Laporan Praktikum III Dasar Genetika Ternak

GEL ELEKTROFORESIS

Oleh
NAMA : NUR FIANTI
KELAS :A
KELOMPOK : IV
ASISTEN : UCI MALINDA

JURUSAN PETERNAKAN

FAKULTAS PETERNAKAN

UNIVERSITAS HALU OLEO

KENDARI

2016
 I. PENDAHULUAN

1.1. Latar belakang

Genetika adalah ilmu yang mempelajari sifat keturunan. Keturunan adalah

proses biologis dimana orangtua/induk mewariskan gen kepada anaknya atau

keturunannya. Gen adalah bagian kromosom atau salah satu kesatuan kimia

(DNA) dalam kromosom, yaitu dalam lokus yang mengendalikan cirri genetis

suatu makhluk hidup.

DNA merupakan senyawa kimia yang paling penting pada makhluk hidup,

yang membawa keterangan genetik dari sel khususnya atau dari makhluk dalam

keseluharannya dari satu generasi kegenerasi berikutnya.

Elekroferesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan

berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Kecepatan

molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan

ukuran. Elektroforesis dapat digunakan untuk makromolekul (seperti protein dan

asam nukleat).

Teknik elektroforesis digunakan untuk memisahkan makromolekul.

Makromolekul yang disajikan elektroforesis adalah protein dan asam nukleat yang

memiliki perbedaan ukuran, kadar ion, dan molekul-molekul penyusunnya.

Molekul protein dan asam nukleat yang bermuatan negatif akan bergerak dari

kutub negatif menuju kutub positif dari gel elektroforesis.

Elektroforesis gel agarosa adalah metode pemisahan molekul DNA dan

RNA menurut muatan, ukuran, dan bentuk. Berdasarkan uraian tersebut maka

perlu dilakukan praktikum gel elektroforesis.

1.2. Tujuan

Tujuan dilakukannya praktikum elektroforesis DNA adalah sebagai berikut:

1. Untuk mengetahui prinsip kerja elekroforesis,

2. Untuk mengetahui materi dan metode elektroforesis,

3. Untuk mengetahui alat dan bahan elektroforesis.

1.3. Manfaat

Manfaat dilakukannya prktikum elektroforesis DNA adalah sebagai berikut:

1. Dapat mengetahui prinsip kerja elekroforesis,

2. Dapat mengetahui materi dan metode elektroforesis,

3. Dapat mengetahui alat dan bahan elektroforesis.

 II. METODE PRAKTIKUM

2.1. Waktu dan Tempat

Praktikum gel elektroforesis dilaksanakan pada Hari Kamis, Tanggal 8

Desember 2016, di laboratorium Genetika dan Pemuliaan Ternak, Fakultas

Peternakan, Universitas Halu Oleo, Kendari.

2.2. Alat dan Bahan

Alat yang digunakan pada praktikum gel elektroforesis dapat dilihat pada

Tabel 1.

Tabel 1. Alat dan Kegunaan

No. Alat Kegunaan
1 Alat Tulis Untuk menulis hasil praktikum
2 UV illuminator Untuk melihat warna
3 Elektroforesis Untuk menghantarkan panas
4 Sisir Untuk membuat lubang penyimpnan sampel
5 Nampan Meletakan gel

Bahan yang digunakan pada praktikum gel elektroforesis dapat dilihat

pada Tabel 2.

Tabel 2. Bahan dan Kegunaan

No. Bahan Kegunaan

1 Gel agarose Bahan pengamtan
2 Buffer Sebagai media penghantar listrik
3 Epidium bromida Sebagai bahan pewarna

2.3. Prosedur Praktikum

Prosedur kerja pada praktikum gel elektroforesis adalah sebagai berikut :

1. Menyiapkan alat dan bahan,

2. Menjelaskan prinsip kerja elektroforesis,

3. Mengamati dan mencatat bagian dan fungsi elktroforesis,

4. Membuat laporan.
 III. PEMBAHASAN

3.1. Prinsip Kerja Elektroforesis

Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis),

ekstraksi atau pemisahan DNA dari bahan padar seperti selulosa dan protein, serta

pemurnian DNA. Prinsip elektroforesis agaros adalah teknik pemisahan asam

nukleat/protein berdasarkan perbedaan medan listrik, molekul dan partikel

bermuatan akan bergerak kea rah elekrode yang memiliki muatan berlawanan di

bawah pengaruh medan istrik. Prinsip elektroforesis SDS-PAGE (Sodium Dodecyl

Sulfate-Polyacrilamide Gel Reaction) pemisahan protein darah dengan migrasi

komponen acrilamida berdasarkan perbedaan berat molekul (Lubis dkk., 2013).

Sifat partikel bergerak ke kutub yang berlawanan dengan muatannya

(partikel/ion positif bergerak ke katoda dan sebaliknya). Perbedaan muatan dan

ukuran partikel mengakibatkan laju bergerak berbeda yaitu terjadi pemisahan

(Mayangsari, 2012).

3.2. Materi dan Metode Elektroforesis

Sputum dicampur dengan larutan NaOH 1N dengan perbandingan 1:1.

didiamkan selama 30 menit. Dari campuran tersebut diambil 1,5 mL, masukkan

ke dalam tabung eppendorf dicentrifuge selama 5 menit pada kecepatan

11.000xg lalu pellet diambil kemudian ditambahkan 250 l buffer lisis dan 5 l

proteinase K diinkubasi pada suhu 55C selama 1jam kemudian diinkubasi

kembali pada suhu ruang selama 5 menit, lalu ditambahkan 300 l fenol.

Selanjutnya divortex selama 5 menit, disentrifuge 5 menit pada kecepatan

14.000xg. Selanjutnya dipindahkan fase atas A l (sesuai banyaknya fase atas

yang terbentuk, minimal 200 l). Fase atas(A) + (0,1xA) l NaOAC +(1,4xA)

l etanol absolut lalu dibolak-balik perlahan lalu campuran tersebut disimpan

pada suhu -20C selama 30 menit. Campuran kemudian disentrifuge selama 15

menit pada kecepatan 14.000xg sehingga terbentuk supernatan dan filtrat.

Selanjutnya dekantasi supernatan tambahkan 200 l etanol 70%, sentrifuge 5

menit dengan kecepatan 10.000xg. Supernatan dibuang keringkan dengan

menggunakan alat speed vac. DNA dilarutkan dengan menambahkan 25 l H2O

free RNAse. DNA diukur konsentrasinya menggunakan alat spektrofotometer.

Agar didapatkan hasil elektroforesis yang baik, diperlukan proses isolasi DNA

yang benar. Konsentrasi DNA yang layak diamplifikasi 1,8-2,0. Hasil isolasi

DNA tersebut kemudian diamplifikasi menggunakan metode PCR (Polymerase

Chain Reaction) dan divisualisasikan dengan metode elektroforesis menggunakan

dua konsentrasi gel agarosa yang berbeda yaitu konsentrasi gel agarosa 1% dan

1,2%. Pembuatan gel agarosa; agarosa serbuk ditimbang sesuai dengan

konsentrasi yang akan dibuat (1,0% dan 1,2%) dilarutkan dalam buffer TAE 1x

dipanaskan pada hotplate hingga mendidih dan berwarna jernih. Setelah

mendidih, gel didinginkan hingga suhu 55C lalu ditambahkan Cybr green

sebanyak 1,5 l dan dihomogenkan. Gel selanjutnya dimasukkan kedalam

cetakan yang telah disisipkan sisir elektroforesis dibagian sisi-sisinya. Gel

dibiarkan membeku ( selama 30 menit). Lakukan elektroforesis hasil PCR.

Hasil PCR dilihat menggunakan alat UV translluminator/gel dokumen. Lihat

fragmen DNA yang terbentuk dan dibandingkan dengan kontrol positif dan

marker Hind III 281-310 pb. Hasil : Positif : terbentuk pita/band yang sejajar

dengan kontrol positif dan ada diantara 281-310 pb. Negatif : tidak terbentuk
pita/band. Luas area ketebalan pita/band DNA yang terbentuk dari hasil

elektroforesis kemudian diolah menggunakan software image J (Efrida, 2015).

Gel agarosa (1%) dibuat dengan melarutkan 0.3 gram agarosa ke dalam

larutan TAE 1X hingga volume 30 mL. Larutan agarosa dididihkan sehingga larut

sempurna. Suhu larutan diperiksa 50-60 C, ditambahkan 1 L EtBr. Larutan

agarosa dituang kedalam baki gel agarosa, dibiarkan hingga larutan berubah

menjadi gel yang padat. Baki yang telah berisi gel agarosa dimasukkan kedalam

tangki elektroforesis dan tambahkan buffer TAE hingga gel terendam seluruhnya.

Sejumlah 10 L unit DNA hasil isolasi yang telah dicampur dengan loading dye

(0.25 % bromphenol blue, 40 % sukrosa) dimasukan ke dalam sumur gel. Waktu

rinning 45-60 menit dengan volttase 100 V. gel hasil elektroforesis diamati di

bawah sinar UV menggunakan UV Transiluminator (Aini dkk., 2011 ).

3.3. Alat dan Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun muda dari 10

tanaman bitti yang berasal dari provenansi Kabupaten Enrekang dan Bone

yang telah ditetapkan sebagai lokasi penelitian. Analisis molekuler

menggunakan eppendorf (e-cup), mikrotip, nitrogen cair, buffer lysis,

isopropanol, ddH2O Mikrozone Megamix Blue, Agarose, PCR tube, loading

dye, TAE dan TBE. Alat yang digunakan selama pengambilan sampel etanol,

cutter, plastic, label dll. Analisis molekuler menggunakan mortar, mikropipet

(Eppendorf Research), Inkubator (Juliabo Paratherm III), Mesin sentrifugasi

(Ependorf Centrifuge 5415 D), thermal cycler (Applied Biosystem), mesin

Elektrolisis (Bio Rad) (Fajarwati dkk., 2012).

 Bahan yang digunakan antara lain adalah jaringan otak sapi, buffer ekstrak

GAD (dengan kandungan : 100 mM pindaksol 5-phosphat (PLP)), 1 mM 2-

aminoetilisotiouronium bromide (AET), 4 mM fenilmetilsulfonilfluorida

(PMSF), 0.0025 M entilendiamin tetraasetat (EDTA), 1 M sucrose, sephadex G-

75, ammonium sulfat, selofan, buffer phosphate 0.2 M pH 7, HCL 0.01 M,

sodium dodecyl sulfat (SDS), commasive brilliant blue, acrylamide, TEMED,

dan BaCl2 0.1 M. alat yang digunakan adalah elektroforesis apparatus merk Bio-

Rad, Sentrifuge dingin, kromatografi, stirrer dan beacker glass (Arjita, 2009).

Bahan yang digunakan pada pemeriksaan PCR yaitu cairan efusi pleura,

isopropanol, proteinase K, etanol buffer lisis, H 2O free DNA, KIT PCR (terdiri

atas enzim DNA polymerase, dNTPs, buffer 10 x), sepasang primer, agarose,

buffer TAE, loading dye parafilm, kontrol positif, dan kontrol negatif. Sdangkan

alat-alat yang digunakan adalah tabung eppendrof (1.5 ml dan 0.2 ml), tip

berbagai ukuran, pipet mikro, alat sentrifuge, waterbath, alat elekroforesis, dan

illuminator UV (Jayasaputra dkk., 2007).

 IV. PENUTUP

4.1. Kesimpulan

Berdasarkan tujuan dari praktikum gel elektroforesis dapat disimpulkan

bahwa:

1. Prinsip kerja gel elektroforesis agaros adalah teknik pemisahan asam

nukleat/protein berdasarkan perbedaan medan listrik, molekul dan partikel

bermuatan akan bergerak kea rah elekrode yang memiliki muatan berlawanan

di bawah pengaruh medan istrik.

2. Materi dan metode elektroforesis salah satunya adalah Gel agarosa (1%)

dibuat dengan melarutkan 0.3 gram agarosa ke dalam larutan TAE 1X hingga

volume 30 mL. Larutan agarosa dididihkan sehingga larut sempurna. Suhu

larutan diperiksa 50-60 C, ditambahkan 1 L EtBr.

3. Alat dan bahan yang digunakan diantaranya yaitu cairan efusi pleura,

isopropanol, proteinase K, etanol buffer lisis, H 2O free DNA, KIT PCR

agarose, dan lian-lain. Sedangkan alat-alat yang digunakan adalah tabung

eppendrof (1.5 ml dan 0.2 ml), tip berbagai ukuran dan lain-lain.

4.2.Saran

Saran saya pada praktikum ini, sebaiknya alat dalam laboratorium

dilengkapi agar dalam praktikum selanjutnya bisa dilaksanakan dengan efisien.

 DAFTAR PUSTAKA

Aini, A.N., A.Ria., L.N. Aminin, 2011. Pemurnian DNA Plasmid Puc19
Menggunakan Kolom Silika dengan Denaturan Urea. Jurnal Sains dan
Matematika Vol. 19 No. 2

Arjita, I.P.D., 2009. Analisis Protein Jaringan Otak Sapi dengan Metode Isolasi,
Purifikasi dan Visualisasi. Gane Swara Vol. 3 No. 2

Efrida, A. 2015. Pengujian Konsentrasi Gel Agarosa 1 % dan 1.2 % pada

Elektroforesis DNA Mycobacterium Tuberculosis. Jurnal Ilmu-Ilmu
Kesehatan

Fajarwati, L., M. Restu, T. Kuswinati. 2012. Optimalisasi Suhu dan Lama

Ingkubasi dalam Ekstraksi DNA Tanaman Bitti (Vitex cofassus Reinw) serta
Analisis Keragaman Genetik dengan Teknik RAPD-PCR. Jurnal Sains dan
Teknologi Vol. 12 No. 3

Jayasaputra, D.k., J.T. Widjaja, T.L., Wargasetia, 2007. Deteksi Mycobacterium

Tuberculosis dengan Teknik PCR pada Cairan Efusi Pleura Penderita
Tuberkulosis Paru. JKM Vol. 7 No. 1

Lubis, N.A., dan F.G. Prawira. 2013. Isolasi DNA Manusia (Epitelial Mulut dan
Darah) dan Teknik PCR Isolasi Protein dari Darah, Elektroforesis Agarose
dan SDS-PAGE. Laporan Praktikum

Mayangsari, Y., 2012. Electrophoresis. Department of Food and Agricultural

Products Processing Technology. Faculty of Agrikultural Technologi Gadjah
Mada University