TEKNIK LABORATORIUM 3

Identifikasi bakteri secara biokimia

- Tes biokimia merupakan salah satu metode tradisional untuk identifikasi mikroorganisme,
biasanya dilakukan dengan identifikasi fenotip.
- Selama bertahun-tahun metode ini digunakan secara ekstensif dan terus digunakan hingga
saat ini, terutama di beberapa laboratorium di mana jenis mikroorganisme tertentu harus
diidentifikasi dengan cepat.

DD sel bakteri Gram (+) dan Gram (-)

Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang mengandung lapisan peptidoglikan yang tebal
(90% dinding sel).
Komposisi Cat Gram
1. Gram A : Kristal Gentian Violet
2. Gram B : KI dan I2
3. Gram C : Aseton + EtOH
4. Gram D : Safranin
Pengecatan gram (cara kerja)
1. Preparat diambil satu ose dari koloni yang tumbuh pada Agar darah dan Mc Conkey,
diratakan pada obyek gelas sehingga membentuk diameter 1 – 2 cm.
2. Fiksasi dilakukan dengan cara melewatkan beberapa kali di atas api.
3. Preparat digenangi cat Gram A 1 – 3 menit cat dibuang tanpa dicuci
4. Genangi dengan cat Gram B 1/2 – 1 menit,
5. Cat di buang dan preparat dicuci dengan air.
6. Tetesi dengan cat Gram C sampai warna tepat dilunturkan, setelah itu preparat dicuci
dengan air.
7. Preparat digenangi cat Gram D 1 – 2 menit, kemudian dicuci dan dikeringkan pada suhu
kamar pada posisi miring
8. Periksa di bawah mikroskop dengan pembesaran kuat. Pada pemeriksaan mikroskop akan
terlihat jelas kontras warna antara bakteri dengan sekitarnya.
 Agen dekolorisasi, (etanol atau etanol dan
larutan aseton), berinteraksi dengan lipid
membran gram positif dan Bakteri gram negatif.
Membran sel luar Gram negatif hilang dari sel,
membiarkan lapisan peptidoglikan terbuka

Beberapa bakteri, setelah diwarnai dengan

Gram Stain menghasilkan pola disebut
gram-variabel di mana campuran sel merah
muda dan ungu terlihat. Genus
Actinomyces, Arthrobacter,
Corynebacterium, Mycobacterium, dan
Propionibacterium memiliki dinding sel
sangat sensitif terhadap kerusakan selama
pembelahan sel, menghasilkan pewarnaan
gram negatif ini sel gram positif.

Hasil penegcatan Gram S. Aureus dan E. Coli

Sejarah
Pewarnaan Gram pertama kali digunakan pada tahun 1884 oleh Hans Christian Gram
(Gram,1884). Gram sedang mencari metode yang memungkinkan visualisasi cocci di bagian
jaringan paru-paru dari mereka yang meninggal karena pneumonia. Sudah tersedia metode
pewarnaan yang dirancang oleh Robert Koch untuk memvisualisasikan basil turberkel. Gram
menyusun metodenya menggunakan Crystal Violet (Gentian Violet) sebagai noda utama, larutan
yodium sebagai mordan diikuti dengan perlakuan dengan etanol sebagai penghilang warna.
Prosedur pewarnaan ini membuat inti sel eukariotik dalam sampel jaringan tidak terwarnai,
sementara kokus yang ditemukan di paru-paru orang yang meninggal karena pneumonia
diwarnai biru/ungu.
Gram menemukan bahwa pewarnaannya bekerja untuk memvisualisasikan serangkaian
bakteri yang terkait dengan penyakit seperti "kokus artritis supuratif setelah demam berdarah".
Namun dia menemukan bahwa basil tifoid mudah dihilangkan warnanya setelah pengobatan
dengan kristal violet dan yodium, ketika etanol ditambahkan. Kita sekarang tahu bahwa
organisme yang diwarnai biru/ungu dengan pewarnaan Gram adalah bakteri gram positif dan
termasuk Streptococcus pneumoniae (ditemukan di paru-paru penderita pneumonia) dan
Streptococcus pyogenes (dari pasien demam Scarlet) sedangkan organisme yang dihilangkan
warnanya adalah gram negatif. bakteri seperti Salmonella Typhi yang berhubungan dengan
demam tifoid.

Identifikasi secara biokimia

1. 1. Bakteri Gram Negatif (Khusus Enterobacteriaceae) Bakteri dikukultur dalam media
KIA, LIA, MIO, SSS.
2. Bakteri Gram Positif (S. aureus) Bakteri dikultur di media MSA (Mannitol Salt Agar).

Tes Biokimia
- Umumnya diperlukan untuk identifikasi yang lebih konklusif
- Sebagian besar bergantung pada indikator pH atau perubahan warna ketika suatu senyawa
terdegradasi

1) Fermentasi Sugar

 Contohnya : Laktosa, sukrosa, glukosa, dll.

 Fermentasi menghasilkan produksi asam
o Indikator pH berubah warna
o Pink > Kuning
  Tabung terbalik (tabung Durham) menghasilkan gas
2) Deteksi Urease

 Enzim yang mendegredasi urea

Urea > CO2 & NH3
 Indikator pH
Berubah menjadi merah muda cerah dalam kondisi basa
 Helicobater pylori dapat dideteksi menggunakan tes napas

3) Katalase
 Enzim yang sering dijumpai
o Dimiliki sebagian besar bakteri yang dihidup dengan adanya oksigen
o Tidak ada dalam bakteri asam laktat
- Contohnya : Streptococcus
- Bakteri beta-hemolitik katalase-negatif dari biakan tenggorokan mungkin
Streptococcus pyogenes
 Pengujian sederhana
H2O2 > H2O + O2
Gelembung O2 terlihat
 Cara kerja
Tempatkan slide mikroskop di dalam cawan petri.Sediakan penutup cawan petri. Dengan
menggunakan jarum inokulasi steril atau tongkat aplikator kayu, kumpulkan sejumlah
kecil organisme dari koloni 18 hingga 24 jam yang terisolasi dengan baik dan letakkan di
atas slide mikroskop.
Identifikasi secara biokimia Baketri Eneterobakteriaceae
1. Ambil ose lancip, pijarkan pada nyala api. Biar dingin dan posisi agak dekat api.
2. Ambil bakteri dari tb.stok menggunakan ose lancip dengan cara tutup tabung dibuka, mulut
tb dilewatkan api. Goreskan ose pada bakteri. Lewatkan lagi mulut tb dan tutup dengan
kapas.
3. Ose yang berisi bakteri ditusukan pada deret media biokimia (KIA, LIA, MIO, SSS) secara
tegak lurus pada daerah butt dan goreskan zig-zag pada daerah slant.
4. Tiap membuka dan menutup tabung, mulut tb harus dilewatkan api.
5. Inkubasikan tb pada suhu 37℃ selama 24 jam.

Agar
1) KIA (Kliger Iron Agar)
 KIA (Kliger Iron Agar), dalam media ini (bentuknya miring) disamping mempelajari
reaksi bakteri terhadap komponen penyusun media juga diperhatikan adanya produksi
asam (ditandai perubahan warna dari merah me.
 njadi kuning), baik pada daerah yang miring (slant) ataupun pada tusukan (butt).
 Dengan KIA dapat dipelajari reaksi bakteri terhadap gula-gula (laktosa dan dekstrosa).
 Apakah bakteri tersebut menghasilkan asam dan gas, atau menghasilkan asam tanpa gas,
atau tidak memecah kedua gula tersebut,
 Apakah mempunyai kemampuan membentuk H2S yang akan diikat menjadi Ferri Sulfida
dan akan terlihat berwarna hitam.
2) SSS (Semi Solid Sucrose)
 Dalam media ini dapat dipelajari: motilitas (pergerakan bakteri), reaksi bakteri terhadap
sukrosa. Disamping itu bila sukrosa diganti dengan gula yang lain (yang diperlukan)
maka dapat diketahui kelakuan bakteri terhadap gula tersebut
3) LIA (Lysine Iron Agar)
  Dalam media ini dapat dilihat kelakuan bakteri terhadap lysine dan kemampuan
membentuk H2S.
4) MIO (Motility Indol Ornithine Medium)
 Dalam media ini dipelajari pergerakan bakteri, kemampuan bakteri menghasilkan Indol,
reaksi pemecahan Ornithine (Anonim, 1993a).

Hasil uji biokimia Citrobacter

Uji biokimia Klepsiela, S.Tiphy, Shigella, Salmonella enteritidis

Melihat Motilitas bakteri

Pengujian motilitas dilakukan dengan menyiapkan sediaan basah dan
kemudian diamati di bawah mikroskop. Motilitas bakteri juga dapat diuji
dengan menginokulasikan bakteri pada media motilitas semipadat.
Identifikasi E. coli dengan media TBX
50 µl sampel pada pengenceran tertentu

Inokulasi pda mediaTBX, ratakan

Inkubasi 18-24 jam dengan suhu 37℃

Amati kolon yang tumbuh

Warna bitu-kehijauan (positif E. coli)

Reaksi yang terjadi

Koloni E. coli di media TBX