Laporan Hari, Tanggal : Selasa, 03 Mei 2016

Mikrobiologi Pangan PJ Praktikum : Neny Mariyani, STP, Msi

Asisten : Revita Permata Hati,Amd
Dina Crownia,Amd

PEWARNAAN MIKROBA

SJMP BP1/Kelompok 4:

Elsa Agustiningsih (J3E115004)

Elvira Nurmalasari (J3E115056)
Esli Sihol Maribot (J3E115107)
Aryandika Agung P (J3E115024)
 SUPERVISOR JAMINAN MUTU PANGAN

PROGRAM DIPLOMA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

2016

TUJUAN
Pratikum ini dilakukan untuk melatih mahasiswa melakukan pewarnaan gram,
sederhana,spora,dan kapsul serta mampu mengidentifikasi bakteri gram positif, gram
negative, dan baketri berspora.

HASIL
Tabel 1 Rincian Bahan Yang Digunakan

Pewarnaan Pewarnaan Pewarnaan Pewarnaan Slide Cultur

Kapsul Sederhana Spora Gram (Kering/Basah)
Xylinum Khamir Bacillus tua Bacillus Agar PDA cair
muda
Kristal Stapilococu Malachyte Staphylococ Spora kapang
Violet s aureus Green cus aureus paprika
Larutan Methylene Safranin Kristal Gliserol 10%
CuSO45H2 Blue violet
O 20%
Aquades Aquades Iodium
Etanol 95%

Safranin
Aquades

Tabel 2 Hasil Pengamatan Dengan Mikroskop

No Metode Jenis Perbesaran Hasil Keterangan
Bakteri Pengamatan
1. Pewarnaan Khamir
Sederhana

2. Pewarnaan Staphylo
Sederhana coccus
aureus

3. Pewarnaan Bacillus.
Spora sp tua

4. Pewarnaan Bacillus.
Gram sp muda

5. Pewarnaan Staphylo
Gram coccus
aureus

6. Pewarnaa Acetobac
Kapsul ter
xyllinum

7. Pengamatan Kapang
Slide paprika
Culture
 8. Pengamatan Kapang
Slide Tempe
Culture

PEMBAHASAN

Pada praktikum kali ini dilakukan dua jenis pewarnaan yaitu pewarnaan sederhana
dan pewarnaan differensial. Pewarnaan sederhana adalah Pewarnaan sederhana
merupakan pewarnaan yang paling umum digunakan. Berbagai macan tipe morfologi
bakteri (coccus, bacillus, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan
menggunakan pewarna sederhana, yaitu mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan
satu macam zat warna saja. (Supriadi, 2013).
Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat
alkalin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel
bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah metilen
biru, kristal violet, dan karbol fuchsin yang mana pewarnaan sederhana ini dibagi lagi
menjadi dua jenis pewarnaan.
a. Pewarnaan Asam merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat
warna dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel. Adapun zat warna yang
dipakai dalam pewarnaan positif adalah metilen biru.
b. Pewarnaan Basa merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai bakteri tetapi
mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini
mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna
untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Metode ini menggunakan cat
nigrosin atau tinta cina. (Anonim, 2011)

Pada praktikum ini dilakukan pewarnaan sederhana Pengamatan yang pertama

adalah pewarnaan sederhana untuk mengamati sel khamir.Dalam praktikum
pewarnaan sederhana ini pewarna yang digunakan adalah methylen
blue/safranin/kristal violet,akan tetapi kelompok kami menggunakan Kristal
violet,dengan pewarnaan tersebut dapat dibedakan sel mati dan sel hidup. Sel mati
akan ungu, sedangkan yang hidup akan berwarna transparan. Hal ini disebabkan
karena sifat membran sel yang selektif semipermeabel sehingga warna ungu tersebut
dapat diserap sel hidup. Dan juga karena penyerapan zat warna krsital violet yang
bersifat basa oleh sel bakteri yang bersifat asam,dan berdasarkan hasil yang
didapatkan terlihat sel khamir berbentuk bulat dan berwarna ungu. Hasil tersebut
sesuai dengan literatur bahwa sel yang mati berwarna ungu dan sel hidup berwarna
transparan. Sel khamir mati akibat dari perlakuan fiksasi pada prosedur. Khamir
sering kali hampir tidak kelihatan karena tidak kontras dengan medium dimana
mereka hidup. Oleh karena itu, perlu dilakukan pewarnaan agar khamir tampak jelas
bila diamati dengan mikroskop.

Pengamatan kedua adalah pewarnaan sederhana untuk mengamati sel bakteri

Staphylococcus aureus. Berdasarkan hasil pengamatan sel bakteri tersebut berbentuk
bulat (coccus) dan bentuknya menyerupai anggur. Sama seperti yang ada pada
litelatur bahwa struktur bakteri Staphylococcus aereus yaitu berbentuk bulat (coccus)
dan bentuknya menyerupai anggur. Hal tersebut menyatakan hasil pengamatan telah
menunjukan kesesuaian dengan literatur.
Selanjutnya pewarnaan yang dilakukan adalah Pewarnaan diferensial
merupakan teknik pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba
atau bagian-bagian sel mikroba. Teknik pewarnaan ini menggunakan tidak hanya satu
jenis larutan zat warna, berbeda dengan teknik pewarnaan sederhana (pewarnaan
tunggal) yang hanya menggunakan satu jenis zat warna saja. Pewarnaan diferensial
banyak jenisnya, antara lain ialah pewarnaan gram, pewarnaan spora, pewarnaan
tahan asam, pewarnaan kapsul, dan pewarnaan flagel.
1. Pewarnaan Kapsul
Praktikum perwarnaan differensial yang pertama adalah pewarnaan kapsul.
Pewarnaan ini menggunakan larutan kristal violet panas selama, lalu larutan tembaga
sulfat digunakan sebagai pembilasan yang menghilangkan zat warna berlebihan,
karena jika pembilasan yang digunakan pembilasan dengan air maka dapat
melarutkan kapsul. Dan juga tembaga sulfat tersebut dapat menghasilkan warna biru
pucat pada kapsul Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakang yang
berwana biru gelap. Kapsul itu sendiri merupakan bahan-bahan yang amat berlendir
dan lengket pada permukaan sel bakteri yang melengkungi dinding sel yang memberi
bentuk pasti dan menempel dengan erat. Kapsul dan lendir tidaklah esensial bagi
kehidupan sel, tapi dapat berfungsi sebagai makanan cadangan, perlindungan
terhadap fagositosis ( baik dalam tubuh inang maupun dialam bebas ) atau
perlindungan terhadap dehidrasi. (Asriyah, 2014)
Tanpa pewarnaan, kapsul bakteri sangat sukar diamati dengan mikroskop
cahaya biasa karena tidak berwarna dan mempunyai indeks bias yang rendah. Kapsul
dari berbagai spesies tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan sederhana atau
pewarnaan Gram. Karena, kapsul dari berbagi spesies memiliki susunan zat-zat yang
berberda, seperti omposisi kimiawi kapsul yang berupa glukosa (misalnya dektrosa
pada leokonostok mesendteroides), polimer gula amino (misalnya asam hialuronat
pada Staphylococcus piogenik), polipeptida (misalnya polimer asam D-glutamat pada
Bacillus antraksis), kompleks polisakarida protein (misalnya B disentri) atau bahkan
kapsul yang tidak memiliki afinitas yang besar terhadap bahan-bahan zat warna yang
bersifat basa maka tidak semua kapsul dapat diperlihatkan dalam pewarnaan yang
sama.
Selain itu juga kapsul bersifat non-ionik, maka pewarnaanya tidak dapat
dilakukan menggunakan prosedur yang sederhana dan biasa. Masalah utama dalam
pewarnaan kapsul ialah bila olesan bakteri yang telah disiapkan itu difiksasi dengan
panas menurut metode yang biasa, maka kapsul tersebut akan rusak, namun apabila
tidak difiksasi dengan panas, maka organisme tersebut akan meluncur pada waktu
pencucian. Sehingga dalam pewarnaannya dilakukan penggabungan proses
pewarnaan negatif dengan pewarnaan sederhana.Keuntungan dari bakteri berlendir
yaitu, dalam dunia kedokteran kapsul dapat dipakai sebagai indikasi untuk
menentukan patogenitas bakteri. Contoh bakteri berkapsul antara lain: Bacillus
anthracis, Diplooccus pneumoniae, Klebsiella, Acetobacter xylinium, Bacillus
subtilis, Betacrocus dextranicus.

2. Pewarnaan Spora
Beberapa spesies bakteri tertentu dapat membentuk spora. Spora dihasilkan di
dalam tubuh vegetative bakteri tersebut, dapat berada ditengah(sentral), ujung
(terminal), ataupun tepian sel (sub terminal). Spora bersifat tahan terhadap tekanan
fisik maupun kimiawi.
Ada dua genus mikroba yang menghasilkan endospora yaitu genus bacillus
dan genus clostridium. Dengan adanya kemampuan untuk membentuk spora ini,
bakteri tersebut dapat bertahan pada kondisi ekstrim. Dalam pengamatan spora
bakteri diperlukan pewarnaan tertentu yang dapat menembus dinding tebal spora.
Pewarnaan yang dimaksud adalah dengan penggunaan larutan hijau malakit 5%, dan
juga larutan safranin 0,5% yang berfungsi untuk memperjelas pengamatan sehingga
sel vegetatifnya akan berwarna merah. Dalam proses pewarnaannya melibatkan
proses pemanasan yang berfungsi agar zat warna tersebut mudah meresap ke dinding
pelindung spora bakteri.
Pada prinsipnya pemanasan akan mengembangkan lapisan luar spora sehingga
zat warna utama dapat masuk ke dalam spora sehingga berwarna hijau. Melalui
pendinginan warna utama akan terperangkap di dalam spora, dengan pencucian zat
warna utama yang ada pada sel vegetative akan terlepas, sehingga pada pewarnaan
kedua dengan menggunakan safranin, safranin akan menempel pada sel vegetative.
Pada pengamatan di mikroskop ditemukan sampel bewarna merah dan hijau sehingga
pengamatan menjadi mudah karena dapat dibedakan antara warna sel vegetative dan
sporanya.Warna spora berwarna hijau karena pewarna malacite green yang dengan
proses pemanasan meresap dan saat pencucian menjadi sangat sukar untuk
dilepaskan. Sedangkan pada sel vegetatif berwarna merah karena malacite green
terlarut saat pencucian, sehingga saat diberi warna dari safranin akan berwarna
merah. Sehingga dapatlah dibedakan antara sel vegetatif dengan spora, juga
bagaimana letak spora pada sel vegetatif tersebut.

3.Pewarnaan Gram
Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode untuk membedakan
spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-
negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka dan untuk
identifikasi morfolgi dan tatanannya. Oleh karena itu, pewarnaan gram tidak
bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel
(Dwidjoseputro, 1989).

Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna kristal violet dan akan
tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Sedangkan bakteri gram negatif
mempuyai daya mengikat zat warna utama tidak kuat sehingga tidak dapat
mempertahankan zat warna kristal violet dan dilunturkan oleh peluntur kemudian
diwarnai oleh zat warna lawan (safranin) pada pengamatan mikroskop sel-sel bakteri
tampak berwarna merah.

Perbedaan warna antara bakteri gram positif dan bakteri gram negatif
disebabkan oleh adanya perbedaan struktur dan dinding selnya. Dinding bakteri gran
positif banyak mengandung peptidoglikan, sedangkan dinding bakteri gram negatif
banyak mengandung lipopolisakarida (Pratiwi, 2008).

Pada praktikum pewarnaan gram ini menggunakan suspense bakteri

Staphylococcus aureus dan bacillus muda. Staphylococcus aureus pada pewarnaan
gram menghasilkan warna ungu sehingga termasuk bakteri Gram positif.
Staphylococcus aureus dapat tumbuh pada suhu berkisar 15 sampai 45 derajat dan
lingkungan NaCl pada konsentrasi tinggi hingga 15 persen dan menghasilkan enzim
coagulase. Bakteri ini berbentuk coccus. Koloninya tersusun berkelompok dan
menggunung seperti buah anggur. Peranannya adalah dapat menghasilkan racun
sebagai penyebab sindrom trauma yang diderita oleh pria, wanita dan anak-anak.
Sindrom racun trauma tersebut berupa kejang, pingsan, turunnnya tekanan darah.
Dinding sel bakteri Gram positif terdiri dari lapisan peptidoglikan yang tebal dan
ketika ditambahkan pewarnaan kristal violet maka dinding sel bakteri gram positif
akan menyerap apabila diberi alkohol dan pada Gram positif akan tetap berwarna
ungu walaupun diberi zat warna kedua, karena dinding selnya tersusun oleh lapisan
peptidoglikan yang tebal sehingga tidak dapat dicuci oleh alkohol.
Sedangkan pada pewarnaan suspensi bacillus muda atau Bacillus sp yang
merupakan bakteri berbentuk batang (basil), dan tergolong dalam bakteri gram positif
(sehingga dihasilkan bewarna ungu) yang umumnya tumbuh pada medium yang
mengandung oksigen (bersifat aerobik) sehingga dikenal pula dengan istilah aerobic
sporefomers. Kebanyakan anggota genus Bacillus sp. dapat membentuk endospora
yang dibentuk secara intraseluler sebagai respon terhadap kondisi lingkungan yang
kurangmenguntungkan, oleh karena itu anggota genus Bacillus sp. memiliki toleransi
yang tinggi terhadap kondisi lingkungan yang berubah-ubah. Beberapa
anggota Bacillus sp. memiliki S-layer yang merupakan lapisan crystalline
dipermukaan subunit protein atau glikoprotein. Bagian kapsul kebanyakan
anggota Bacillus sp. mengandung D atau L- glutamic acid, sedangkan beberapa
lainnya memiliki kapsul yang mengandung karbohidrat. Variasi struktur dinding sel
seperti pada kebanyakan bakteri gram negatif tidak ditemukan pada
genus Bacillus sp. Dinding sel vegetatif kebanyakan anggota Bacillus sp terbuat dari
peptidoglikan yang mengandung Meso-Diaminopimelic Acid (DAP) dengan tipe
Glyserol Teichoic Acid sangat bervariasi diantara spesies. Kebanyakan anggota
genus Bacillus sp. merupakan bakteri yang bersifat motil dan memiliki flagela tipe
peritrik. Bacillus sp digolongkan ke dalam kelas bakteri heterotrofik, yaitu protista
bersifat uniseluler, termasuk dalam golongan mikroorganisme redusen atau yang
lazim disebut sebagai dekomposer.

Pada praktikum ini juga dilakukan pengamatan slide kultur, hal yang pertama
harus dilakukan adalah pembuatan slide culture menggunakan cawan petri yang
didalamnya dimasukkan kertas saring selanjutnya di atas kertas saring diletakkan
batang berbentuk V , batang bentuk V berfungsi agar gelas objek tidak berhubungan
langsung dengan kertas saring pada saat kertas saring telah ditetesi gliserol ditetesi
gliserol. Setelah itu di atasnya diletakkan gelas objek. Cawan petri yang telah disusun
sedemikian rupa tersebut lalu disterilisasi terlebih dahulu. Setelah cawan petri steril
agar PDA cair steril diratakan dengan ose dan dibiarkan membeku di atas gelas objek
yang ada didalamnya. Kemudian ditambahkan spora kapang paprika dan ditutup
dengan cover glass. Lalu pada kertas saringnya ditetesi dengan gliserol 10% sebanyak
5 tetes dan di inkubasi selama 3-5 hari. Gliserol bertujuan untuk memberikan
kelembapan pada cawan petri tempat kapang paprika ditumbuhkan. Kertas saring
sendiri untuk dapat menyerap gliserol sehingga kelembapan dalam cawan petri tetap
terjaga dan fungi dapat tumbuh dengan baik. Lalu diinkubasi, maka setelah
diinkubasi beberapa hari fungi yang ditumbuhkan diamati dibawah mikroskop. Pada
praktikum ini digunakan kapang paprika dan tempe.
 DAFTAR PUSTAKA

Anonim. 2011. Laporan Mikro Biologi. Tersedia pada :

http://mikrolaborat.blogspot.com/2011/10/laporan- pewarnaan
bakteri.html. Diunduh pada tanggal 6 Mei 2016.
SUPRIADI, KUSNADI. 2013. PEWARNAAN SEDERHANA. Tersedia pada :
http://kusnadish.blogspot.com/2013/07/pewarnaan-sederhana.html. Diunduh
pada tanggal 6 Mei 2016