapa lainnya memprioritaskan Genetic Algorithm, Memetic
pada selisih suhu leleh pasangan Algorithm, Gravitational Seacrh
primer. Hal in cukup menarik untuk Algorithm. Penelitian telah
dicari tahu mengenai formula mana dikembangkan hingga desain primer
yang lebih akurat untuk menghitung untuk modifikasi PCR, Multiplex
suhu leleh. Pada penelitiannya, PCR. Multiplex PCR merupakan
Kampke dkk menggunakan modifikasi PCR untuk mendeteksi
Thermodynamic Basis Sets for Nearest penghapusan atau duplikasi secara
Neighbor Interactions untuk cepat pada jumlah gen yang besar.
menghitung suhu leleh, sementara
penelitian lain lebih memilih PUSTAKA
menggunakan Wallace’s Formula.
Beberapa penelitian menganggap suhu T. Yuwono, Teori dan Aplikasi Polymerase
leleh sebagai salah satu Chain Reaction. Andi Publisher, 2007.

5
 Karakteristik Primer pada Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk Sekuensing DNA

F. J. Burpo, “A critical review of PCR primer

design algorithms and cross- hybridization
case study,” pp. 1–12, 2001.
K. A. Abd-elsalam, “Minireview
Bioinformatic tools and guideline for PCR
primer design,” vol. 2, no. May, pp. 91–95,
2003.
F.-M. Lin, H.-D. Huang, H.-Y. Huang, and J.-
T. Horng, “Primer design for multiplex PCR
using a genetic algorithm,” Proc. 2005 Conf.
Genet. Evol. Comput. - GECCO ’05, p. 475,
2005.
Seminar Nasional Informatika Medis
(SNIMed) V 2014.