1.

Pewarnaan Struktural
Pewarnaan struktural ditujukan untuk melihat bagian tertentu bakteri. Yang termasuk dalam pewarnaan
struktural ialah :
a. Pewarnaan Spora
Ada dua genus bakteri yang dapat membentuk endospora, yaitu genus Bacillus dan genus Clostridium.
Strukturspora yang terbentuk di dalam tubuh vegetatif bakteri disebut sebagai ‘endospora’ (endo=dalam,
spora=spora) yaitu spora yang terbentuk di dalam tubuh. Secara sederhana, dapat dikatakan bahwa endospora
merupakan sel yang mengalami dehidrasi dengan dinding yang mengalami penebalan serta memiliki beberapa
lapisan tambahan.
Dengan adanya kemampuan untuk membentuk spora ini, bakteri tersebut dapat bertahan pada
kondisi yang ekstrim.Menurut Pelczar (1986) bakteri yang dapat membentuk endospore ini dapat hidup dan
mengalami tahapan-tahapan pertumbuhan sampai beberapa generasi, dan spora terbentuk melalui sintesis
protoplasma baru di dalam sitoplasma sel vegetatifnya.
Menurut Volk & Wheeler (1988), dalam pengamatan spora bakteri diperlukan pewarnaan tertentu
yang dapat menembus dinding tebal spora. Contoh dari pewarnaan yang dimaksudkan tersebut adalah dengan
penggunaan larutan Hijau Malakit 5%, dan untuk memperjelas pengamatan, sel vegetatif juga diwarnai dengan
larutan Safranin 0,5% sehingga sel vegetatif ini berwarna merah, sedangkan spora berwarna hijau. Dengan
demikian ada atau tidaknya spora dapat teramati, bahkan posisi spora di dalam tubuh sel vegetatif juga dapat
diidentifikasi. Namun ada juga zat warna khusus untuk mewarnai spora dan di dalam proses pewarnaannya
melibatkan proses pemanasan, yaitu; spora dipanaskan bersamaan dengan zat warna tersebut sehingga
memudahkan zat warna tersebut untuk meresap ke dalam dinding pelindung spora bakteri.
Beberapa zat warna yang telah disebutkan di atas, dapat mewarnai spora bakteri, tidak lepas dari sifat
kimiawi dinding spora itu sendiri. Semua spora bakteri mengandung asam dupikolinat, yang mana subtansi ini
tidak dapat ditemui pada sel vegetatif bakteri, atau dapat dikatakan, senyawa ini khas dimiliki oleh spora.
Dalam proses pewarnaan, sifat senyawa inilah (asam dupikolinat) yang kemudian dimanfaatkan untuk diwarnai
menggunakan pewarna tertentu, dalam hal ini larutan hijau malakit. Sedangkan menurut Pelczar (1986), selain
subtansi di atas, dalam spora bakteri juga terdapat kompleks Ca dan asam dipikolinan peptidoglikan.
Terdapat beberapa metode pewarnaan spora bakteri, diantaranya yaitu metode Schaeffer-Fulton dan
metode Dorner. Pada metode Schaeffer-fulton, pewarna yang digunakan adalah hijau malaksit dan safranin,
sedangkan pada metode Dorner, pewarna yang digunakan adalah carbol fuchsin yang dipanaskan dan negrosin.
Berikut adalah prosedur pewarnaan spora menggunakan kedua metode tersebut :

Hasil pengamatan preparat pewarnaan spora bakteri :

Keterangan :
a) Pewarnaan Spora menggunakan metode Schaeffer-Fulton. Pada pewarnaan ini, spora berwarna hijau dan
vegetatif berwarna merah
b) Pewarnaan spora menggunakan metode Dornen. Pada pewarnaan ini, spora berwarna merah sedangkan
vegetatif tidak berwarna (transparan)
b. Pewarnaan Kapsul
Beberapa jenis bakteri mengeluarkan bahan-bahan yang amat berlendir dan lengket pada permukaan
selnya, dan melengkungi dinding sel. Bila bahan berlendir tersebut kompak dan tampak sebagai suatu bentuk
yang pasti ( bundar/lonjong) maka disebut kapsul, tetapi bila bentuknya tidak teratur dan kurang menempel
dengan erat pada sel bakteri disebut selaput lendir.
Kapsul dan lendir tidaklah esensial bagi kehidupan sel, tapi dapat berfungsi sebagai makanan cadangan,
perlindungan terhadap fagositosis (baik dalam tubuh inang maupun dialam bebas) atau perlindungan terhadap
dehidrasi. Kemampuan menghasilkan kapsul merupakan sifat genetis, tetapi produksinya sangat dipengaruhi
oleh komposisi medium tempat ditumbuhkannya sel-sel yang bersangkutan. Komposisi medium juga dapat
mempengaruhi ukuran kapsul. Ukuran kapsul berbeda-beda menurut jenis bakterinya dan juga dapat berbeda
diantara jalur-jalur yang berlainan dalam satu spesies.
Pada beberapa jenis bakteri adanya kapsul sebagai petunjuk virulensi. Semua kapsul bakteri tampaknya
dapat larut dalam air. Komposisi kimiawi kapsul ada yangberupa glukosa ( misalnya dektrosa pada leokonostok
mesendteroides), polimer gula amino (misalnya asam hialuronat pada Staphylococcus piogenik), polipeptida
(misalnya polimer asam D-glutamat pada Bacillus antraksis) atau kompleks polisakarida, dan glikoprotein
( misalnya B disentri).
Pewarnaan kapsul tidak dapat dilakukan sebagaimana melakukan pewarnaan sederhana, pewarnaan
kapsul dilakukan dengan menggabungkan prosedur dari pewarnaan sederhana dan pewarnaan negatif.
Masalahnya adalah ketika kita memanaskan prepat dengan suhu yang sangat tinggi kapsul akan hancur,
sedangakan apabila kita tidak melakukan pemanasan pada preparat, bakteri akan tidak dapat menempel dengan
erat dan dapat hilang ketika kita mencuci preparat.
Pewarnaan kapsul menggunakan pewarna Kristal Violet dan sebagai pelunturnya adalah Copper Sulfate.
Kristal violet memberikan warna ungu gelap terhadap sel bakteri dan kapsul. Namun kapsul bersifat nonionic,
sehingga pewarna utama tidak dapat meresap dengan kuat pada kapsul bakteri. Copper sulfate bertindak sebagai
peluntur sekaligus counterstain, sehingga mengubah warna yang sebelumnya ungu gelap menjadi biru muda
atau pink. Maka dari itu pada pewarnaan kapsul, kapsul akan transparan sedangakan sel bakteri dan latar
belakangnya akan berwarna biru muda atau pink. Berikut ini adalah prosedur pewarnaan kapsul bakteri:

Hasil pengamatan preparat pada pewarnaan bakteri berkapsul :

c. Pewarnaan Granulla

Ada beberapa metode pewarnaan granula, diantaranya adalah Loeffler, Albert dan Neisser. Dari ketiga
metode tersebut, metode yang sering digunakan adalah metode Neisser, sedangkan metode Albert dan Loeffler
kurang popular karena tidak diajarkan pada praktikum mikrobiologi. Tetapi, pewarnaan metode Albert sering
dibahas pada buku-buku terbitan WHO.
Granula metakromatik disebut jga granula volutin. Granula metakromatik tidak hanya ditemukan pada
Corynebacterium diphteriae tetapi juga di beberapa bakteri selain bakteri tersebut, fungi, algae, dan protozoa.
Granula metakromatik mengandung polifosfat, asam ribonukleat, dan protein. Granula metakromatik sangat
mungkin mempunyai fungsi sebagai sumber cadangan energi.
Metode Neisser menggunakan pewarna neisser A, neisser B, dan neisser C. Neisser A mengandung biru
metilen, alkohol 96%, asam pekat dan aquades. Neisser B mengandung kristal violet, alkohol 96%, dan aquades.
Sedangkan neisser C mengandung crysoidine dan aquades. Pada metode neisser, granula bakteri berwarna biru
gelap atau biru hitam (warna dari neisser A ditambah neisser B), sedangkan sitoplasma bakteri berwarna kuning
kecoklatan (warna dari neisser C). berikut adalah hasil pengamatan preparat pewarnaan bakteri bergranula:

d. Pewarnaan Flagella
Flagel merupakan salah satu alat gerak bakteri. Flagel mengakibatkan bakteri dapat bergerak berputar.
Penyusun flagel adalah sub unit protein yang disebut flagelin, yang mempunyai berat molekul rendah.
Berdasarkan jumlah dan letak flagelnya, bakteri dibedakan menjadi monotrik, lopotrik, amfitrik, peritrik dan
atrik.
Prinsip pewarnaan flagella adalah membuat organel tersebut dapat dilihat dengan cara melapisinya
dengan mordant dalam jumlah yang cukup. Dua metode pewarnaan flagella, yaitu metode Gray dan metode
Leifson. Metode Gray digunakan untuk mendapat hasil yang lebih baik dan mengena walaupun dalam metode ini
tidak dilakukan pencelupan yang khusus. Pada pewarnaan flagella larutan kristal violet bertindak sebagai
pewarna utama, sedangkan asam tannic dan alumunium kalium sulfat bertindak sebagai mordant. Kristal violet
akan membentuk endapan disekitar flagel, sehingga meningkatkan ukuran nyata flagel.
Berikut ini adalah prosedur dan hasil pengamatan preparat pewarnaan bakteri berflagel:
A. PEWARNAAN STRUKTURAL
Pewarnaan Flagella
Pewarnaan flagel dengan memberi suspense koloid garam asam tanat yang tidak stabil, sehingga
terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel.
Metode :
1) Gray
Larutan-larutan yang diperlukan :
 Kalium aluin 10% dalam air : 5 ml.
 Sublimat 20% dalam air : 2 ml.
 Asam tanine 20% dalam air : 2 ml.
 Basic-fuchsin 3½% dalam : 0,1 ml.
Prosedur Kerja :
1. Di dalam sebuah tabung reaksi dibuatlah suspensi kuman dari tanaman (lebih baik diambil dari
media ”zwerm agar” yaitu media untuk bulu cambuk), 1 ose penuh disuspensikan dengan 1 ml air
garam faal steril.
2. Simpan dalam inkubator 37°C selama 2 jam (lebih).
3. Satu ose dari suspensi ini diapuskan di atas objek gelas yang bersih, keringkan dan fiksasi di atas
api 3x.
4. Pulas dengan larutan pewarnaan Gray : 10 detik.
5. Cuci bersih dengan aquadest, kemudian dipulas dengan larutan carbolfuchsin selama 10 detik.
6. Cuci dengan aquadest, keringkan dengan kertas saring atau pada suhu kamar.
7. Lihat dengan mikroskop
Interpretasi Hasil :
Flagella (bulu cambuk) berwarna : merah jambu.
2) Leifson (Leifson : J. Bact, 20: 203, 1930)
Larutan pulas Leifson, terdiri dari
 Basic fuchsin : 1 gram.
 NaCl : 1½ gram.
 Asam tanine : 2½ gram.
Ketiga zat ini dicampur baik-baik, kemudian 1,7 gram campuran dilarutkan dalam 35 ml alkohol
95% + 65 ml aquadest. Larutan pulas ini disimpan beberapa minggu dalam botol bertutup rapat, baru
dipakai.
Prosedur Kerja :
 1. Sediakan suspensi bakteri dalam air sampai sedikit keruh, yang diambil dari tanaman agar atau
sediment dari bouillon.
2. Satu tetes dari suspensi diteteskan pada objek gelas sedemikian rupa sehinggga tetesan mengalir
pada objek.
3. Keringkan (biarkan) kering pada suhu kamar, kemudian bubuhi larutan pulas, biarkan 10 menit.
4. Cuci dengan air, bubuhi dengan borax-methylen biru yang encer (1,0 g borax + 0,1 g methylen biru
dalam 100 ml aquadest), biarkan 5-10 menit.
5. Cuci dengan air dan keringkan dengan kertas saring, lihat dengan mikroskop.

Interpretasi Hasil :
Flagella : merah jambu
Badan bakteri : agak kebiru-biruan

Pewarnaan Kapsul
Pewarnaan ini menggunakan larutan Kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat sebagai
pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan dengan air dapat
melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakang. Yang berwana biru gelap.

Metode :
1) Hiss
Prosedur Kerja :
1. Bersihkan gelas benda dengan alkohol agar bebas dari lemak.
2. Buat sediaan dari biakan yang ada secara aseptik.
3. Preparat tersebut dikering uadarakan.
4. Lakukan fiksasi di atas lampu spirtus.
5. Letakkan preparat smear pada rak pengecatan lalu tetesi dengan 2-3 tets basic fuchin dan lalu
dipanaskan di atas nyala lampu spirtus sampai timbul uap, jaga jangan sampai mendidih atau
menjadi kering, lalu dinginkan.
6. Cuci dengan larutan CuSO4 .5H2O 20%.
7. Preparat dikering udarakan dan tiriskan atau serap air yang tersisa pada permukaan preparat
dengan kertas serap.
8. Amati preparat dengan perbesaran kuat (pakai minyak imersi)menggunakan mikroskop.
Interpretasi Hasil :
Sel vegetative : ungu – merah tua
Kapsul : biru pucat.
2) Buri
Prosedur Kerja :
1. Bersihkan gelas benda dengan alkohol agar bebas dari lemak.
2. Buat pengecatan negatif dari bikan yang tersedia.
3. Tetesi dengan cat blue metilen atau kristal violet selama 2 menit.
4. Cuci dengan air mengalir dan tiriskan.
5. Preparat dikering udarakan dan tiriskan atau serap dengan kertas serap.
6. Amatai preparat dengan perbesaran kuat (memakai minyak imersi).
Interpretasi Hasil :
Sel : biru/ungu
Kapsul : transparan
Background : hitam

Pewarnaan Spora
Spora bakteri (endospora) tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan biasa, diperlukan teknik pewarnaan
khusus. Pewarnaan Klein adalah pewarnaan spora yang paling banyak digunakan.
Endospora sulit diwarnai dengan metode Gram. Untuk pewarnaan endspores, perlu dilakukan
pemanasan supaya cat malachite hijau  bisa masuk ke dalam spora , seperti halnya pada pewarnaan  Basil
Tahan Asam dimana cat  carbol   fuschsin  harus dipanaskan untuk bisa menembus  lapisan lilin asam
mycolic  dari Mycobacterium .

Prinsip :
Pemanasan akan mengembangkan lapisan luar spora sehingga zat warna utama dapat masuk masuk ke
dalam spora sehingga berwarna hijau.melalui pendinginan warna utama akan terperangkap di dalam
spora,dengan pencucian zat warna utama yang ada pada sel vegetatif akan terlepas sehingga pada saat
pewarnaan kedua (safranin), sel vegetatif akan berwarna merah.

Metode :
1) KLEIN
Prosedur kerja :
1. 1 ml suspensi bakteri yang umurnya 24 jam dalam bouillon atau suspensi kuman yang dibUAT dari
tanaman pada agar-miring yang telah berumur 48 jam, dicampur dengan Carbolfuchsin Ziehl
Neelsen yang sama banyaknya di dalam tabung reaksi.
2. Campuran ini dimasak (direndam) pada penangas air 80°C kira-kira 10 menit, gunanya untuk
membunuh bakteri-bakteri yang tidak membentuk spora.
3. Satu ose dari campuran dibuat sediaan pada satu objek gelas yang bersih dan bebas dari lemak,
keringkan dan fiksasi 3x di atas api Bunsen.
4. Celupkan dalam Asam Sulfat 1% selama 1-2 detik.
5. Cuci dengan air kran dan diwarnai dengan Methylen Blue 1%, kira-kira selama 2-3 menit.
6. Cuci dengan air kran, keringkan dan lihat dengan mikroskop.
Intarpretasi Hasil :
Spora : berwarna merah
Bakteri : berwarna biru

2) MULLER
Prosedur Kerja :
1. Buat sediaan dari biakan kuman yang umurnya 2 hari dalam bouillon (dari agar miring), sesudah
dilidah apikan (rekatkan) 3x, tetesi dengan Chloroform selama 2 detik.
2. Cuci dengan air, tetesi dengan Asam Chromat 5% selama 2 detik.
3. Cuci dengan air kran, bubuhi dengan Carbol fuchsin Z. Neelsen, uapkan (jangan mendidih) biarkan
menguap selama 5 menit.
4. Cuci dengan Asam Asetat 5%, kemudian dengan air.
5. Bubuhi dengan Methylen Blue 1% kira-kira 2 detik.
6. Methylen Blue dibuang dan keringkan dengan kertas saring, periksa dengan mikroskop.

Interpretasi Hasil :
Spora : berwarna merah.
Bakteri : berwarna biru.

3) FLEMING
Prosedur kerja :
1. Buat sediaan, keringkan, kemudian fiksasi 3x di atas api Bunsen.
2. Warnai dengan Carbol-Fuchsin Z. Neelsen, panaskan sampai menguap dan biarkan menguap
selama 5 menit.
3. Cuci dengan air kran sampai warna Fuchsin tidak luntur lagi, bubuhi Natrium-sulfit 5% selama 20-
30 detik.
4. Cuci dengan air, tetesi dengan larutan Methylen Blue 1% (dengan larutan Nigrosin 10%), kemudian
apuskan di atas objek gelas.
5. Keringkan pada temperatur kamar dan lihat dengan mikroskop.
Interpretasi Hasil :
Spora : berwarna merah
Bakteri : berwarna biru

4) SCHAEFFER DAN FULTON

Prosedur Kerja :
1. Buat sediaan dari suspensi kuman yang akan diperiksa, keringkan, kemudian fiksasi di atas api 3x.
2. Tetesi dengan larutan Malachiet hijau 5%, uapkan perlahan-lahan, biarkan menguap 1½ menit.
3. Cuci dengan air kran, kemudian bubuhi dengan larutan Safranin 0,5% selama 1½ menit.
4. Cuci lagi dengan air, kemudian keringkan dengan kertas saring, periksa dengan mikroskop.

Interpretasi Hasil :
Spora : berwarna hijau
Bakteri : berwarna merah