dengan Polymerase Chain Reaction (PCR) (Pradnyaniti, D.G, Wirajana, I.N, Yowani, S.C)
ABSTRAK
Amplifikasi DNA Mycobacterium tuberculosis dari gen rpoB dilakukan dengan metode
polymerase chain reaction (PCR). Amplifikasi DNA dengan PCR diperlukan sepasang primer (forward
dan reverse) untuk membatasi daerah yang ingin diamplifikasi. Penelitian ini bertujuan untuk mendesain
sepasang primer agar dapat mengamplifikasi fragmen 0,5 kb gen rpoB M.tuberculosis. Desain primer
dilakukan secara in silico dengan bantuan program clone manager suite 6 (University of Groningen).
Template yang digunakan dalam mendesain primer adalah sekuen gen rpoB M. tuberculosis H37RV wild
type, yang diperoleh dari database NCBI dengan kode genbank U12205.1.
Penelitian ini telah berhasil memperoleh sekuen sepasang primer (forward dan reverse) dengan
panjang masing-masing adalah 22 oligonukleotida. Primer ini dapat mengamplifikasi secara in silico
fragmen 0,5 kb gen rpoB M. tuberculosis pada rentang daerah 990-1496 pb dengan panjang fragmen
sebesar 507 pb.
124
Desain Primer secara in silico untuk Amplifikasi Fragmen gen rpoB Mycobacterium tuberculosis
dengan Polymerase Chain Reaction (PCR) (Pradnyaniti, D.G, Wirajana, I.N, Yowani, S.C)
India, Cina, Afrika selatan, Indonesia dan (tabel A.2). Sekuen primer telah memenuhi
Pakistan (WHO, 2011). kriteria parameter untuk sebuah primer yang
Tujuan penelitian ini yaitu memperoleh digunakan dalam proses PCR (tabel A.3).
primer yang dapat digunakan untuk membatasi
daerah amplifikasi terhadap gen rpoB M. 4. PEMBAHASAN
tuberculosis H37RV yang didesain secara in Secara umum, primer yang ideal memiliki
silico. Sehingga dengan primer yang didesain panjang antara 18 sampai 30 oligonukleotida.
tersebut, dapat digunakan dalam proses Panjang ini diharapkan cukup untuk dapat
amplifikasi menggunakan PCR. mengikat template pada suhu annealing dan
mendapatkan sekuen yang spesifik (Borah,
2. BAHAN DAN METODE 2011). Jika primer terlalu pendek maka dapat
2.1 Bahan mengurangi spesifisitas primer sehingga mudah
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini menempel pada template dengan suhu annealing
adalah sebuah softwere yaitu clone manager yang tidak diinginkan. Sedangkan jika primer
suite 6 (University of Groningen) untuk terlalu panjang tidak mempengaruhi spesifisitas
mendesain primer secara in silico. Data sekuen secara bermakna (Handoyo dan Rudiretna,
gen rpoB M. tuberculosis yang digunakan 2001).
diperoleh dari database NCBI pada URL Analisis menggunakan analyze mix wizard,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov dengan kode yaitu simulasi primer dan DNA template M.
genbank U12205.1. tuberculosis dalam proses PCR menghasilkan
fragmen sebesar 507 pb yang berada pada posisi
2.2 Metode 990-1496 (gambar B.1). Hasil analisis
Desain primer dilakukan pada program menujukkan bahwa primer berada dalam kondisi
clone manager suite 6. Pada “Molecule List” terbaik yaitu tidak terdapat dimer pada ujung 3′
dimasukkan sekuen gen rpoB M. tuberculosis. maupun di tempat yang lain, primer ini tidak
Selanjutnya dimasukkan panjang primer dan berikatan dengan internal primer ataupun primer
daerah target yang diinginkan pada menu pasangannya. Primer yang didesain ini juga
“Design Primer” sehingga program memberikan tidak menempel pada banyak molekul, dan dapat
data beberapa pilihan primer. Hasil analisis menempel dengan baik pada daerah yang
dilihat menggunakan “Primer Report”. ditargetkan. Sekuen primer sebaiknya tidak
Rentang daerah primer dan hasil analisis memiliki daerah yang dapat berikatan dengan
juga dapat dilihat dengan menggunakan internal primer tersebut maupun dengan primer
“Analyze Mix Wizard”, dengan dimasukkan pasangannya. Primer sebaiknya menggunakan
sekuen masing-masing primer (forward dan pasangan basa yang komplemen dan tidak
reverse) dan sekuen gen rpoB M. tuberculosis. memiliki banyak binding sites dalam genom
Sedangkan untuk menganalisis masing-masing target (Diss, 2003).
primer dilakukan dengan dimasukkan nama Primer yang baik merupakan primer yang
primer dan sekuen primer yang dianalisis memenuhi kriteria parameter primer. Parameter
menggunakan “Direct Entry”. tersebut antara lain: melting temperature (Tm),
persentase jumlah G dan C (%GC), 3′dimer,
3. HASIL stabilitas, repeats, dan hairpins.
Program clone manager suite 6 memberikan Melting temperature (Tm) untuk primer
14 pilihan pasang primer setelah dimasukkan forward dan reverse secara umum serupa
panjang primer yaitu 22 oligonukleotida dengan (dalam rentang 2 sampai 4 oC) dan di atas
daerah target 1020-1480 (tabel A.1). Sekuen 60oC untuk menghasilkan produk PCR yang
primer dengan kriteria terbaik yang dapat baik (Sulistyaningsih, 2007). Primer dengan
digunakan dalam proses PCR yaitu primer FrTb
Tm yang terlalu tinggi dapat menghasilkan
5'-GTCGACGCTGACCGAAGAAGAC-3' dan
produk PCR yang rendah. Sedangkan Tm yang
RrTb 5'-GAGCCGATCAGACCGATGTTGG-3'
terlalu rendah memiliki kecenderungan
125
Desain Primer secara in silico untuk Amplifikasi Fragmen gen rpoB Mycobacterium tuberculosis
dengan Polymerase Chain Reaction (PCR) (Pradnyaniti, D.G, Wirajana, I.N, Yowani, S.C)
menempel ditempat lain dan menghasilkan sehingga primer yang dihasilkan berada dalam
produk yang tidak spesifik. Tm pada primer kondisi yang baik (Borah, 2011).
yang didesain telah memenuhi kriteria yaitu Haipins merupakan interaksi intramolekuler
67oC. Tm dapat dihitung secara manual dengan dalam primer. Haipins dalam primer dapat
rumus Tm= 2(A+T) + 4(G+C). Tm dari primer menganggu proses penempelan primer pada
tersebut dapat digunakan untuk menetapkan template dalam proses PCR (Borah, 2011).
suhu annealing dalam PCR (Borah, 2011; Dalam primer yang didesain tidak terdapat
Handoyo dan Rudiretna, 2001). haipins, sehingga primer ini cukup baik dapat
Persentase GC merupakan persentase digunakan dalam proses PCR.
banyaknya guanin dan sitosin dalam suatu Primer yang didesain ini dapat memotong
primer, sebaiknya % GC berada pada rentang daerah target (dapat membatasi daerah
40-60 % (Borah, 2011). Primer yang didesain amplifikasi dalam proses PCR) dengan tepat
memiliki % GC sebesar 59% yang masih berada sesuai rentang daerah yang dirancang secara in
pada rentang kriteria % CG. Primer dengan % silico. Hal ini menunjukan bahwa primer yang
GC yang rendah dapat menurunkan efisiensi didesain sudah cukup baik untuk dapat
proses PCR yang disebabkan karena primer digunakan dalam proses PCR dan dapat
tidak mampu berkompetisi untuk menempel menghasilkan produk sesuai dengan rentang
secara efektif pada template (Handoyo dan daerah yang diinginkan.
Rudiretna, 2001).
5. KESIMPULAN
Dimer pada ujung 3′ primer sebaiknya tidak
Primer dengan panjang sekuen sejumlah 22
lebih dari 3 basa karena dapat menurunkan
oligonukleotida telah berhasil didesain dalam
spesifisitas primer (Handoyo dan Rudiretna, kondisi terbaik dengan fragmen sebesar 507 pb.
2001). Primer sebaiknya tidak mempunyai 3
atau lebih basa G atau C pada 3′dimer, UCAPAN TERIMA KASIH
karena dapat menstabilkan annealing primer Penulis mengucapkan terimakasih kepada
non spesifik (Sulistyaningsih, 2007). Dimer semua pihak yang telah membantu, sehingga
pada ujung 3′ masing-masing primer yang penelitian ini dapat terlaksana dengan baik,
dirancang adalah 1 dimer pada primer forward khususnya kepada Prof. Dr. Bauke W. (Rijk
dan 2 dimer pada primer reverse, dimer tersebut Universiteit Groningen; University of
tidak melebihi batas dari parameter dimer suatu Groningen) atas bantuan softwere yang telah
primer. diberikan.
Stabilitas suatu primer mempengaruhi
penempelan primer pada template. Rentang DAFTAR PUSTAKA
stabilitas suatu primer adalah 1,2 – 2 kcal. Jika Borah, P. 2011. Primer Designing for PCR.
terlalu stabil maka primer akan menempel kuat Science Vision 11(3): P. 134 -136.
pada template dan jika tidak stabil primer tidak Diss, T. 2003. The Polymerase Chain Reaction.
dapat menempel dengan baik pada template. In Crocker, J. dan Paul, G.M. editors.
Pada primer yang telah didesain memiliki Molecular Biology in Cellular
stabilitas 1,9 kcal pada primer forward dan 1,6 Pathology. United Kingdom: John
kcal pada primer reverse, stabilitas tersebut Willey and Sons, Ltd. P. 193-210.
masih berada pada rentang stabilitas primer yang Handoyo, D. dan Rudiretna, A. 2000. Prinsip
baik. Umum dan Pelaksanaan Polymerase
Repeats merupakan nukleotida yang Chain Reaction (PCR) [General
berulang dalam primer, adanya repeats dapat Principles and Implementation of
menyebabkan terjadinya pemempelan primer di Polymerase Chain Reaction]. Unitas,
tempat yang tidak diinginkan (mispriming). Pada 9(1): P. 17-29.
primer yang didesain ini tidak terdapat repeats, Sulistyaningsih, E. 2007. Polymerase Chain
Reaction (PCR): Era Baru Diagnosis
126
Desain Primer secara in silico untuk Amplifikasi Fragmen gen rpoB Mycobacterium tuberculosis
dengan Polymerase Chain Reaction (PCR) (Pradnyaniti, D.G, Wirajana, I.N, Yowani, S.C)
127
Desain Primer secara in silico untuk Amplifikasi Fragmen gen rpoB Mycobacterium tuberculosis
dengan Polymerase Chain Reaction (PCR) (Pradnyaniti, D.G, Wirajana, I.N, Yowani, S.C)
APENDIK A.
A B
APENDIK B.
128
Desain Primer secara in silico untuk Amplifikasi Fragmen gen rpoB Mycobacterium tuberculosis
dengan Polymerase Chain Reaction (PCR) (Pradnyaniti, D.G, Wirajana, I.N, Yowani, S.C)
Gambar B.1 Posisi penempelan primer yang didesain pada DNA template.
Keterangan gambar: primer forward berada pada nukleotida ke 990 dan
primer reverse berada pada nukleotida ke 1496, menghasilkan fragmen
sebesar 507 pb
129
Desain Primer secara in silico untuk Amplifikasi Fragmen gen rpoB Mycobacterium tuberculosis
dengan Polymerase Chain Reaction (PCR) (Pradnyaniti, D.G, Wirajana, I.N, Yowani, S.C)
130