LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

PENGECATAN BAKTERI DENGAN TEKNIK PEWARNAAN

GRAM (GRAM STAIN)

Matthew Kevin Imani Kaeng

2213041006

Dosen Pembimbing:
Jean Nihana Manalu, S.P., M.Si.

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI

JURUSAN BIOLOGI DAN PERIKANAN KELAUTAN
UNIVERSITAS PENDIDIKAN GANESHA
2023
 1 PENDAHULUAN

Latar Belakang
Menurut Ristiati (2015), pengecatan gram merupakan salah satu teknik
pewarnaan bakteri dengan utilitas fundamental dalam mikrobiologi. Secara historis,
teknik pewarnaan ini dikembangkan oleh seorang dokter berkebangsaan Denmark
bernama Dr. Hans Christian Gram (Cappuccino & Sherman, 2014). Lebih lanjut,
Cappuccino & Sherman (2014) menyatakan bahwa tujuan dari teknik pengecatan
Gram adalah untuk mengidentifikasi bakteri berdasarkan karakteristik dinding
selnya.
Madigan dkk (2012) menyatakan bahwa berdasarkan karakteristik dinding
selnya, bakteri digolongkan ke dua kelompok dasar, yakni bakteri Gram positif
serta bakteri Gram negatif. Bakteri Gram positif memiliki dinding sel yang tersusun
atas lapisan peptidoglikan yang tebal dan akan terwarnai ungu melalui pengecatan
Gram (Cappuccino & Welsh, 2017). Di sisi lain, bakteri Gram negatif mempunyai
dinding sel yang komposisinya berupa lapisan tipis peptidoglikan dan akan
tewarnai merah melalui pengecatan Gram (Ristiati, 2015).
Dalam agenda praktikum ini, praktikan melakukan teknik pengecatan Gram
dengan intensi untuk mengidentifikasi jenis isolat bakteri dari sampel air ledeng
yang telah diinokulasi sebelumnya berdasarkan komposisi dinding selnya. Dengan
kata lain, praktikan bermaksud untuk mengetahui apakah jenis isolat bakteri
tersebut tergolong ke dalam jenis bakteri Gram positif atau bakteri Gram negatif.
Selain itu, aplikasi teknik pewarnaan Gram juga dilakukan dengan tujuan
agar praktikan dapat mengobservasi secara saksama bentuk sel dari isolat bakteri.
Dengan demikian, hasil dari pengecatan Gram ini akan menjadi instrumen esensial
dalam proses penelitian lanjutan mengenai klasifikasi hingga diferensiasi isolat
bakteri dari sampel air ledeng yang dikultivasi praktikan.

Tujuan
Melalui agenda praktikum ini, praktikan diharapkan mampu
mengaplikasikan teknik pengecatan atau pewarnaan gram pada suatu sampel
bakteri secara benar dan tepat.
 2 BAHAN DAN METODE

Waktu dan Tempat

Agenda praktikum pengecatan bakteri dengan menggunakan teknik
pewarnaan Gram ini dilangsungkan pada tanggal 3 Oktober 2023, pukul 07.30-
10.30 WITA, di Laboratorium Mikrobiologi Universitas Pendidikan Ganesha.

Alat dan Bahan

Dalam agenda praktikum pengecatan Gram ini, praktikan menggunakan alat
fundamental, mulai dari korek, bunsen, jarum ose, bak pewarnaan, pipet tetes,
penjepit tabung reaksi, gelas objek, gelas penutup, hingga mikroskop cahaya.
Sementara itu, bahan yang dibutuhkan praktikan dalam praktikum
pengecatan Gram ini adalah berbagai reagen atau pereaksi kimia dengan peranan
spesifik dalam proses pewarnaan, seperti kristal violet, larutan mordan berupa
larutan lugol, larutan alkohol 95%, hingga safranin. Selain itu, praktikan juga
memanfaatkan aquades ketika proses pewarnaan berlangsung.

Cara Kerja
Teknik pewarnaan Gram yang dilakukan oleh praktikan terdiri dari berbagai
tahapan yang dapat dijabarkan secara terperinci sebagai berikut.
Tahap pertama, penyalaan bunsen dengan menggunakan korek api
sehingga bunsen dapat menghasilkan api. Api bunsen ini digunakan dalam proses
sterilisasi jarum inokulasi atau jarum ose.
Tahap kedua, pengambilan sampel bakteri dari isolat dengan kode ALE
BPK dengan menggunakan jarum ose yang steril.
Tahap ketiga, penetesan setitik air di atas gelas objek. Tahapan ini penting
dilakukan karena sampel bakteri yang digunakan dalam proses pewarnaan berasal
dari isolat yang dikultivasi dalam media padat.
 Tahap keempat, pengolesan sampel bakteri pada titik air yang terdapat di
kaca objek. Tahapan ini dilanjutkan dengan pengadukan atau penyebaran sampel
bakteri di titik air tersebut secara merata.
Tahap kelima, fiksasi gelas objek dengan melewatkan gelas objek di atas
api bunsen. Tujuan dari tahapan ini adalah memfasilitasi proses perlekatan atau
penempelan sel bakteri pada gelas objek.
Tahap keenam, penetesan kristal violet menggunakan pipet tetes pada
gelas objek berisi sampel bakteri. Kristal violet sendiri berperan sebagai pewarna
utama yang memberikan warna ungu pada sampel bakteri terkait. Setelah
penetesan, gelas objek didiamkan selama satu menit.
Tahap ketujuh, pembilasan gelas objek yang telah ditetesi kristal violet
dengan aquades. Tahapan ini dilanjutkan dengan pengeringan singkat gelas objek.
Tahap kedelapan, penetesan larutan mordan berupa larutan iodin atau
lugol menggunakan pipet tetes pada gelas objek berisi sampel bakteri. Penetesan
larutan mordan bersifat fundamental karena larutan inilah yang akan
mengintensifkan atau menguatkan pewarna utama. Tahapan ini diakhiri dengan
pendiaman gelas objek selama dua menit.
Tahap kesembilan, pembilasan gelas objek yang telah ditetesi larutan lugol
dengan aquades. Tahapan ini dilanjutkan dengan pengeringan singkat gelas objek.
Tahap kesepuluh, penetesan alkohol dengan kadar 95% pada gelas objek
berisi sampel bakteri, dilanjutkan dengan pendiaman selama 15 detik. Pada tahapan
ini, alkohol berfungsi sebagai pencuci atau pembilas karena terlibat dalam proses
dekolorisasi pewarna utama.
Tahap kesebelas, pembilasan gelas objek yang telah ditetesi larutan
alkohol dengan aquades. Tahapan ini dilanjutkan dengan pengeringan gelas objek.
Tahap kedua belas, penetesan safranin pada gelas objek berisi sampel
bakteri dengan menggunakan pipet tetes. Safranin ini berperan sebagai zat warna
kedua atau zat warna penutup yang mewarnai kembali sel bakteri yang telah
kehilangan cat utama akibat dekolorisasi dengan warna merah.
Tahap ketiga belas, pembilasan gelas objek yang telah ditetesi safranin
dengan aquades. Tahapan ini dilanjutkan dengan pengeringan singkat gelas objek.
 Tahap keempat belas, penetesan minyak imersi pada gelas objek berisi
sampel bakteri yang telah dikeringkan. Tujuan dari tahapan ini adalah untuk
memfasilitasi proses observasi sampel bakteri di bawah mikroskop cahaya karena
minyak imersi memiliki kapabilitas dalam memperjelas objek pengamatan.
Tahap kelima belas, penutupan gelas objek dengan cover glass. Tahapan
ini berperan penting dalam menunjang proses pengamatan sampel bakteri di bawah
mikroskop cahaya.
Tahap terakhir, observasi sampel bakteri menggunakan mikroskop
cahaya. Pengamatan ini dilakukan dengan mengaplikasikan pembesaran ideal
untuk proses observasi sel bakteri yang berukuran sangat kecil. Nantinya, hasil
observasi akan didokumentasikan menggunakan smartphone lalu dianalisis.

3 HASIL DAN PEMBAHASAN

Isolat Bakteri dari Sampel Air Ledeng dan Hasil Pengecatan Gram-nya
Hasil pewarnaan Gram pada sampel bakteri yang berasal dari isolat dengan
kode 𝐴𝐿𝐸𝐵𝐾𝑃 tergolong sukses. Hal tersebut dikarenakan mikrograf menunjukkan
warna sel-sel bakteri yang kemerahan setelah dilakukan pengecatan. Selain itu,
tampak pula bentuk bakteri yang menyerupai batang (basil) pada mikrograf.
Berdasarkan hasil observasi tersebut, isolat bakteri dari sampel air ledeng
dengan kode 𝐴𝐿𝐸𝐵𝐾𝑃 dapat digolongkan atau diklasifikasikan sebagai bakteri Gram
negatif dari Genus Escherichia. Dengan demikian, seleras dengan yang dinyatakan
Cappuccino & Welsh (2017), bakteri ini memiliki dinding sel yang tersusun atas
lapisan peptidoglikan tipis serta terletak di area periplasmik (di antara dua
membran, yakni membran plasma luar dalam dalam) sehingga akan terwarnai
merah saat pengecatan Gram.
Lebih lanjut, bakteri ini juga bersifat patogenik. Hal tersebut dikarenakan
pada bakteri Gram negatif terdapat eksistensi lipopolisakarida pada membran
plasma bagian luar atau membran luarnya (Madigan dkk, 2012). Menurut
Cappuccino & Sherman (2014), kompleks gabungan karbohidrat-lipid ini terbukti
 memiliki bagian tertentu yang bersifat toksik (beracun) dengan kapabilitas memicu
reaksi inflamasi (peradangan).
Nah, warna merah yang tampak pada bakteri Escherichia sp. ini terbentuk
melalui serangkaian proses yang melibatkan keseluruhan reagen atau reaktan dalam
operasional pewarnaan Gram (Cappuccino & Welsh, 2017). Mekanismenya dapat
dijabarkan sebagai berikut.
Saat pewarna utama berupa kristal violet diberikan, zat warna ungu tersebut
akan berikatan dengan dinding sel bakteri Escherichia sp. yang tersusun atas
lapisan peptidoglikan tipis. Kemudian, penambahan iodin atau lugol akan
mengintensifkan pewarna tersebut lalu membentuk kompleks kristal violet-iodium.
Namun, saat alkohol berkadar 95% diberikan, membran luar bakteri Gram
negatif tersebut akan terdegrasi. Selain itu, sifat dekolorisasi yang dimiliki alkohol
akan mengakibatkan rusaknya kompleks kristal violet-iodium sehingga warna ungu
yang sempat terbentuk pada dinding selnya akan luntur atau tercuci.
Selanjutnya, saat diberi pewarna kedua berupa safranin, zat warna merah
tersebut akan berikatan dengan dinding sel bakteri Escherichia sp yang sebelumnya
telah kehilangan warna akibat pemberian alkohol. Alhasil, warna merahlah yang
akan tampak pada sel bakteri tersebut.
Nah, berbagai data konkret hasil pengecatan Gram bakteri negatif dari
Genus Escherichia ini tersaji secara komplet pada tabel berikut.
Tabel Hasil Pewarnaan Gram Sampel Isolat Bakteri
Kode Hipotesis
No Karakteristik Bakteri Pewarnaan Bakteri
Isolat Spesies
Escherichia
sp.

1 𝐴𝐿𝐸𝐵𝐾𝑃

Jenis Bakteri: Bakteri Gram Negatif

Sifat Bakteri: Relatif Patogenik
Warna Bakteri: Putih Kekuningan Bentuk Bakteri: Batang/Basil (Rod)
 Selain berlandaskan pada hasil pengecatan Gram, penggolongan isolat
bakteri dengan kode 𝐴𝐿𝐸𝐵𝐾𝑃 ke dalam Genus Escherichia juga didasarkan pada
warna dari koloni bakteri tersebut di media pertumbuhannya, yakni nutrient agar
(NA). Berdasarkan hasil penelitian Hossain dkk (2021), karakteristik morfologi,
khususnya warna, dari koloni bakteri Genus Escherichia pada nutrient agar
cenderung putih dengan sedikit warna kuning. Dengan demikian, keselarasan antara
warna koloni bakteri Escherichia sp yang dikultivasi praktikan dengan warna
koloni bakteri sejenis pada hasil penelitian lain yang berkaitan sudah tercapai.
Sejatinya, bakteri Escherichia sp. termasuk koliform (coliform). Menurut
Knechtges (2011), koliform merupakan bakteri gram negatif berbentuk batang
dengan sifat anaerob fakultatif yang tidak membentuk spora. Hal ini dipertegas
dengan oleh Batt (2014) yang menyatakan bahwa Escherichia, bersama Citrobacter,
Enterobacter, dan Klebsiella, tergolong koliform. Secara spesifik, bakteri
Escherichia sp. termasuk koliform fekal (Suriaman, 2008).
Lebih lanjut, bakteri dari Genus Escherichia memang lazim ditemukan pada
air ledeng atau air keran sebagai suatu kontaminan. Hal ini dibuktikan langsung
pada hasil penelitian Restina dkk pada tahun 2013 yang mendapati kontaminasi
spesies bakteri Escherichia coli pada sejumlah sampel air PDAM di Kelurahan
Gedong Air Lampung, Bandar Lampung. Fakta ini semakin dipertegas oleh
penelitian yang dilangsungkan oleh Hamida dkk pada tahun 2019 yang
menyimpulkan bahwa seluruh sampel air keran di Kampus ISTN Jagakarsa, Jakarta
Selatan, tercemar bakteri Escherichia coli dengan resistensi spesifik terhadap
antibiotik amoksisilin.

4 SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan
Isolat bakteri dari sampel air ledeng dengan kode 𝐴𝐿𝐸𝐵𝐾𝑃 tergolong bakteri
Gram negatif dari Genus Escherichia karena menujukkan warna merah setelah
diaplikasikan teknik pewarnaan Gram, memiliki bentuk basil atau batang,
cenderung bersifat patogenik, serta memang terbukti lazim ditemukan pada air
ledeng atau air keran berdasarkan hasil penelitian sejenis.

Saran
Praktikan menyarankan pembaca agar memperhatikan aspek waktu
pendiaman dan pengeringan gelas objek saat proses pewarnaan Gram
dilangsungkan sehingga mengoptimalkan berbagai tahapan pengecatan yang telah
dilangsungkan sebelumnya. Selain itu, praktikan juga merekomendasikan pembaca
agar menggunakan minyak imersi dalam kadar yang sesuai guna memperjelas
mikrograf sel bakteri hasil pewarnaan saat proses observasi.

DAFTAR PUSTAKA

Batt, Carl A., dkk. 2014. Encyclopedia of Food Microbiology Second Edition.
USA: Elsevier Ltd.
Cappucino., & Sherman. 2014. Microbiology: A Laboratory Manual Tenth Edition.
USA: Pearson Education, Inc.
Cappuccino, James G., & Welsh, Chad. 2017. Microbiology: A Laboratory Manual
Eleventh Edition. USA: Pearson Education, Inc.
Hamida, Fathin., dkk. 2019. Escherichia coli Resisten Antibiotik Asal Air Keran di
Kampus ISTN. Jurnal Kesehatan. 12(1): 63-72.
Hossain, M., dkk. 2021. Identification and Antibiogram Assay of Escherichia Coli
Isolated from Chicken Eggs. Journal of Bio-Science. 29(1): 123-133.
Knechtges, Paul L. 2011. Food Savety Teory and Practice. East Carolina
University: Jones & Bartlett Learning.
Madigan, Michael T., dkk. 2012. Brock Biology of Microorganisms Thirteenth
Edition. San Francisco: Benjamin Cummings.
Restina, Devi., dkk. 2019. Identifikasi Bakteri Escherichia coli pada Air PDAM dan
Air Sumur di Kelurahan Gedong Air Bandar Lampung. Jurnal
Agromedicine. 6(1): 58-62.
Ristiati, Ni Putu. 2015. Pengantar Mikrobiologi Umum. Denpasar: Udayana
University Press.
Suriaman, Edi Juwita. 2008. Uji Kualitas Air. (Skripsi Sarjana, Universitas Islam
Negeri Malang).

LAMPIRAN

➢ Potret Isolat Bakteri dengan Kode 𝑨𝑳𝑬𝑩𝑲𝑷 yang Menjadi Sumber Sampel
➢ Mikrograf Hasil Pewarnaan Gram Sampel Bakteri dari Isolat Berkode
𝑨𝑳𝑬𝑩𝑲𝑷 (Pembesaran 100x)

➢ Mikrograf Hasil Pewarnaan Gram Sampel Bakteri dari Isolat Berkode

𝑨𝑳𝑬𝑩𝑲𝑷 (Pembesaran 400x)