LAPORAN PRAKTIKUM GANGGUAN METABOLISME

PEMERIKSAAN HBA1C
METODE ELISA

PROBANDUS
Nama : Tn. Dramabarata Nama : Bunga Mawarni
Umur : 45 tahun
Jenis Kelamin : laki-laki Kelas : 2.A1
Jenis sampel/kasus : Serum/plasma
Tanggal Praktikum : Senin, 18 Oktober 2021

METODE : ELISA

I. TUJUAN :
Untuk pengukuran kuantitatif in vitro HbA1c dalam serum manusia, plasma dan lisat
eritrosit.

II. PRINSIP :
Pengujian ini menggunakan teknik immunoassay enzim penghambatan kompetitif. Sebuah
antibodi monoklonal khusus untuk HbA1c telah pra-dilapisi ke microplate. Reaksi
penghambatan kompetitif diluncurkan antara biotin berlabel HbA1c dan HbA1c tidak
berlabel (Standar atau sampel) dengan antibodi pra-dilapisi khusus untuk HbA1c. Setelah
inkubasi, konjugat yang tidak terikat dicuci. Selanjutnya, avidin terkonjugasi ke
Horseradish Peroxidase (HRP) ditambahkan ke masing-masing sumur mikro dan
diinkubasi. Jumlah konjugat HRP yang terikat berbanding terbalik dengan konsentrasi
HbA1c dalam sampel. Setelah penambahan larutan substrat, intensitas warna yang
terbentuk berbanding terbalik dengan konsentrasi HbA1c dalam sampel.

III. ALAT dan BAHAN :

Alat
- Microplate
- Plate sealer
- Microplate shaker
- Incubator
- Micropipet
- Kertas penyerap
- Botol semprot
Bahan
- Sampel

| Laporan Prak. Gangguan Metabolisme 2021 |

 LAPORAN PRAKTIKUM GANGGUAN METABOLISME

- Standar
- Pengencer standar
- Reagen Deteksi A, B
- Pengencer Uji A, B
- Substrat TMB
- Stop solution
- Wash buffer

IV. CARA KERJA :

1. Siapkan semua reagen, sampel dan standar;
2. Tambahkan 50μL standar atau sampel ke setiap sumur.
Dan kemudian segera tambahkan 50μL Reagen Deteksi A yang telah disiapkan.
Kocok dan campur. Inkubasi 1 jam pada suhu 37˚C;
3. Aspirasi dan cuci 3 kali;
4. Tambahkan 100μL Reagen Deteksi B yang telah disiapkan. Inkubasi 30 menit
pada suhu 37˚C;
5. Aspirasi dan cuci 5 kali;
6. Tambahkan Larutan Substrat 90μL. Inkubasi 10-20 menit pada suhu 37˚C;
7. Tambahkan 50μL Stop Solution. Baca pada 450 nm segera.

V. NILAI NORMAL :
< 6,5%

VI. HASIL :
5,7 %

VII. KESIMPULAN :
Hasil dari pemeriksaan HbA1c metode ellisa adalah sampel darah probandus normal.

| Laporan Prak. Gangguan Metabolisme 2021 |

 LAPORAN PRAKTIKUM GANGGUAN METABOLISME

PEMERIKSAAN HBAIC
METODE TURBIDIMETRI

PROBANDUS
Nama : Tn. Dramabarata
Umur : 45 tahun
Jenis Kelamin : laki-laki
Jenis sampel/kasus : Darah vena EDTA
Tanggal Praktikum : Senin, 18 Oktober 2021

METODE : Turbidimetri

I. TUJUAN :
Untuk penentuan kuantitatif HbA1c dalam sampel whole blood dengan antikoagulan
EDTA

II. PRINSIP :
Metode ini secara langsung menentukan hemoglobin A1c (HbA1c) dalam darah lengkap,
menggunakan reaksi antigen dan antibodi. Total hemoglobin dan HbA1c bersaing untuk
tingkat absorpsi yang tidak spesifik terhadap partikel lateks (R1). Ketika antibodi
monoklonal HbA1c anti-manusia ditambahkan (R2), kompleks antibodi HbA1c lateks-
HbA1c-anti-manusia terbentuk. Adanya antibodi poliklonal IgG anti-tikus kambing
menyebabkan terjadinya aglutinasi partikel (kompleks). Besarnya aglutinasi sebanding
dengan konsentrasi HbA1c dalam sampel dan dapat diukur dengan turbidimetri.

III. ALAT dan BAHAN :

Alat
a. Termostatic bath
b. Spektrofotometer atau fotometer termostat
Bahan
a. Reagen
- R1 Suspensi Lateks. Partikel polystyrene dalam buffer, stabilizer. pH 8,0 +/- 0,2
- R2a Antibodi A Antibodi monoklonal HbA1c anti-manusia tikus dalam buffer,
natrium azida 0,9 g/L.
- R2b Antibodi B Antibodi poliklonal IgG anti-tikus kambing dalam buffer,
natrium azida 0,9 g/L.
- R1 Reagen Lise. Ref: 3156005 Penyangga, natrium azida 0,9 g/L.
b. Sampel
c. Blanko (aquadest)

| Laporan Prak. Gangguan Metabolisme 2021 |

 LAPORAN PRAKTIKUM GANGGUAN METABOLISME

d. Kalibrator: Gunakan 4 level Kalibrator HbA1c. Gunakan ClNa 9 g/L sebagai

kalibrator 0.

IV. CARA KERJA :

Prosedur awal
Panaskan reagen dan fotometer (tempat kuvet) hingga 37ºC
Prosedur Analitis (Catatan 3).
1. Menggunakan air suling, instrumen nol pada 600 nm
2. Pipet ke dalam kuvet:
Suspensi lateks (R1) 0,7 mL
3. Inkubasi 3-5 menit pada suhu 37ºC
4. Pipet:
Sampel / Kalibrator / Air
20 L
(Kosong)
5. Inkubasi 5 menit pada suhu 37ºC.
6. Pipet
Antibodi (R2) 0,250 mL
7. Aduk rata dan inkubasi pada suhu 37ºC selama 5 menit. Pada akhir periode ini, baca
absorbansi (A) pada 600 nm.

V. NILAI NORMAL :
< 6,5 %

VI. HASIL :
5,7 %

VII. KESIMPULAN :
Hasil dari pemeriksaan HbA1c metode turbidimetri adalah sampel darah probandus
normal.

| Laporan Prak. Gangguan Metabolisme 2021 |

 LAPORAN PRAKTIKUM GANGGUAN METABOLISME

PEMERIKSAAN HBAIC
METODE HPLC

PROBANDUS
Nama : Tn. Dramabarata
Umur : 45 tahun
Jenis Kelamin : laki-laki
Jenis sampel/kasus : Darah EDTA
Tanggal Praktikum : Senin, 18 Oktober 2021

METODE : HPLC

I. TUJUAN :
untuk penentuan kuantitatif HbA1c dalam darah lengkap.

II. PRINSIP :
Untuk penentuan HbA1c dilakukan lisis sel darah terlebih dahulu. Sampel diinkubasi pada
suhu 37 °C untuk menghilangkan bentuk aldimina yang tidak stabil. Setelah sentrifugasi
supernatan disuntikkan ke dalam sistem HPLC. Pemisahan gradien melalui HPLC pada
suhu 30°C berlangsung selama 5 menit. Kromatogram direkam oleh detektor UV.
Kuantifikasi dilakukan dengan kalibrator darah yang dikirim; konsentrasi dihitung melalui
integrasi ketinggian puncak masing-masing daerah.

III. ALAT dan BAHAN :

Alat
- Tabung reaksi 1,5 ml (Eppendorf)
- Mesin sentrifugal
- Berbagai pipet
- HPLC dengan detektor UV
- Pengocok atau penangas air yang dapat dipanaskan
- Pengaduk pusaran
Bahan
- Sampel darah EDTA
- Reagen uji HbA1c HPLC Assay Kit

IV. CARA KERJA :

1. Pipet ke dalam tabung reaksi 1,5 ml:
5 µl Sampel + 1250 µl HEM
2. Aduk rata. Tinggalkan tabung untuk 30 menit pada 37°C dan centrifuge setelah itu
di 10.000g selama 2 menit.

| Laporan Prak. Gangguan Metabolisme 2021 |

 LAPORAN PRAKTIKUM GANGGUAN METABOLISME

3. CAL dan CTRL siap digunakan setelah rekonstitusi.

4. Suntik 20 µl dari supernatan untuk kromatografi ke dalam sistem HPLC. Supernatan
stabil dalam gelap setidaknya selama 24 jam pada 2-8°C.

V. NILAI NORMAL :
< 6,5 %

VI. HASIL :
5,7 %

VII. KESIMPULAN :
Hasil dari pemeriksaan HbA1c metode HPLC adalah sampel darah probandus normal.

| Laporan Prak. Gangguan Metabolisme 2021 |

 LAPORAN PRAKTIKUM GANGGUAN METABOLISME

PEMERIKSAAN HBAIC
METODE ENZIMATIK

PROBANDUS
Nama : Tn. Dramabarata
Umur : 45 tahun
Jenis Kelamin : laki-laki
Jenis sampel/kasus : Darah EDTA
Tanggal Praktikum : Senin, 18 Oktober 2021

METODE : Enzimatik

I. TUJUAN :
untuk penentuan kuantitatif in vitro hemoglobin A1c (HbA1c) dalam darah lengkap pada
sistem fotometrik.

II. PRINSIP :
Konsentrasi HbA1c dan hemoglobin ditentukan secara terpisah dan digunakan untuk
menghitung rasio HbA1c dari total hemoglobin secara eksklusif.
Pengukuran hemoglobin Sampel darah utuh dilisiskan dengan larutan hemolisis.
Hemoglobin dilepaskan dari eritrosit. Absorbansi hemoglobin diukur pada 570 nm setelah
penambahan reagen R1 dan sebanding dengan konsentrasi hemoglobin total dalam sampel.
Pengukuran HbA1c
Setelah penambahan R2, dipeptida fruktosilasi dari bagian N-terminal dari rantai
hemoglobin dilepaskan oleh protease. Hidrogen peroksida (H2HAI2) diproduksi oleh
pembelahan oksidatif dipeptida fruktosilasi oleh FPOX (fructosyl peptide oxidase).
H2HAI2 dihasilkan ditentukan secara kolorimetri melalui reaksi dengan kromogen dengan
adanya peroksidase pada 660 nm. Peningkatan absorbansi sebanding dengan konsentrasi
HbA1c.

III. ALAT dan BAHAN :

Alat
- Sentrifuge
- Micropipet + tip
Bahan
- Sampel
- Kalibrator
- Reagen 1, 2

| Laporan Prak. Gangguan Metabolisme 2021 |

 LAPORAN PRAKTIKUM GANGGUAN METABOLISME

IV. CARA KERJA :

Persiapan
Kalibrator Kalibrator Kontrol
Sampel
Tingkat 1 Level 2
TruCal HbA1c - - -
16 µL
bersih Tingkat 1
TruCal HbA1c - - -
50 µL
bersih Level 2
TruLab HbA1c - -
bersih Level 1
50 µL 50 µL
dan Level 2 /
sampel
Menambahkan
Jaringan HbA1c
1000 µL 1000 µL 1000 µL 1000 µL
hemolysis larutan
Campur dan biarkan selama 1 menit. Hemolisis selesai setelah 1 menit. Sedikit
kekeruhan tetap ada karena komposisi larutan hemolysis.

V. NILAI NORMAL :
< 6,5 %

VI. HASIL :
5,7 %

VII. KESIMPULAN :
Hasil dari pemeriksaan HbA1c metode enzimatik adalah sampel darah probandus normal.

| Laporan Prak. Gangguan Metabolisme 2021 |

 LAPORAN PRAKTIKUM GANGGUAN METABOLISME

PEMBAHASAN

HbA1c yang lebih dikenal dengan hemoglobin glikat adalah salah satu fraksi
hemoglobin yang terbentuk dari reaksi non-enzimatik antara glukosa dengan N terminal
Valin rantai b hemoglobin A dengan ikatan Almidin. Produk yang dihasilkan ini diubah
melalui proses Amadori menjadi ketoamin yang stabil dan irreversibel (Widijanti dan
Ratulangi, 2011).
Terdapat beberapa metode yang sering digunakan dalam pemeriksaan kadar HbA1c
antara lain:
1. Metode Kromatografi Pertukaran Ion (Ion Exchange Chromatography)
Prinsip dari metode ini adalah titik isoelektrik HbA1c lebih rendah dan lebih
cepat bermigrasi dibandingkan komponen Hb lainnya. Apabila menggunakan
metode ini harus dikontrol perubahan suhu reagen dan kolom, kekuatan ion dan
pH dari buffer (Widijanti dan Ratulangi, 2011). Kelemahan dari metode ini
adalah adanya interferensi variabel dari hemoglobinopati, HbF dan
carbamylated Hb (HbC) yang bisa memberikan hasil negative palsu.
Keuntungan metode ini adalah dapat memeriksa kromatogr am Hb varian
dengan tingkat presisi yang tinggi (Harefa, 2011).
2. Metode HPLC (High Performance Liquid Chromatography)
Metode ini memiliki prinsip yang sama dengan Ion Exchange
Chromatography, bisa diotomatisasi serta memiliki akurasi dan presisi yang
baik sekali. Metode ini juga direkomendasikan menjadi metode referensi untuk
pemeriksaan kadar HbA1c (Widijanti dan Ratulangi, 2011).
3. Metode Agar Gel Elektroforesis
Metode ini memiliki hasil yang berkorelasi dengan baik dengan HPLC
tetapi presisinya kurang dibandingkan HPLC. HbF memberikan hasil positif
palsu tetapi kekuatan ion, pH, suhu, HbS dan HbC tidak banyak berpengaruh
pada metode ini (Widijanti dan Ratulangi, 2011).
4. Metode Immunoassay (EIA)
Prinsip dari metode ini adalah ikatan yang terjadi antara antibodi dengan
glukosa dan antara asam amino-4 dengan 10 N-terminal rantai β. Kelemahan
dari metode ini adalah dipengaruhi oleh gangguan hemoglobinopati dengan
asam amino lengkap pada sisi yang berikatan dan beberapa gangguan yang
berasal dari HbF (Harefa, 2011) sehingga metode ini hanya mampu mengukur
HbA1c dan tidak dapat mengukur HbA1c yang labil maupun HbA1A dan
HbA1B (Widijanti dan Ratulangi, 2011). Keuntungan dari metode ini adalah
tidak dipengaruhi oleh HbE dan HbD maupun carbamylated Hb, relatif lebih
mudah diimplementasikan pada berbagai format yang berbeda dan memiliki
presisi yang baik (Harefa, 2011).
5. Metode Affinity Chromatography

| Laporan Prak. Gangguan Metabolisme 2021 |

 LAPORAN PRAKTIKUM GANGGUAN METABOLISME

Prinsip dari metode ini adalah glukosa yang terikat pada asam m-
aminofenilboronat. Kelemahan dari metode ini adalah bukan hanya mengukur
glikasi valin pada N-terminal rantai β tetapi juha glikasi rantai β pada bagian
lain dan glikasi rantai α sehingga hasil pengukuran dengan metode ini lebih
tinggi daripada dengan metode HPLC (Harefa, 2011). Keuntungan metode ini
adalah non-glycated hemoglobin serta bentuk labil dari HbA1c tidak
mengganggu penetuan hemoglobin glikasi, tidak dipengaruhi suhu, presisi baik,
HbF, HbS dan HbC hanya sedikit mempengaruhi metode ini (Widijanti dan
Ratulangi, 2011).
6. Metode Analisis Kimiawi dengan Kolorimetri
Metode ini memerlukan waktu inkubasi yang lama yaitu sekitar 2 jam tetapi
keuntungannya lebih spesifik karena tidak dipengaruhi oleh -glycosylated
ataupun glycosylated labil. Kerugiannya adalah waktu lama, sampel besar dan
satuan pengukuran yang kurang dikenal oleh klinisi yaitu mmol/L (Widijanti
dan Ratulangi, 2011). Prinsip dari metode ini adalah glukosa yang terikat pada
asam m- aminofenilboronat. Kelemahan dari metode ini adalah bukan hanya
mengukur glikasi valin pada N-terminalrantai β tetapi juha glikasi rantai β pada
bagian lain dan glikasi rantai α sehingga hasil pengukuran dengan metode ini
lebih tinggi daripada dengan metode HPLC (Harefa,2011). Keuntungan
metode ini adalah non-glycated hemoglobin serta bentuk labil dariHbA1c tidak
mengganggu penetuan hemoglobin glikasi, tidak dipengaruhi suhu, presisi
baik, HbF, HbS dan HbC hanya sedikit mempengaruhi metode ini (Widijanti
dan Ratulangi, 2011).
7. Metode Spektrofotometri
Prinsip dari metode ini adalah penghilangan fraksi labil dari hemoglobin
dengan cara haemolysate kemudian ditambahkan agen penukar ion kationik
kemudian dibaca dengan instrument spektrofotometer pada panjang gelombang
415 nm (Fortress, 2000). Metode ini memerlukan waktu inkubasi yang lama
yaitu sekitar 2 jam tetapikeuntungannya lebih spesifik karena tidak dipengaruhi
oleh - glycosylated ataupun glycosylated labil. Kerugiannya adalah waktu lama,
sampel besar dan satuan pengukuran yang kurang dikenal oleh klinisi yaitu
mmol/L (Widijanti dan Ratulangi, 2011).
Pemeriksaan kadar HbA1c memiliki banyak keunggulan dibandingkan pemeriksaan
glukosa darah yaitu antara lain:
a. Tidak perlu puasa dan dapat diperiksa kapan saja
b. Memperkirakan keadaan glukosa darah dalam jangka waktu lebih lama (2-3 bulan) atau
tidak dipengaruhi perubahan gaya hidup jangka pendek.
c. Metode telah terstandarisasi dengan baik dan keakuratannya dapat dipercaya
d. Variabilitas biologisnya dan instabilitas preanalitiknya lebih rendah dibanding glukosa
plasma puasa.

| Laporan Prak. Gangguan Metabolisme 2021 |

 LAPORAN PRAKTIKUM GANGGUAN METABOLISME

e. Kesalahan yang disebabkan oleh faktor nonglikemik yang dapat mempengaruhi

nilaiHbA1c sangat jarang ditemukan dan dapat diminimalisasi dengan melakukan
pemeriksaan konfirmasi diagnosis dengan glukosa plasma.
f. Pengambilan sampel lebih mudah dan pasien merasa lebih nyaman.
g. Lebih stabil dalam suhu kamar dibanding glukosa plasma puasa.
h. Memiliki keterulangan pemeriksaan yang jauh lebih baik dibanding glukosa puasa
i. Lebih direkomendasikan untuk pemantauan pengendalian glukosa
j. Level HbA1c berkorelasi dengan komplikasi diabetes sehingga lebih baik dalam
memprediksi komplikasi mikro dan makrokardiovaskular. (Harefa, 2011)
Selain keunggulan, pemeriksaan kadar HbA1c juga memiliki beberapa keterbatasan antara
lain :
a. Saat interpretasi HbA1c bermasalah, maka pemeriksaan glukosa puasa dan
postprandial dianjurkan untuk tetap digunakan.
b. Meningkat seiring bertambahnya usia, akan tetapi seberapa besar perubahan dan
pengaruh usia terhadap peningkatan HbA1c belum dapat dipastikan.
c. Harganya lebih mahal dibandingkan pemeriksaan glukosa
d. Etnis yang berbeda memiliki sensitivitas dan spesifisitas HbA1c yang berbeda, diduga
mungkin berkaitan dengan: perbedaan genetik dalam konsentrasi hemoglobin
(Hb),tingkat kecepatan glikasi (perbedaan tingkat kecepatan glukosa masuk dalam
eritrosit,kecepatan penambahan atau lepasnya glukosa dari hemoglobin) dan masa
hidup/dayatahan serta jumlah sel darah merah

DAFTAR PUSTAKA

Fortress, 2000. Fortress Diagnostic Haemoglobin A1C Micro Column. United Kingdom:
Fortress Diagnostic Limited.
Harefa, Emmy. 2011. HbA1c Standardization and Recent Updates. Makassar: Prodia
Laboratories.
Widijanti, Anik dan Ratulangi, B.T. 2011. Jenis pemeriksaan yang harus dilakukan
penderita diabetes. Malang: Laboratorium Patologi Klinik RSUD Dr. Saiful
Anwar/FK Unibraw.

| Laporan Prak. Gangguan Metabolisme 2021 |