METODE PERHITUNGAN BAKTERI

A. Tujuan

Untuk memperkirakan konsentrasi bakteri secara visual menggunakan standar

McFarland.

B. Dasar Teori

Jumlah mikroba pada suatu bahan dapat ditentikan dengan bermacam-macam cara,
tergantung pada bahan dan jenis mikrobanya. Ada 2 cara perhitungan jumlah mikroba yaitu
perhitungan secara langsung (direct method) dan secara tidak langsung (indirect method).
Perhitungan jumlah mikroba secara langsung digunakan untuk mrngitung jumlah
mikroba keseluruhan baik yang mati maupun yang hidup. Ada beberapa cara perhitungan
anyara lain : menggunakan counting chamber (Haemocytometer); menggunakan cara
pengecatan dan pengamatan; serta menggunakan filter membran. Sedangkan perhitungasn
mikroba secara tidak langsung digunakan untuk menghitung jumlah mikroba yang hidup atau
yang mati atau hanya untuk menghitung jumlah yang hidup saja tergantung cara yang
digunakan. Cara yang paling sering digunakan dalam perhitungan tidak langsung adalah
berdasarkan jumlah koloni (plate count). Pada perhitungan dengan cara ino diperlukan
beberapa syarat yang harus dipenuhi antara lain :
1. Jumlah koloni tiap petridisk antara 30-300 koloni, jika memang tidak ada yng memenuhi
syarat, dipilih yang jumlahnya mendekati 300.
2. Tidak ada koloni yang menutup lebih besar dari setengah luas petridisk, koloni tersebut
dikenal dengan spreader.
3. Perbandingan jumlah bakteri dan hasil pengenceran yang berturut-turut antara
pengenceran yang lebih besar dengan pengenceran sebelumnya.
4. Jika dengan ulangan setelah memenuhi syarat hasilnya dirata-rata.

Menghitung jumlah sel terdapat 3 macam yaitu :

 Hitungan mikroskopik  MPN (Most Probable Number)

 Hitungan cawan (TPC)  Hitungan McFarland
 Standar Turbiditas McFarland

Standar McFarland merupakan suatu bentuk skala yang memiliki ukuran dari nomor satu
hingga nomor sepuluh, skala ini menunjukkan konsentrasi bakteri per milliliter. Standar ini
dibuat untuk memperkirakan konsentrasi bakteri Gram negative (Whitman and MacNair,
2004). Menurut Haris dkk. (2013), standar McFarland adalah penyetaraan konsentrasi
mikroba dengan menggunakan larutan BaCl2 1% dan H2SO4 1%. Standar kekeruhan
McFarland ini dimasudkan untuk menggantikan perhitungan bakteri satu per satu dan untuk
memperkirakan kepadatan sel yang akan digunakan pada prosedur pengujian anti mikroba.

Standar McFarland dapat digunakan untuk menentukan perkiraan konsentrasi sel pada
suspensi atau lautan. Hasil perkiraan konsentrasinya dalam satuan CFU/mL, dan standar ini
digunakan untuk mengukur konsentrasi bakteri Gram negatif seperti E. Coli. Tetapi
penggunaanya menjadi kurang akurat bila digunakan pada jenis bakteri yang lain yang
berbeda ukuran dan berat, demikian juga bila digunakan pada jamur dan ragi. Perlu
dilakukan kalibrasi dan validasi lagi agar diperoleh hasil yang benar (Sutton, 2011).

Pada umumnya standar McFarland ditempatkan pada tabung dengan label nomor 1
hingga 10 yang diisi dengan larutan garam Barium. Setiap tabung diperkirakan kepadatan
bakteri dengan membandingkan nomor skala McFarland. Jadi, tabung nomor 7 menunjukkan
kepadatan bakteri pada konsentrasi 2,1 x 109/ml. Untuk menunjukkan perkiraan konsentrasi
bakteri, kepadatannya dapat dibandingkan secara visual menggunakan standar McFarland.
Jika kepadatannya antara nomor tujuh dan delapan, maka kepadatan bakteri per mililiter
antara 2,1 dan 2,4 milyar/ml (Withman and MacNair).

Keuntungan dari penggunaan standar McFarland adalah untuk dibutuhkannya waktu

inkubasi yang cukup untuk memperoleh jumlah kepadatan bakteri yang diinginkan.
Sedangkan kerugiannya, akan terjadi perbedaan pandangan untuk menilai tingkat kekeruhan
dari sel bakteri (Sutton, 2004).

Standar McFarland secara umum berlabel 0,5-10 dan berisi larutan garam Barium.
Standar McFarland dapat digunakan untuk mengetahui konsentrasi sel dalam suatu suspensi
secara visual. Skala McFarland di desain untuk memperkirakan konsentrasi bakteri Gram
 nefatif seperti E. coli. Kekurangan dari standar McFarland yaitu hasil perkiraan yang tidak
akurat dengan adanya organisme lain seperti khamir dan kapang.

Tabel 1. Jumlah Bakteri dalam Skala McFarland

Skala McFarland Bakteri (x 106 /ml)

0,5 <300
1 300
2 600
3 900
4 1.200
5 1.500
6 1.800
7 2.100
8 2.400
9 2.700
10 3000

Berikut ini cara membuat larutan standar Mac Farland dengan menggunakan standar
Barium Sulfat :

1. Buat larutan 1,175% (b/v) Barium klorida (BaCl2)

2. Buat larutan 1% Asam sulfat (H2SO4)
3. Campurkan kedua larutan ini berdasarkan rasio, dengan pemberian H 2SO4 terlebih
dahulu.
4. Tutup tabung dengan rapat dan simpan pada suhu ruang di tempat gelap.

Larutan ini akan stabil paling tidak untuk 6 bulan. Penggunaannya yaitu kocok tabung
beberapa kali atau menggunakan cortex untuk mensupensi ulang endapan barium sulfat.
Perbandingan terbaik antara bakteri dan standar Mac Farland dilakukan dengan menggunakan
kertas dengan latar belakang garis horizontal hitam putih.

Tabel 2. Standar McFarland

 Standar McFarland
No. Komposisi Bahan
0,5 0,05 ml BaCl2 dalam 9,95 ml H2SO4
1 0,1 ml BaCl2 dalam 9,9 ml H2SO4
2 0,2 ml BaCl2 dalam 9,8 ml H2SO4
3 0,3 ml BaCl2 dalam 9,7 ml H2SO4
4 0,4 ml BaCl2 dalam 9,6 ml H2SO4
5 0,5 ml BaCl2 dalam 9,5 ml H2SO4
6 0,6m l BaCl2 dalam 9,4 ml H2SO4
7 0,7 ml BaCl2 dalam 9,3 ml H2SO4
8 0,8 ml BaCl2 dalam 9,2 ml H2SO4
9 0,9 ml BaCl2 dalam 9,1 ml H2SO4
10 1,0 ml BaCl2 dalam 9,0 ml H2SO4

a. Alat dan bahan

- 1% BaCl2 - Aquades
- 1% H2SO4 - Rak tabung
- Bunsen - Jarum ose
- 12 Tabung reaksi - Pipet ukur
- Larutan PBS - Sentrifuge
- Media kultur cair - Isolat

C. Prosedur Kerja
a. Pembuatan Standar McFarland
1. Disiapkan 11 tabung reaksi pad arak tabung dan dilebeli sesuai dengan skala
McFarland (lihat pada Tabel 11.)
2. Setiap tabung diisi dengan menggunakan larutan 1% BaCl2 dan H2SO4 sesuai standar
McFarland (lihat pada Tabel 2.)
b. Pembuatan Kultur Bakteri
1. Disiapkan 1 tabung yang berisi 10 ml media kultur cair.
2. Bahan isolat diambil menggunakan jarum ose, kemudian ditanam pada media dan
diinkubasi selama 24 jam.
3. Disentrifuge pada kecepatan 1500 rpm selama 3 menit. Super natan dibuang.
4. Endapan ditambah dengan lerutan PBS sampai volumenya sama dengan volume awal
sebelum supernatant dibuang.
 c. Pengamatan
Pengamatan dilakukan dengan memnandingkan antara turbuditas kultur bakteri dengan
standar McFarland 0,5-10. Pilihlah standar McFarland mana yang memiliki tubiditas
sama dengan turbiditas bakteri dan hihat hasilnya pada tabel skala McFarland. Misalnya,
apabila turbiditas bakteri sama dengan standar McFarland no. 2, artinya kepadatan
bakteri tersebut 600 x 106/ml.

Tugas Laporan Praktikum

Silahkan dikerjakan tugasnya sebagai laporan praktikum dengan data hasil pengamatan bakteri
menunjukkan bahwa kepadatan bakteri masing2 kelompok (Sesuai dengan bakteri hasil
identifikasi) serupa dengan standar Mc farland no:

1. kel 1 :  no 2

2. Kel 2 :  no 3

3. Kel 3 : no 3

4. Kel 4 : no 4

5. Kel 5 : no 2

6. Kel 6 : no 4

7. Kel 7 : no 3

8. kel 8 : no 2

Silahkan dibahas hasilnya.