Laporan Praktikum ke-4 Hari / Tanggal : Selasa/ 30 September 2014

m.k. Prinsip Bioteknologi Akuakultur Asisten : Furqon Abrory S.

Kelompok : IV

DESAIN PRIMER

Disusun Oleh :

Shinta Tiara N. C14120012

Arini Arziani k C14120014
Nurfitriani Siti Y. C14120017
Eka Aprilia W. C14120022
Savni Retalia S. C14120023
Deni Yunus W. C14120032
Mohammad Sapta J. C14120034
Adi Nur Huda C14120036
Muhammad Alkahfi C14134006

PROGRAM STUDI TEKNOLOGI DAN MANAJEMEN AKUAKULTUR

DEPARTEMEN BUDIDAYA PERAIRAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2014
 I. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan teknik biologi molekuler
yang memiliki tingkat sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi. Dengan
penggunaan teknik PCR maka keberadaan penyakit pada organisme dapat
diketahui sedini mungkin, sehingga dapat dilakukan langkah pengendalian
penyakit atau tindakan oleh para pengambil kebijakan, terutama dalam budidaya
perikanan (Radji 2010). Pada proses PCR terdapat beberapa siklus yaitu
denaturasi, annealing, dan ekstensi. Denaturasi merupakan proses pemanasan
dengan menggunakan suhu 90-95oC dengan tujuan untuk memisahkan untai
ganda pada DNA sehingga menjadi dua untai tunggal yang akan menjadi tempat
menempelnya primer. Selanjutnya tahap annealing yaitu proses penurunan suhu
sampai mencapai 45-50oC, penurunan suhu ini dilakukan agar primer berpasangan
dengan sekuen komplementernya atau terjadinya penempelan antara
oligonukleotida dengan utas tunggal DNA. Lalu tahap selanjutnya ekstensi pada
tahap ini dilakukan kenaikkan suhu sampai 72oC, dengan suhu tersebut enzim Taq
DNA (Thermus Aquaticus) dapat bekerja dengan optimum, pada tahap ini terjadi
pemanjangan primer menjadi suatu utas DNA baru oleh enzim DNA polimerase.
Suatu keberhasilan reaksi PCR dipengaruhi oleh desain primer yang
digunakan, desain primer dapat dibuat dengan menggunakan beberapa aplikasi,
dalam pembuatan desain primer cukup sulit dilakukan sehingga dibutuhkan
keterampilan dalam membuatnya.

1.2 Tujuan
Mempelajari pembuatan desain primer dengan menggunakan aplikasi
genetyx dan primer express.
 II. METODOLOGI

2.1 Waktu dan Tempat

Praktikum dilakukan pada hari kamis tanggal 25 September 2014, bertempat
di Ruang Gambar Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu
Kelautan.

2.2 Alat dan Bahan

Laptop, internet , kabel sambung/terminal, aplikasi primer express, dan
aplikasi genetyx.

2.3 Prosedur Kerja

Dibuka aplikasi genetyx, lalu diklik file new sequence. Setelah itu diblok
semua sequence dari notepad lalu di copy ke sequence 2. Setelah itu disave as
sequence yang sudah di copy dengan type gnu. Selanjutnya pilih file multi
sequence, diklik add pilih file yang tadi disave setelah itu diklik aligment. Setelah
itu dipilih kandidat primer ikan mas, mylo, dan medaka, lalu dicopy sequence ke
aplikasi primer express (lampiran).
Dibuka aplikasi primer express, lalu diklik file new oke. Setelah itu paste
sequence dari aplikasi genetyx, lalu diklik play setelah itu akan muncul hasil dari
primer tersebut forward (biru), probe (ungu), dan reverse (kuning) (lampiran).
 III. HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1 Hasil
Berikut ini adalah primer universal untuk ikan mas, medaka, megalo
menggunakan kombinasi program genetyx dan primer universal 3.01,
5’-CAACTGGGAYGAYATGGAGAAG-3’ forward primer
5’-CRAYWCKCAGCTCRTTGTA-3’ reverse primer
5’-TCTGGCAYCACACCTT-3’ probe
Primer forward dimulai pada panjang basa ke-1904 bp dengan panjang
primer forward 22 bp. Suhu anealling untuk primer ini adalah 58°C dengan
konsentrasi GC 50%, primer ini memiliki struktur sekunder self-dimers dan cross
–dimers.

Gambar 1. Struktur sekunder primer forward universal ikan mas, medaka, megalo
Primer reverse dimulai pada panjang basa ke-1962 bp dengan panjang
primer reverse 19 bp. Suhu anealling untuk primer ini adalah 58°C dengan
konsentrasi GC 58%, primer ini memiliki struktur sekunder hairpin, self-dimers,
cross-dimers

Gambar 2. Struktur sekunder primer reverse universal ikan mas, medaka, megalo
 Probe dimulai pada panjang basa ke-1927bp dengan panjang primer probe
16bp. Suhu anealling untuk primer ini adalah 69°C dengan konsentrasi GC 50%.
Berikut ini adalah primer menggunakan software primer express 3.01,
5’-AGCCGAGATGGTCTGGAAAA-3’ primer forward
5’-TCTCCTTTGTCACACCATCA-3’ primer reverse
Primer forward dimulai pada panjang basa ke-437bp dengan panjang primer
forward 20bp. Suhu anealling untuk primer ini adalah 58°C dengan konsentrasi
GC 50%, primer ini memiliki struktur sekunder cross –dimers.

Gambar 3. Struktur sekunder pada primer reverse

Primer reverse dimulai pada panjang basa ke-496bp dengan panjang primer
reverse 21bp. Suhu anealling untuk primer ini adalah 59°C dengan konsentrasi
GC 48%, primer ini memiliki struktur sekunder self dimers, cross dimers

Gambar 4. Struktur sekunder pada primer reverse

3.2 Pembahasan
Primer adalah suatu oligonukleotida (biasanya 16 hingga 30 nukleotida)
yang dapat digunakan untuk mengawali dalam mengamplifikasi sekuen DNA.
Amplifikasi sekuen DNA dengan PCR pada dasarnya menggunakan primer-
primer yang berhibridisasi pada utas DNA yang berlawanan. Orientasi arah
pemanjangan dari primer mengarah ke dalam melewati daerah sekuen DNA
diantara dua primer yang digunakan. Produk DNA yang disintesis dari satu primer
berfungsi sebagai DNA template (cetakan) bagi primer yang lain (Aris 2000).
Fungsi Primer adalah menyediakan ujung 3’-OH yang akan digunakan untuk
menempelkan molekul DNA pertama dalam proses polimerisasi.
Primer biasa merupakan sepasang oligonukleotida, antara 15 –25 basa atau
mer yang digunakan untuk mengamplifikasi fragmen yang berada diantaranya.
Syarat mendesain primer biasa diantaranya kedua primer hendaknya tidak
mengalami self annealing sehingga sekuen sepasang primer tidak saling
komplemen, lalu khususnya pada ujung 3’, tidak terjadi primer-dimer, dan kedua
primer sebaiknya tidak mempunyai basa nukleotida T pada ujung 3’ -nya karena
akan menyebabkan mismatch (Innis 1990). Degenerate primer adalah campuran
urutan oligonukleotida di mana beberapa posisi berisi sejumlah kemungkinan
basa, memberikan populasi primer dengan urutan yang sama yang mencakup
semua kombinasi nukleotida yang mungkin untuk urutan protein yang diberikan
(Iserte 2013). Degenerate primer dipergunakan apabila sekuen DNA template
tidak diketahui dengan pasti. Degenerate primer tidak spesifik, tapi sangat sensitif.
Syarat primer yang baik adalah memiliki panjang basa oligonukleotida
antara 18-24 basa, selanjutnya memiliki urutan basa-basa spesifik untuk melekat
pada DNA cetakan, selain itu tidak terdapat basa-basa yang berkomplemen pada
ujung 3’ sehingga terjadi dimer, dan komposisi basa sitosin dan guanin adalah
50% dari seluruh basa. Selanjutnya dua primer yang di pasangkan memiliki suhu
melting yang tidak berbeda jauh (Madej 1991).
Primer-primer PCR dirancang menggunakan program Primer 3.
Perancangan primer yang baik harus mempertimbangkan beberapa peraturan
tertentu, yakni memperlihatkan besarnya amplikon, panjang primer, titik leleh
atau Tm, dan tidak membentuk struktur sekunder seperti self dimer, cross dimer,
atau hairpin. Urutan basa pasangan primer yang telah disusun kemudian dianalisis
menggunakan program komputer untuk mengetahui kemungkinan
terjadinya primer-dimer akibat homologi sendiri (self-homology) atau homologi
silang (cross-homology). Selain itu, juga perlu dilihat kemungkinan
terjadinya salah tempel (mispriming), yaitu penempelan primer di luar sekuens
target. Analisis juga dilakukan untuk mengetahui titik leleh (Tm) masing-masing
primer dan kandungan GC-nya (Aris 2013 ). Sepasang primer yang baik harus
mempunyai Tm yang relatif sama dengan kandungan GC yang cukup tinggi. Self
dimer interaksi intermolekuler diantara primer dg orientasi yg sama (toleransi
5-6 kcal/mol).Cross dimer interaksi intermolekuler diantara sepasang primer
-6) kcal/mol).
Faktor lain yang penting untuk dipertimbangkan dalam merancang primer
adalah struktur sekunder. Sekuen tunggal asam nukleat mungkin memiliki struktur
sekunder (hairpin loop dan dimer primer) karena kehadiran urutan komplementer
dalam panjangnya. Hairpin loop atau struktur sekunder, jika ada dapat sangat
mengurangi efisiensi reaksi dengan membatasi ketersediaan dan kemampuan
untuk mengikat ke situs target (Vinay et al 2000).
Primer yang didapatkan dengan menggunakan kombinasi program Genetyx
dan Primer express 3.01 merupakan primer universal untuk ikan mas, medaka,
dan megalo. Primer forward dimulai pada panjang basa ke-1904 bp, mulainya
amplifikasi pada panjang basa tersebut sesuai dengan persyaratan primer yang
tidak pada awal sekuens 0-600 bp ataupun ujung akhir sekuens. Panjang primer
forward 22bp hal ini sesuai dengan persyaratan panjang primer yang baik adalah
18-22bp. Suhu anealling untuk penempelam primer ini adalah 58°C hal ini sesuai
dengan persyaratan primer yang baik yaitu sekitar 52-58°C. konsentrasi GC 50%
pada primer forward ini hal ini sesuai dengan persyaratan primer yang baik yaitu
40-60%. Primer reverse dimulai pada panjang basa ke-1962 bp, mulainya
amplifikasi pada panjang basa tersebut sesuai dengan persyaratan primer yang
tidak pada awal sekuens 0-600 bp ataupun ujung akhir sekuens. Panjang primer
reverse 19 bp, hal ini sesuai dengan persyaratan panjang primer yang baik yaitu
18-22 bp. Suhu anealling untuk primer ini adalah 58°C hal ini sesuai dengan
persyaratan primer yang baik 52-58°C. Konsentrasi GC 58% hal ini sesuai dengan
persyaratan primer yang baik dengan konsentrasi GC 40-60%, primer ini memiliki
struktur sekunder hairpin, self dimers, cross dimers ( Sambrook dan Russel 2001).
Primer forward dimulai pada panjang basa ke-437 bp, mulainya amplifikasi
pada panjang basa tersebut tidak sesuai dengan persyaratan primer ,yang tidak
pada awal sekuens 0-600 bp ataupun ujung akhir sekuens. Panjang primer forward
20 bp, hal ini sesuai dengan syarat primer yang baik yaitu 18-22 bp. Suhu
anealling untuk primer ini adalah 58°C, hal ini sesuai dengan persyaratan primer
yang baik 52-58°C. Konsentrasi GC 50%, hal ini sesuai dengan persyaratan
primer yang baik dengan konsentrasi GC 40-60%, primer ini memiliki struktur
sekunder cross –dimers. Primer reverse dimulai pada panjang basa ke-496 bp.
mulainya amplifikasi pada panjang basa tersebut tidak sesuai dengan persyaratan
primer ,yang tidak pada awal sekuens 0-600 bp ataupun ujung akhir sekuens .
Panjang primer reverse 21bp, hal ini sesuai dengan syarat primer yang baik yaitu
18-22bp. Suhu anealling untuk primer ini adalah 59°C, hal ini tidak sesuai dengan
syarat primer yang baik yaitu 52-58°C. Konsentrasi GC 48%, hal ini sesuai
dengan konsentrasi GC yang baik untuk primer yaitu 40-60%, primer ini memiliki
struktur sekunder self dimers, cross dimers (Sambrook dan Russel 2001).
 IV. KESIMPULAN

4.1 Kesimpulan
Desain primer dapat menggunakan program GENETYCX dan Primer
Express 3.01, Masing-masing program memiliki kelebihan dan kekurangan dalam
mendesain primer. Primer yang didapatkan dari software tersebut telah sesuai
dengan persyaratan primer yang baik.

4.2 Saran
Praktikum selanjutnya diharapkan dapat memesan langsung primer sesuai
dengan keiinginan sekuens basa nitrogen untuk ekspresi gen tertentu.
 DAFTAR PUSTAKA

Aris M et al. 2013. Identifikasi Molekuler Bakteri Patogen dan Desain Primer
PCR. Jurnal Budidaya Perairan. Vol 1(3) : 43-50.

Aris T W. 2000. Inverse Polymerase Chain Reaction. Jurnal Hayati. Vol 7 (4) :
121-123.

Innis M A., Gelfand D H, Sninsky J J, White T J. 1990. PCR Protocols A Guide

to methods and applications. Academic Press Inc.

Iserte J A, Stephan B I, Goni S E, Borio C S, Ghiringhelli P D, Lozano M E.

2013. Family-specific degenerate primer design: a tool to design consensus
degenerated oligonucleotides. Biotechnol Res Int 2013:38364.

Madej R. 1991. Polymerase Chain Reaction : Application to the Clinical

Laboratory, Laboratory Roche Diagnostic Research, p. 23-32, 45-49.

Sambrook J, Russel DW. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd

edition. New York (USA) : Cold Spring Harbor

Suwanto A. 1994. Pulsed-field gel electrophoresis: A revolution in microbial

genetic. Aspac. J. Mol. Biotechnol. 2:78-85.

Vinay K. Singh, R Govindarajan, Sita Naik and Anil Kumar. 2000. The Effect of
Hairpin Structure on PCR Amplification Efficiency. Molecular Biology
Today (2000) 1(3): 67-69.
 LAMPIRAN

Cara Menggunakan Aplikasi Genetyx

Buka aplikasi genetyx, pilih file lalu klik new sequence

Blok sequence dari notepad, lalu copy sequence ke sequence 2 yang ada di aplikasi
genetyx
Lalu save as sequence yang sudah di copy dengan type save gnu

Ppilih file klik multi sequence, lalu klik add pilih file yang tadi disave, lalu klik aligment
Penentuan kandidat primer ikan mas, mylo, medaka

Setelah itu copy sequence yang akan dijadikan kandidat primer ke aplikasi primer
express
Cara Menggunakan Aplikasi Primer Express

Buka aplikasi primer express, lalu pilih file new klik oke

setelah itu paste dari copian sequence hasil dari aplikasi genetyx
setelah itu klik play, maka akan timbul hasil dari primer tersebut forward (biru), probe
(ungu), dan reverse (kuning)