Tutor Divisi Infeksi

PEMERIKSAAN MALARIA

dr. Siti Hotimah/Prof.Dr.dr.Prihartini.SpPK (K)

1 LOGO
 PENDAHULUAN

Ditularkan melalui nyamuk anopheles

Yang mengandung plasmodium

MALARIA
Gejala :
Demam periodik

www.themegallery.com LOGO
EPIDEMIOLOGI MALARIA

HOST

PARASIT

ENVIRONMENT

www.themegallery.com LOGO
ETIOLOGI

Plasmodium Plasmodium
vivax
MALARIA malariae

Plasmodium Plasmodium
falciparum ovale

www.themegallery.com LOGO
5 LOGO
Kriteria WHO 2006

Diagnosa Diagnosa
klinis parasitologi
Pada daerah endemis
rendah:
- Derajat terpapar Mikroskop
malaria cahaya
- Demam 3 hari tanpa
disertai penyakit berat
lainnya
Rapid
Pada daerah endemis Diagnostik
tinggi :
Test (RDT)
- demam 24 jam terakhir
dengan atau tanpa
anemia

6
LOGO
Pemeriksaan mikroskopis

Pewarnaan Giemsa
• Sediaan Darah tipis
• Sediaan Darah tebal

7
LOGO
 Pewarnaan Giemsa

 Merupakan Gold Standar

 Spesimen pemeriksaan :
1. Sampel drh : drh kapiler atau drh vena+ EDTA
2. Pewarnaan Giemsa :
- campuran eosin, metilen biru dan asam metilen.
- Lar.Giemsa stok diencerkan dgn buffer fosfat ph
7,2 menjadi lar.Giemsa 3% dan 5%.

8 LOGO
  Instrumen pemeriksaan :
1. Kaca sediaan, syarat :
- bersih, tidak berdebu
- tidak berlemak/mengandung alkohol
- jernih, tidak kusam/ bergores
2. Mikroskop Cahaya

9 LOGO
  Kriteria sediaan darah (SD) yg berkualitas baik :
1. Latar blk pandang di mikroskop jernih
2. Pewarnaan: inti parasit merah, sitoplasma biru
3. SD hrs bersih, wkt pengambilan SD tdk tercemar
4. Vol. drh yg diambil 2-3 tts
5. SD tidak boleh terfiksasi  proses pewarnaan
terhambat & berwarna hitam (krn alkohol, spiritus,
panas, sinar mthr, terlambat mewarnai bbrp hari)

10 LOGO
 A. SEDIAAN HAPUSAN DARAH
(Thin Smear = hapusan tipis)

• Guna :
1. Menentukan jenis spesies

2. Menghitung jmlh parasit berdsrkan jmlh

eritrosit (mengetahui tingkat parasitemia)

11 LOGO
 CARA PEMBUATAN SEDIAAN & PENGECATAN

Gelas obyek diberi label/kode


Darah diletakkan di bag tengah kaca sediaan

Ujung spreader diletakkan di drh dgn posisi datar smp drh rata
dari ujung ke ujung kmd gesek dgn sudut 45o

Fiksasi methanol smp kering

Warnai dgn lar Giemsa
tunggu 30 mnt

Bilas dgn air kmd dikeringkan

Lihat di mikroskop

12 LOGO
 B.SEDIAAN HAPUSAN TEBAL
(Thick Smear)

• Guna :
1. Menghitung jmlh parasit thd sel drh putih
2. Menentukan nilai ambang parasit/kepadatan parasit (utk pasien
rawat inap).
• Prinsip dasar : suatu metoda konsentrasi atau pemadatan krn
bertumpuk-tumpuk. Pada pewarnaan, sel darah merah
dihilangkan Hb nya shg menjadi transparan & tinggal
kerangkanya atau hancur.

13 LOGO
 CARA PEMBUATAN SEDIAAN & PENGECATAN

Gelas obyek dilabel/kode


Drh 2-3 tts diteteskan di kaca sediaan

Spreader digerakkan melingkar 3-6 putaran btk bulatan 1 cm

Keringkan kaca sediaan

Pengecatan dgn larutan Giemsa, diamkan 30 mnt

Bilas dgn air mengalir smp endapan Giemsa bersih &
keringkan

Lihat di bawah mikroskop

14 LOGO
 Pelaporan
1 2 3
Morfologi
parasit
Spesies Perkiraan Stadium
Plasmodium tingkat parasit (ring
parasitemia form,
trofozoit,
skizon,
gametosit)

LOGO
 Pelaporan hasil malaria
Ada 2 cara pelaporan hasil HDT malaria :
1. Semikuantitatif
2. kuantitatif
a. Semikuantitatif
(-) : tdk ada parasit/ 100 lpb
(+) : ditemukan 1 – 10 parasit/100 lpb
( +2 ) : 11 – 100 parasit/ 100 lpb
( +3 ) : 1 – 10 parasit/lpb
( +4 ) : > 10 parasit/lpb

16
LOGO
b. Cara kuantitatif
a. Tetesan preparat darah tebal.
- Cara terbaik, ± 100/LPB)
-( - ) jk 200 lpB  tidak ditemukan
parasit.

Hitung parasit : menghitung Σ parasit/200 WBC.

Bila WBC 10.000/ul10.000/200 x Σparasit =
Σparasit/ul drh.

17
LOGO
 b. Tetesan preparat darah tipis.
- Identifikasi plasmodium,(jk preparat
drh tbl sulit ditentukan)
- Densitas parasit = hitung parasit,
Σ eritrosit yg (+) parasit/1000
RBC.
Σ parasit > 100.000/ul drh infeksi
berat.
= ΣRBC / 1000 x Σparasit = parasit/ul

18 LOGO
Plasmodium falciparum
 Ring form, tanpa
stadium matang
 Eritrosit normal
 Kecil, halus, double
dots
 Bentuk marginal
 Menjelang tua,
Maurer‘s cleft
 Trofozoit dan skizon
 Jarang pada darah
tepi
 Malaria berat
 Sitoplasma parasit
kompak
 Gametosit
 Bentuk bulan sabit
LOGO
Plasmodium
vivax
 Eritrosit
membesar
 Semua stadium
dapat ditemukan
pada darah tepi
 Schuffner‘s dot
 Trofozoit
ameboid
 Skizon matang 8-
24 merozoit

LOGO
Plasmodium
malariae
 Eritrosit normal
 Bird eye
 Trofozoit
 band form
 basket form
 Skizon rosset
(merozoit 8-12)

LOGO
Plasmodium ovale
 Eritrosit
 Membesar
 James‘s dot
 Oval, fimbrieted
 Trofozoit
 sitoplasma kompak
 Comet form
 Skizon 8-10 merozoit
 Gametosit
 Mirip dengan
P.vivax.

LOGO
 Tes Diagnostik Cepat
(Rapid Diagnostic Test)

sensitivitas ≥
95%,(100% jk deteksi antigen
densitas Demam parasit malaria
menggunakan
parasit Periodik metoda
>100/ul) dan imunokromatografi
spesifisitas ≥
90%

WHO
Dx.Malaria Mekanisme

LOGO
 Pan-specific
HRP-2 pLDH
aldolase
Rapid • Protein larut • Soluble • Antigen yg
dalam air, glycolitic terdapat pd 4
Diagnostic Test diproduksi enzyme spesies
parasit dihasilkan Plasmodium
(RDT) aseksual dan
gemetosit
parasit malaria
aseksual.
stadium
aseksual.
muda • Untuk deteksi • Enzyme
Ada 3 antigen target : P.falciparum parasit hidup glycolitic
• Tedapat pada stadium pathway
membran seksual & • Dikonjugasi dg
1. Histidine-rich eritrosit aseksual Pf HRP-2 untuk
protein 2 (HRP-2) • Persisten dan Pv membedakan
setelah parasit • Sensitifitasnya Pf/mix
aseksual dan lebih rendah infections dari
2. Plasmodium lactate gejala klinis dibanding HRP- infeksi non- P.
dehydrogenase menghilang. 2. falciparum.
(pLDH) • Hanya untuk P. • Ada 3 pLDH • Aldolase :
falciparum test yang highly
tersedia conserved
3. Pan-specific • Pan-specific antigen,
aldolase test konsentrasinya
(aldolase rendah
atau pan- sehingga
malaria sensitifitasnya
pLDH) rendah.
• Spesifik
untuk P.
faciparum
• Spesifik
untuk P.
vivax.
24 LOGO
25 LOGO
26
LOGO
 HRP-2

Sensititas - spesifitas > 98%  P.falciparum A

(tergantung densitas parasit)
KEUNTUNGAN
Hasil dapat dibandingkan dengan B
Gold Standard Test .

Tidak bereaksi silang dengan Plasmodium

yang lain
C

Korelasi dengan gejala klinis. D

LOGO
 HRP-2

Hanya untuk mendeteksi P falsifarum A

saja
KELEMAHAN
Tidak dpt digunakan untuk monitoring B
terapi

Tidak dpt mengidentifikasi ‘caririer

Gametocytes” pada Pf
C

Reaksi silang dg faktor rhematoid D

LOGO
Kombinasi HRP-2 dg Pan specific pLDH

KELEMAHAN :
KEUNTUNGAN : Tidak dapat membedakan
infeksi P.f sendiri atau mix.
Pan Malaria band infections.
spesifik untuk genus Di daerah endemis malaria
Plasmodium dg mix-infeksi tinggi,
diperlukan diagnosis spesifik
Sensitifitasnya tinggi
secara mikroskopis
untuk P.f (HRP-2)
Perkiraan adanya infeksi
spesies yang lain dari
Pan Malaria band

LOGO
 Generasi kedua RDT
Untuk membedakan Pf dan Pv.

Keuntungan Keterbatasan

• Deteksi P. vivax pLDH

dan P.falciparum pLDH. • Tidak dapat digunakan
• Baik digunakan di daerah untuk deteksi Po. dan Pm
perifer (di lapangan,
Puskesmas, Pustu)
• Diagnosis dan
pengobatan bersamaan.
• Dapat digunakan untuk
monitoring pengobatan.

30
LOGO
Keuntungan Keterbatasan

31
LOGO
Deteksi Pan malaria specific pLDH (genus
Plasmodium: Pf, Pv, Po, Pm)
Untuk
deteksi Deteksi
adanya parasit Keterbatasan
parasit hidup
malaria

Keuntungan • Tidak dapat

membaca
Dapat Screening spesies
digunakan darah
untuk
monitor untuk
terapi donor.

32 LOGO
Mikroskopis (+)
ICT (-)
• Bentukan yang mirip plasmodium dalam
darah
• Dibaca bukan oleh tenaga ahli
Mikroskopis (-)
ICT (+)
• Parasitemia < 0,01%
• Parasit berada di deep vein (sequestered di
otak, limpa, hati, plasenta)
33
LOGO
LOGO
 Keuntungan pemeriksaan mikroskopis
Teknisi pengalaman dpt memeriksa densitas parasit 5-10
parasit/µl darah, p.u 100 parasit/µl darah (0,002%)
Dapat membedakan empat spesies dan stadium (ring form,
trofozoit, skizon, gametosit)
Densitas parasit dpt dihitung (monitoring terapi)
Biayanya murah

Kekurangan
Waktu sampai memperoleh hasil 1 jam
P.falciparum : parasitemia berfluktuasi (stadium tua sequestrasi
pd mikro kapiler organ dalam, SD perifer tidak equivalen dg
jumlah parasit sesungguhnya).
Tergantung kualitas teknisi, reagen, mikroskop

35 LOGO
Pewarnaan AO
• SD tipis + pewarna AO
• Diperiksa dengan mikroskop fluoresens
Fluoresensi • Parasit berfluoresensi, latar belakang
biasa hijau
• Morfologi eritrosit dapat diamati,
parasitemia dapat diperkirakan

• SD tipis + pewarna AO
Mikroskop • Diperiksa dengan mikroskop kawamoto
sistem • DX lebih cepat karena parasit terlihat
kawamoto bercahaya
• Lapangan pandang lebih luas

36
LOGO
 • Prinsip : adanya protein pada Plasmodium yang
Quantitative dapat mengikat AO akan mengidentifikasi eritrosit
Buffy Coat terinfeksi Plasmodium
(QBC) • Sensitivitas : 92% - 99,13%
• Spesifisitas : 83,5% - 98,4%

Cara Pemeriksaan

Sampel darah Diperiksa di bawah

dimasukkan ke dalam Tabung lensa obyektif khusus
tabung kapiler kapiler di (paralens) berkekuatan
mengandung AO & sentrifuse 60X yg dihubungkan
anti koagulan fiber optik

37
LOGO
 • Spesifik untuk genus dan spesies
• Sensitivitas genus mencapai 100%.
• Sensitivitas dan spesifitas spesies >90%
• Dapat mendeteksi parasitemia rendah (5 parasit/µl
darah).
Keuntungan • Sampel dalam jumlah besar, segera dpt diperiksa dg
cepat
• Interpretasinya mudah

Keterbatasa • Harga mahal

n • Memerlukan ketrampilan yang tinggi
• Penggunaan dalam skala besar sulit.

38
LOGO
39 LOGO
40 LOGO
41 LOGO
42 LOGO
43 LOGO
 Faktor yg menentukan mutu pewarnaan sediaan drh :

1. Kualitas zat pewarna Giemsa yg digunakan : stok

Giemsa blm tercemar air

2. Kualitas air pengencer Giemsa :

- jernih, tdk bau, tdk tercemar jamur & bakteri

- PH 7,2

3. Kepekatan lar.Giemsa

4. Lamanya reaksi pewarnaan

5. Kualitas pembuatan sediaan drh : ketebalan & fiksasi

6. Kebersihan sediaan drh.

44
LOGO
 Gambaran pengecatan Giemsa yg baik :
1. Scr makros : SD jernih & transparan, warna kombinasi merah,
ungu, biru

2. Scr mikros :

- Ltr blk SD jernih, biru pucat/pucat kemerahan

- Sel/benda kontras & jelas :merah, ungu, biru hitam

- Eritrosit : merah jambu pucat

- Sebag bsr lekosit, ddg sel & sitoplasma dpt dilihat

- Netrofil : inti ungu tua, granula jelas

- Kromatin parasit ungu tua, sitoplasma biru ungu

- Titik-titik dari Maurer & Schuffner terlihat jelas

45
LOGO
 Kelebihan deteksi parasit dgn pewarnaan Giemsa
1. Dpt menentukan tingginya parasitemia, digunakan:
- menentukan beratnya penyakit
- follow up pengobatan utk menentukan resistensi
- menentukan gametocyte rate utk peramalan transisi
2. Dpt menentukan spesies & stadium parasit dgn akurat terutama
pd thin smear.
3. Sediaan dpt disimpan, shg memberikan keuntungan :
- saat pemeriksaan dpt ditunda
- dpt dikirimkan utk cross check & konsultasi
- dpt digunakan utk bahan pendidikan & pelatihan

46
LOGO
 Kelemahan deteksi parasit dgn pewarnaan Giemsa
1. Menghabiskan waktu
a. pembuatan sediaan-pengeringan-pengecatan :
- waktu yg dibutuhkan utk pengecatan 30-45 mnt
- utk evaluasi kultur parasit digunakan pengecatan
kilat dgn Giemsa pekat  sediaan tdk tahan lama
& deferensiasi warna kurang bagus.
b. waktu pemeriksaan mikroskopis/pembacaan > 20
mnt per sediaan terutama bila sediaan negatif,
parasitemia rendah & morfologi meragukan.

47
LOGO
2. Bersifat subyektif, tgt keahlian , pengalaman &
“mood” pemeriksa.
3. Secara teknis :
- memerlukan mikroskop yg terpelihara, sumber
cahaya
yg cukup.
- kualitas Giemsa & buffer fosfat terjaga
- kualitas pewarnaan mempengaruhi interpretasi &
identifikasi.

48
LOGO
1. Pra analitik Sediaan darah tipis :

- tdk mengetahui syarat pengambilan sampel

- sampel diambil pd tempat yg tdk

diperbolehkan

- kode pasien tdk ditulis pada kaca SD

- penulisan kode dg bolpoin.

49
LOGO
2. Analitik :
a. Pembuatan SD yg krg baik

- kaca SD berlemak shg hapusan berlubang & sukar

diamati

- drh diletakkan terlalu ujung shg sukar diamati

- jmlh drh terlalu banyak shg eritrosit menumpuk 

sulit diamati

- ujung spreader tdk rata shg hapusan tdk rata

bergaris & banyak ekor

- semut /lalat memakan SD yg sdh kering.

50
LOGO
b. Pewarnaan:

- kualitas Giemsa kurang baik

- dilakukan pada SD blm kering

- waktu pewarnaan terlalu lama

c. Pemeriksaan mikroskopis :

- penyinaran kurang optimal

- pembesaran kurang

- mikroskop kotor / tdk terpelihara

3. Post analitik :
- kesalahan mengidentifikasi jenis spesies Plasmodium

- kesalahan penghitungan jmlh parasit.

51
LOGO
 • Kesalahan sediaan darah tebal:
• Pra analitik :
- tdk mengetahui syarat pengambilan
sampel

- sampel diambil pd tempat yg tdk

diperbolehkan

- kode pasien tdk ditulis pada kaca SD

- penulisan kode dg bolpoin.

52 LOGO
2. Analitik :

a. Pembuatan SD yg krg baik

- kaca SD berlemak shg hapusan terkelupas selama
proses pewarnaan
- drh terlalu ujung shg sukar diamati
- jmlh drh terlalu banyak shg jmlh lekosit per l.p terlalu
banyak shg menutupi parasit
- jmlh drh terlalu sedikit shg lekosit pada sediaan tdk
cukup (tdk standar)
- tjd autofiksasi pada sediaan
- SD dibiarkan mengering tdk rata
- semut /lalat memakan SD yg sdh kering.

53
LOGO
b. Pewarnaan :

- Mutu Giemsa kurang baik

- dilakukan pada SD blm kering.

- waktu pewarnaan terlalu lama

c. Pemeriksaan mikroskopis :

- penyinaran kurang optimal

- pembesaran kurang

- mikroskop kotor / tdk terpelihara

3. Post analitik :

- kesalahan mengidentifikasi jenis spesies Plasmodium

- kesalahan penghitungan jmlh parasit.

54
LOGO
 Comparison of Rapid Diagnostic Tests for Malaria Antigens
PfHRP2 and PMA
PfHRP2 tests pLDH test
test
Pan-specific
Histidine rich protein Parasite lactate
Plasmodium aldolase.
2 of P. falciparum, dehydrogenase.
parasite glycolytic
Target antigen water soluble protein parasite glycolytic
enzyme produced by
expressed on RBC enzyme produced by
all species and
membrane all species
PfHRP2
General test format 2 lines 3 lines 3 lines
Detects P. falciparum Can detect all 4 Can detect all 4
Capability
only species species
Detected; Detected;
Non-falciparum differentiation differentiation
Not detected
species between the 3 not between the 3 not
possible possible
Mixed infections of Appear as P. Appear as P. Appear as P.
P. falciparum with falciparum; falciparum; falciparum;
non-falciparum differentiation not differentiation not differentiation not
species possible possible possible
> 100-200
parasites/µL for P.
Higher for P. vivax
falciparum and P.
Detection limit >40-100 parasites/µL and other non-
vivax; may be higher
falciparum species
for P. malariae and P.
Ovale
Reported; longer for
Post-treatment
Reported up to 31 pan specific Reported up to 1 -3
persistence of
days antigenemia than for weeks
antigens
PfHRP2
Cross-reactivity
between malarial Reported Reported Reported
species
Cross-reactivity Reported, high (up to Reported. low (3.3%
with auto 83% with rheumatoid Not known with rheumatoid
antibodies factor) factor)
Indication of Positive test indicates
viability of No No presence of viable
parasites 55 parasitemia
LOGO
 Comparison of Peripheral Blood Smear Examination and RDTs for Malaria
Peripheral Smear Rapid Diagnostic Tests
Format Slides with blood smear Test strip
Equipment Microscope Kit only
Training Trained microscopist 'Anyone with a little training'
Test duration 20-60 minutes or more 5-30 minutes
Direct visualization of the Color changes on antibody
Test result
parasites coated lines
Detects malaria antigens
Detects and differentiates all (PfHRP2/ PMA/pLDH) from
Capability
plasmodia at different stages asexual and/or sexual forms of
the parasite
Detection 1 00-500/µL for P. falciparum,
5-10 parasites/µL of blood
threshold higher for non-falciparum
Cannot differentiate among non-
falciparum species; mixed
Species
Possible infections of P. falciparum and
differentiation
non-falciparum appear as P.
falciparum
Quantification Possible Not possible
Differentiation
between sexual Possible Not possible
and asexual stages
Unpredictable efficiency at low
Availability of equipment and and very high parasitemia; cross
skilled microscopists, reactions among plasmodial
Disadvantages
particularly at remote areas and species and with auto-
odd hours antibodies; persistence of
antigens
Status Gold standard Not yet approved by the FDA
Cost per test US$ 0.12-0.40 56 1 .20-13.50
US$
LOGO
 Comparison of Peripheral Blood Smear Examination and RDTs for Malaria
Peripheral Smear Rapid Diagnostic Tests
Format Slides with blood smear Test strip
Equipment Microscope Kit only
Training Trained microscopist 'Anyone with a little training'
Test duration 20-60 minutes or more 5-30 minutes
Direct visualization of the Color changes on antibody
Test result
parasites coated lines
Detects malaria antigens
Detects and differentiates all (PfHRP2/ PMA/pLDH) from
Capability
plasmodia at different stages asexual and/or sexual forms of
the parasite
Detection 1 00-500/µL for P. falciparum,
5-10 parasites/µL of blood
threshold higher for non-falciparum
Cannot differentiate among non-
falciparum species; mixed
Species
Possible infections of P. falciparum and
differentiation
non-falciparum appear as P.
falciparum
Quantification Possible Not possible
Differentiation
between sexual Possible Not possible
and asexual stages
Unpredictable efficiency at low
Availability of equipment and and very high parasitemia; cross
skilled microscopists, reactions among plasmodial
Disadvantages
particularly at remote areas and species and with auto-
odd hours antibodies; persistence of
antigens
Status Gold standard Not yet approved by the FDA
Cost per test US$ 0.12-0.40 57 1 .20-13.50
US$
LOGO
Collection of Blood Smears

1. 4.
The second or Slide must always
third finger is be grasped by its
usually selected edges.
and cleaned.

2. 5.
Puncture at the Touch the drop of
side of the ball of blood to the slide
the finger. from below.

3.
Gently squeeze
toward the
puncture site.

LOGO
Preparing thick and thin films

1. 4.
Touch one drop Carry the drop of
of blood to a blood to the first slide
clean slide. and hold at 45 degree
angle.
2. 5.
Spread the first Pull the drop of blood
drop to make a 1 across the first slide
cm circle. in one motion.

3. 6.
Touch a fresh drop Wait for both to
of blood to the dry before fixing
edge of another and staining.
slide.

LOGO
Recognizing Malaria Parasites

Blue cytoplasm
Inside a red blood cell

One or more red chromatin dots

LOGO
Recognizing Erythrocytic Stages:
Schematic Morphology

Blue
Cytoplasm

RING Red TROPHOZOITE

Chromatin

Brown
Pigment

SCHIZONT GAMETOCYTE

LOGO
Malaria Parasite Erythrocytic
Stages

Ring form

Trophozoite
Schizont

Gametocytes

LOGO
Species Differentiation on
Thin Films
Feature P. falciparum P. vivax P. ovale P. malariae

Enlarged infected RBC + +

Infected RBC shape round round, oval, round

distorted fimbriated

Stippling infected RBC Mauer clefts Schuffner Schuffner none

spots spots
Trophozoite shape small ring, large ring, large ring, small ring,
appliqu amoeboid compact compact
Chromatin dot often double single large single

Mature schizont rare, 12-30 12-24 4-12 6-12

merozoites merozoites merozoites merzoites

Gametocyte crescent shape large, large, compact,

round round round

LOGO
Species Differentiation on
Thick Films
Feature P. falciparum P. vivax P. ovale P. malariae

Uniform trophozoites +

Fragmented trophozoites ++ +
Compact trophozoites + +

Pigmented trophozoites +

Irregular cytoplasm + +

Stippling (“RBC ghosts”) + +

Schizonts visible very rarely often often often

Gametocytes visible occasionally usually usually usually

LOGO