Penentuan Kadar Natrium Benzoat, Vitamin C, dan Kafein

Menggunakan Instrumen HPLC

Judul Praktikum :
Penentuan Kadar Natrium Benzoat, Vitamin C, dan Kafein Menggunakan Instrumen HPLC

Tujuan Praktikum :
1. Memahami cara kerja instrumen HPLC untuk analisis kuantitatif.
2. Dapat melakukan preparasi dengan tepat dan akurat, serta dapat mengikuti manual
pengoperasian HPLC.
3. Dapat menentukan/menghitung kadar zat aditif dalam sampel minuman.

A. DASAR TEORI

Kromatografi adalah metode suatu proses fisik yang digunakan untuk memisahkan
komponen-komponen dari suatu campuran senyawa kimia. Dalam kromatografi, campuran
tersebut dibuat sebagi zona yang sempit (kecil) pada salah satu ujung media porus seperti
adsorben, yang disebut alas atau landasan kromatografi. Zona campuran kemudian digerakan
dengan larutan suatu cairan atau gas yang bergerak sebagai pembawa, melaui media porus
tersebut, yang berupa partikel-partikel yang diam (tidak bergerak, statisiones). Sehingga
akibatnya masing-masing komponen dari campuran tersebut akan terbagi (terdistribusi) secara
tidak merata antara alas yang diam dan cairan atau gas yang membawanya. Akibat selanjutnya,
masing-masing komponen akan bergerak (bermigrasi) pada kecepatan yang berbeda (differential
migration) dan dengan demikian, akan sampai pada ujung lain dari alas tersebut pada waktu yang
berlainan, dan dengan demikian terjadilah pemisahan diantara komponen-komponen yang ada.
(Bahti, Husein H. 2011: 4).
Kromatografi merupakan salah satu metode pemisahan komponen-komponen campuran
yang berdasarkan distribusi diferensial dari komponen-komponen sampel diantara dua fasa, yaitu
fasa gerak dan fasa diam. Salah satu teknik kromatografi yang dimana fasa gerak dan fasa
diamnya menggunakan zat cair adalah HPLC (High Performance Liquid Chromatography) atau
didalam bahasa Indonesia disebut KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi).
Teknik HPLC merupakan suatu metode kromatografi cair-cair, yang dapat digunakan
baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kualitatif dengan teknik
HPLC didasarkan pada pengukuran luas area standar. Pada prakteknya, metode pembandingan
area standar dan sampel kurang menghasilkan data yang akurat bila hanya melibatkan suatu
 konsentrasi standar. Oleh karena itu, dilakukan dengan menggunakan teknik kurva kalibrasi.
(Wiji, dkk. 2010 : 17).
HPLC yang modern telah mucul akibat pertemuan dari kebutuhan, keinginan manusia
untuk meminimalis pekerjaan, kemampuan teknologi, dan teori untuk memandu pengembangan
pada jalur yang rasional. Jelas sebelum era peralatan yang modern bahwa LC (Liquid
Chromatography) memiliki kekuatan pemisahan yang sangat ampuh, bahkan untuk komponen-
komponen yang berhubungan sangat erat. LC harus ditingkatkan kecepatannya, diotomasasi, dan
harus disesuaikan dengan sampel-sampel yang lebih kecil, waktu elusi yang beberapa jam
(Underwood, Day. 2002 : 553).
HPLC berbeda dari kromatografi kolom cairan konvensional dalam hal digunakan bahan
pengisi kolom berupa partikel yang sangat kecil berukuran sampai 3-5 m (1m = 10 -6 m).

Sehingga mengharuskan digunakannya tekanan tinggi sampai 20.000 Kpa ( 200 atmosfir)

untuk mengalirkan fasa gerak melalui kolom tersebut.

Ternyata, penggunaan bahan pengisi kolom yang lebih kecil ini bukan saja telah
memperbaiki kecepatan analisis, tapi (dari ini yang lebih penting) ialah telah menghasilkan suatu
teknik dengan daya pisah yang tinggi. HPLC mempunyai kelemahan- kelemahan yang
diantaranya, peralatannya lebih rumit, tidak murah, dan perlu pengalaman. Untuk beberapa jenis
zat, metode ini kurang sensitif. Selain itu sampel disyaratkan harus stabil dalam larutan.
Berdasarkan kepolaran fasa geraknya, HPLC dibagi menjadi 2 macam yaitu :
a) Fase Normal HPLC
HPLC jenis ini secara esensial sama dengan kromatografi kolom. Meskipun disebut
normal, ini bukan bentuk biasa dari HPLC. Kolom ini diisi dengan partikel silika yang sangat
kecil dan pelarut nonpolar seperti heksan sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4,6
mm (dan kemungkinan kurang dari nilai ini) dengan panjang 120 nm-250 nm. Senyawa-senyawa
polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding
dengan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan
lebih cepat melewati kolom. Apabila pasangan fasa diam lebih polar daripada fasa geraknya
maka sistem ini disebut HPLC fase normal.
b) Fase Balik HPLC
Pada HPLC jenis ini, ukuran kolomnya sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non
polar melalui pelekatan hidrokarbon dengna rantai panjang pada permukaannya secara sederhana
baik berupa atom karbon 8 atau 18. Dalam kasus ini, akan terdapat interaksi yang kuat antara
pelarut polar dan molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Interaksi yang terjadi tidak
 sekuat interaksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fasa diam) dan
molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu molekul-molekul polar akan lebih cepat
bergerak melalui kolom. Sedangkan molekul-molekul non polar akan bergerak lambat karena
interaksi dengan gugus hidrokarbon.
ALAT DAN BAHAN

Alat :

1. Instrumen HPLC 1 set

2. Spatula 1 buah
3. Labu ukur 50 mL 6 buah
4. Labu ukur 10 mL 6 buah
5. Neraca analitik terkalibrasi 1 set
6. Corong pendek 1 buah
7. Pipet tetes 6 buah
8. Gelas kimia 20 mL 1 buah
9. Gelas ukur 500 mL 1 buah
10. Ultrasonic vibrator 1 set
11. Pipe seukuran (1,2,3,4,5 mL) 1 buah
12. Kertas saring Whattmann 1 lembar
13. Membrane PTFE dan selulosa nitrat 1 lembar

Bahan :

1. Natrium benzoat p.a 2,5 mg

2. Vitamin C standar 1 mg
3. Kafein 5 mg
4. Metanol for HPLC secukupnya
5. Sampel minuman yang mengandung vit.C 5 mL
6. Kalium dihidrogenfosfat 0,68 g
7. Aquabides secukupnya
8. Asetonitril 80 mL + secukupnya
PROSEDUR KERJA

1. Pembuatan fasa gerak (pelarut)

Dihitung dan ditimbang jumlah KH2PO4 yang diperlukan untuk membuat larutan KH2PO4 0,01
M sebanyak 500 mL dalam aquades. Kemudian di ajust pH pada nilai 2,65 dengan asam fosfat.
Dilakukan penyaringan untuk larutan KH2PO4 menggunakan membrane selulosa nitrat.
Dilakukan penyaringan pula untuk asetonitril dengan PTFE. Dihilangkan gelembung pada
larutan dengan ultrasonic vibrator selama 15 menit. Dibuat campuran larutan fasa gerak KH2PO4
dan asetonitril (60:40) untuk keperluan larutan standar dan larutan sampel, sesuai kebutuhan.
2. Pembuatan larutan induk natrium benzoat, vitamin C, dan kafein
Ditimbang zat standar natrium benzoat 2,5 mg, vitamin c 1 mg, dan kafein 5 mg. Dicampurkan
ketiga zat standar dengan melarutkan dalam 50 mL fasa gerak secara kuantitatif pada labu ukur.
Dihomogenkan selama 5 menit menggunakan ultrasonic vibrator.

3. Pembuatan deret larutan standar benzoat, vitamin C, dan kafein

Dipipet larutan induk masing-masing 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, dan 5 mL, diencerkan dengan
fasa gerak dalam labu ukur 10 mL. Dihomogenkan larutannya, kemudian disaring semua larutan
standar tersebut dengan menggunakan membrane PTFE. Ditempatkan hasil saringan ke dalam
vial bertutup yang telah diberi label. Dilakukan degassing selama 5 menit. Larutan standar siap
diinjeksikan.

4. Pembuatan larutan sampel

Dipipet 5 mL larutan sampel , dilarutkan dengan fasa gerak hingga 10 mL secara kuantitatif pada
labu ukur. Dilakukan penyaringan dengan PTFE, ditampung dalam botol vial bertutup.
Dihilangkan gelembung pada larutan sampel dengan menggunakan ultrasonic vibrator selama 5
menit.
Penyiapan instrumen HPLC
Sementara melakukan preparasi sampel dan standar, dihidupkan peralatan HPLC sesuai dengan
langkah berikut :
a) Dikondisikan instrumen HPLC dengan: fasa gerak dengan sistem elusi gradien dengan kondisi:

Waktu (menit) %Asetonitril % KH2PO4

0 60 40
1 40 60
2 20 80
3 30 70
4 40 60
5 60 40
Kolom : C-18 (12,5 cm)
Panjang gelombang : 254 nm
Laju alir : 0,75 mL/menit
Volume injeksi : 20 L
b) Dipastikan kabel penghubung listrik telah tersambung dengan benar.
c) Ditekan tombol ON pada sakelar listrik.
d) Diisi botol fasa gerak dengan volume yang memadai dan dikosongkan botol penampung.
e) Ditekan tombol ON pada alat, berturut-turut untuk power, detektor, dan pompa.
f) Dilakukan pemrograman alat dengan komputer. Diikuti langkahnya sesuai instruksi dalam
komputer.
g) Dipilih mode yang akan digunakan sesuai dengan parameter kondisi instrumen
h) Apabila kromatogram telah menunjukkan base line yang mendatar , maka instrumen siap
digunakan
i) Diinjeksikan berturut-turut larutan standar (dimulai dari konsentrasi terendah), dan terakhir
larutan sampel.
j) Dicetak hasil pengukuran, dicatat kondisi percobaannya.
k) Setelah selesai digunakan, dimatikan pompa dengan menyoroti tanda pompa dalam komputer.
l) Ditutup file sesuai petunjuk, lalu dimatikan komputer.
m) Untuk mematikan, ditekan tombol OFF pada pompa, detektor, dan power secara berurutan.
Diputuskan sambungan listrik.

6. Perhitungan hasil analisis

Dari hasil operasi instrumen akan diperoleh kurva kalibrasi. Bila kurva kalibrasi diperoleh
dengan koefisien regresi > 0,997 , maka boleh melanjutkan perhitungan kadar zat aditif dalam
sampel. Dihitunglah kadarnya dalam satuan % w/w . Bila tidak diperoleh kurva yang linier, maka
dilakukan diskusi untuk mencari penyebabnya.