Pewarnaan Kapsul

Linny Luciana
Pembimbing: dr. July Kumalawati, SpPK(K), DMM

Latar Belakang
Banyak bakteri, termasuk gram positif dan gram negatif dikelilingi oleh lapisan
polisakarida yang disebut glikokaliks. Bila komposisi lapisan ini terikat erat dan tetap
melekat pada sel, maka disebut sebagai kapsul. Jika lapisan tersebut melekat dengan
longgar dan sulit terlihat maka disebut dengan slime layer atau lapisan lendir. Kapsul
biasanya terdiri dari polisakarida, namun juga mengandung polialkohol dan poliamin
(polipeptida), misalnya Bacillus anthracis yang tersusun dari polimer asam amino.

Perlu diingat bahwa polisakarida pada kapsul bakteri adalah molekul yang sangat
terhidrasi yang mengandung lebih dari 95% air. Dengan demikian, kapsul paling baik
ditunjukkan dalam persiapan tanpa fiksasi panas karena panas akan menyebabkan
distorsi dan penyusutan kapsul. Berbagai fungsi kapsul bakteri yaitu proteksi terhadap
lingkungan, adhesi ke struktur spesifik, dan pembentukan biofilm. Kapsul juga sering
berperan dalam patogenisitas sebagai faktor virulensi untuk melindungi sel dari
fagositosis dan/atau agen bakterisidal.

Contoh bakteri berkapsul yang sering dijumpai pada praktik klinis sehari-hari dapat
diingat dengan singkatan: Even Some Killers Have Pretty Nice Capsules.
 Escherichia coli
 Salmonella typhi/Streptococcus pneumoniae
 Klebsiella pneumoniae
 Haemophilus influenzae
 Pseudomonas aeruginosa
 Neisseria meningitidis
 Cryptococcus neoformans

Kebanyakan bakteri yang memiliki kapsul ialah bakteri Gram-negatif, namun ada juga
beberapa bakteri Gram-positif yang memiliki kapsul, diantaranya:
 Bacillus megaterium (kapsul campuran popipeptida dan polisakarida)
  Streptococcus pyogenes (kapsul asam hialuronat, mikrokapsul)
 Streptococcus pneumoniae (kapsulnya ialah dasar vaksin pneumonia)
 Streptococcus agalactiae (kapsul asam sialat)
 Staphylococcus epidermidis (variable)

Prinsip
Seringkali metode pewarnaan kapsul dilakukan dengan menggunakan salah satu atau
kombinasi berikut ini: (1) zat warna basa yang berinteraksi dengan sel bakteri yang
bersifat basofilik, (2) mordant yang menyebabkan presipitasi bahan kapsul, misalnya ion
logam, alkohol, dan asam asetat, dan (3) pewarnaan berbasis asam yang digunakan
untuk mewarnai latar belakang kuman. Tidak seperti sitoplasma atau dinding sel bakteri,
kapsul bersifat non-ionik, sehingga tidak akan terwarnai oleh baik zat warna positif
maupun negatif. Oleh karena itu, mudahnya, cara terbaik untuk visualisasi kapsul ialah
dengan mewarnai isi sel bakteri menggunakan zat warna basa dan latar belakangnya
menggunakan zat warna asam. Terdapat 2 jenis metode pewarnaan, yaitu metode
Anthony dan metode Maneval.

Prosedur Pewarnaan Kapsul: Metode Anthony

Pada pewarnaan kapsul Anthony, kristal violet digunakan sebagai zat pewarna utama
yang berikatan dengan sel bakteri sekaligus protein pada broth di sekelilingnya, dengan
tembaga sulfat yang berfungsi sebagai mordant sekaligus decolorizer. Nantinya, sel
bakteri dan latar belakangnya akan terwarnai oleh kristal violet, sementara kapsul yang
tidak terwarnai akan tampak terang.

Langkah Pengerjaan:
1. Siapkan smear dari kultur 12 - 18 jam yang ditanam dalam media cair berbasis
protein seperti milk broth.
2. Biarkan mengering di udara. Jangan dipanaskan (untuk menghindari kerusakan
atau distorsi kapsul atau menyebabkan kapsul menjadi menyusut).
3. Genangi slide dengan kristal violet 1% selama 1-2 menit.
4. Bilas hati-hati dengan larutan tembaga sulfat 20%.
5. Keringkan di udara.
6. Periksa slide dengan pembesaran 1000x dengan minyak emersi. Sel bakteri dan
latar belakang protein akan tampak berwarna keunguan sementara kapsul akan
tampak transparan/terang.

Gambar 1. Kapsul Serratia marcescens yang diwarnai dengan metode Anthony.

 Gambar 2. Bacillus megaterium yang diwarnai dengan metode Anthony (tidak
berkapsul).

Metode Maneval
Pada metode pewarnaan kapsul Maneval, zat pewarna dasar yang berinteraksi dengan
sel bakteri adalah fuchsin, dengan counterstaining Congo Red. Pada prosedur pewarnaan
kapsul Maneval, sel bakteri pertama kali dipajankan dengan setetes solusio Congo Red
pada kaca objek. Congo Red adalah indikator pH yang berwarna biru pada pH di bawah
3.0 dan merah di atas pH 5.2. Pada langkah ini, Congo Red mengering untuk membentuk
latar belakang merah pada kaca objek. Setelah itu, larutan Maneval (campuran asam
asetat dan fuchsin) ditambahkan ke slide. Asam asetat menurunkan pH dalam sampel
dan menyebabkan Congo Red berubah dari warna merah menjadi biru. Fuchsin yang
berada di dalam sel bakteri mewarnai sel menjadi merah terang. Asam asetat juga
berfungsi sebagai mordant untuk menstabilkan struktur kapsul. Kapsul menjadi tidak
terwarnai dan nampak sebagai halo terang di sekeliling sel bakteri.

Langkah pengerjaan:
1. Tempatkan beberapa tetes Congo red pada slide.
2. Tambahkan kuman dari kultur ke slide.
3. Keringkan di udara.
4. Genangi smear dengan larutan Maneval dan tunggu 5 menit.
 5. Angkat dan tiriskan zat warna berlebih.
6. Bilas dengan air secara hati-hati
7. Keringkan di udara.
8. Periksa slide dengan perbesaran 1000x dan minyak imersi.

Gambar 3. Kapsul Bacillus sp. yang diwarnai dengan metode Maneval.

Gambar 4. Staphylococcus epidermidis yang diwarnai dengan metode Maneval (tidak

berkapsul).
Catatan Penting:
1. JANGAN pernah memfiksasi sediaan smear di atas api.
2. JANGAN pernah membilas sediaan yang diwarnai dengan air.
3. Pada beberapa sumber, metode Anthony dapat dimodifikasi sehingga latar
belakang sel menggunakan Congo Red atau nigrosin atau tinta india, sehingga
biasanya tidak diperlukan broth berbasis protein lagi.

Gambar 5. Kapsul Klebsiella pneumoniae dengan kombinasi kristal violet dan tinta
india tipis. Perhatikan sel bakteri yang berwarna ungu, latarbelakang abu-abu tipis,
dan kapsul yang tidak berwarna.

Gambar 6. Pewarnaan kriptokokus, dengan menggunakan pewarnaan negatif

sederhana untuk memvisualisasi kapsul.

4. Untuk organisme yang morfologinya khas seperti kriptokokus, cukup digunakan

pewarnaan negatif sederhana untuk memvisualisasi kapsul.
5. Methylene blue, malachite green, safranin, atau zat warna basa lainnya juga dapat
digunakan sebagai alternatif kristal violet.
Menarik Diketahui 1: Reaksi Quellung
Reaksi Quellung atau yang disebut juga reaksi Neufeld merupakan salah satu metode
yang meningkatkan visualisasi kapsul bakteri di bawah mikroskop. Caranya adalah
dengan menambahkan serum anti-kapsul spesifik ke sediaan mikrobiologis yang akan
diperiksa. Kapsul bersifat antigenik, sehingga reaksi antara kapsul dan antibodi anti-
kapsul akan menyebabkan presipitasi dan membuat kapsul bakteri menjadi lebih opak
dan tampak membengkak.

Reaksi ini bermanfaat untuk mengidentifikasi bermacam-macam serotipe kapsul kuman

terutama S. pneumonia, walaupun saat ini telah mulai digantikan oleh metode aglutinasi
lateks dan PCR di lab-lab modern.

Menarik Diketahui 2: Antigenisitas Kapsul

Polisakarida tidak terlalu bersifat antigenik dan tidak terlalu mencetuskan memori sel T.
Oleh karena itu, vaksin berbasis kapsul biasanya menggunakan polisakarida yang
dikonjugasikan dengan carrier protein, agar reaksi imun yang terbentuk lebih kuat.

Gambar 5. Reaksi Quellung-Neufeld (kiri: positif, kanan: negatif)

Sumber Bacaan
1. Hughes RB, Smith AC. Capsule Stain Protocols. American Society of Microbiology
(ASM):http://www.asmscience.org/content/education/protocol/protocol.3041;
 jsessionid=CBClGkBWC0erLTX-Ylh4ghGn.x-asm-books-live-01. Published
September 2007.
2. Breakwell DP, Moyes RB, Reynolds J. Differential staining of bacteria: capsule
stain. In: Current Protocols in Microbiology (Appendix 31). 2009. Philadelphia:
Wiley and Sons. p.15:A.3I.1-A.3I.4