Abstrak

Isolasi dan pemurnian bioassay dari Ekstrak etil asetat Aspergillus terreus MC751 menyebabkan
Karakterisasi butirolakton I sebagai antidiabetes dan antioksidan. Aktivitas antidiabetes dari
butirolaktonase I dievaluasi dengan inhibitor -Glucosidase dan -amilase. Butyrolactone I
Menunjukkan konsentrasi-ketergantungan yang signifikan, tipe campuran Aktivitas
penghambatan terhadap ragi -glukosidase dengan IC50 dari 54M. Namun, senyawa tersebut
menunjukkan aktivitas yang kurang terhadap usus tikus -glukosidase dan -amilase. Ini adalah
laporan pertama tentang -glukosidase Aktivitas penghambatan butyrolactone I. Aktivitas
antioksidan dari Butyrolactone I dievaluasi berdasarkan efek pemulungan pada 1,1-Diphenyl-2-
picrylhydrazyl (DPPH) (IC50 = 51 M) dan hydrogen Peroksida (IC50 = 141 M) radikal serta
uji kekuatan reduksi. Hasilnya menunjukkan bahwa butyrolactone I merupakan antidiabetes yang
menjanjikan Juga antioksidan dan harus dipertimbangkan untuk uji klinis.

Kata kunci-Aspergillus terreus MC751, antidiabetes, antioksidan, Butyrolactone I.

 I. PENDAHULUAN

Hiperglikemia merupakan, faktor risiko klasik pada Perkembangan diabetes, berakibat

pada generasi Spesies oksigen reaktif (ROS), akhirnya menyebabkan peningkatan Stres
oksidatif dalam berbagai jaringan [1]. Peningkatan produksi radikal bebas dan pengurangan
pertahanan antioksidan Sebagian dapat memediasi inisiasi dan berkembangnya Komplikasi
terkait diabetes [2]. Oleh sebab itu suplementasi Dengan antioksidan bisa bermanfaat bagi
penderita diabetes, tidak Hanya untuk menjaga kadar antioksidan dalam tubuh tapi juga untuk
mengobati Komplikasi jangka panjang yang dapat timbul [3].

Beberapa strategi manajemen telah diusulkan untuk Tahap awal disglycemia dengan
tujuan mencegah pengembangan lebih lanjut. Inhibitor -glukosidase dan -amilase yaitu
Enzim kunci dalam pencernaan karbohidrat merupakan salah satu cara untuk Menekan
hyperglycemia pasca-prandial, dengan memperlambat Pencernaan oligosakarida dan
disakarida, dan penundaan Penyerapan glukosa serta mengurangi kadar glukosa di Plasma [4]
- [5]. Karena itu, kombinasi Inhibitor -glukosidase dan antioksidan akan efektif mencegah
Perkembangan diabetes mellitus (DM) tipe 2 lebih lanjut [6].

Acarbose yaitu pseudo-tetrasacharide yang diisolasi dari fermentasi Kaldu dari

Actinoplanes spp, yang merupakan inhibitor -Glucosidase dan telah digunakan untuk
pengobatan DM tipe-2 [7]. Minat dalam mengisolasi inhibitor -glukosidase dari beberapa
mikroorganisme telah meningkat. Sebagai Contohnya yaitu validamycin A yang diisolasi dari
kaldu Streptomyces Hygroscopicus var. Limoneus, Bacillus subtilis B2 juga Memiliki
aktivitas -glukosidase yang kuat [7], N-Yang mengandung maltooligosakarida GIB-638
diisolasi dari Filtrat kultur Streptomyces fradiae PWH638 [8], dan Aspergillusol A diisolasi
dari jamur Aspergillus aculeatus yang berasal dari laut [9]. Namun, ada Beberapa penelitian
yang relative tentang inhibitor -glukosidase dan antioksidan dari Spesies Aspergillus.

Penelitian sebelumnya, kami melaporkan bahwa ekstrak etil asetat Dari A. terreus
menunjukkan aktivitas penghambatan potensial terhadap -Glukosidase [10] dan
menghasilkan antioksidan [11]. Baru-baru ini, kami Menemukan bahwa ekstrak etil asetat A.
terreus MC751 Menunjukkan Efek penghambatan -glukosidase dan antioksidan. Oleh karena
itu, tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengisolasi Dan mengidentifikasi senyawa
antidiabetes dan antioksidan Dari ekstrak tersebut. Aktivitas antidiabetes diidentifikasi
Menggunakan yeast dan -glukosidase pada usus tikus (Rat Intestinal), dan -amilase pada
Pankreas babi (procine pancreate). Aktivitas antioksidan dievaluasi Berdasarkan efek
pemulungan radikal pada DPPH dan Radikal hydrogen peroksida serta mengurangi daya uji.
II. BAHAN DAN METODE

A. Bahan kimia

-Glucosidase [(EC 3.2.1.20)] Tipe I: dari Sacharomyces Cereviceae, p-nitrophenyl

-D-glukopiranosida (p-NPG), DMSO, pati larut, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl
(DPPH), quercetin dehidrasi, kalium ferricyanide [K3Fe (CN) 6], asam trikloroasetat,
klorida besi (FeCl3), Hidrogen peroksida, dan gel silika (60-200 mesh Wako gel)
Dibeli dari Wako Pure Chemical Industries, Ltd (Osaka, Jepang). -Glukosidase Tipe
II: aseton intestinal tikus Bubuk (sebagai sumber -glukosidase usus kasar), -Amilase
dari pankreas babi (Tipe VI-B), dan 3,5-dinitro Asam salisilat, diperoleh dari Sigma
Chemical Co. (St.Louis, MO). Semua pelarut yang digunakan dalam penelitian ini
dibeli Dari Wako Pure Chemicals dan suling sebelum digunakan.

B. Metode

1. Prosedur percobaan umum

Nilai rotasi optik diukur dengan Jasco P-2100 Polarimeter Spektrum penyerapan
UV-Vis yang aktif. Senyawa dalam metanol dicatat pada Hitachi U-1600
Spektrofotometer. Spektrum massa dari senyawa tersebut adalah Diukur dengan
resolusi tinggi FAB-MS. Nuklir Spektra resonansi magnetik (NMR) tercatat sebesar
500 MHz untuk1 H dan 125 MHz untuk 13
C pada JEOL JNM-ECA 500 Dengan
TMS sebagai standar internal. HMQC dan HMBC Teknik digunakan untuk
menetapkan korelasi antara 1 H dan 13 Sinyal C Nilai pergeseran kimia () diberikan
pada beberapa bagian Per juta (ppm), dan konstanta kopling (J) di Hz. TLC itu
Berjalan pada pelat pra-dilapisi silika gel 60 F254 (Merck 5554) dan Bintik-bintik
dideteksi dengan sinar UV.

2. Mikroorganisme dan kondisi kultur

A.terreus MC751 diperoleh dari Pusat Penelitian Kimia-Lembaga Ilmu

Pengetahuan Indonesia. Stoknya Kultur A. terreus ditanam di PDA, diinkubasi pada
suhu 25 C Selama tujuh hari. Dua cakram (8mm) jamur miselia digunakan Untuk
menginokulasi 50 mL kalap Czapek-dox (3% sukrosa, 0,2% Natrium nitrat, 0,1%
 K2HPO4, 0,05% magnesium sulfat, 0,05% kalium klorida, dan 0,001% ferrous
sulfat). Setelah 10 hari inkubasi dalam kondisi statis (250C), Kaldu kultur disaring
melalui kertas saring ADVANTEC No.2 untuk memisahkan filtrat dan miselium.
Filtrat (16 L) dikocok dengan etil asetat (EtOAc) pada 250 Rpm selama 20 menit
pada suhu kamar. Ekstraknya disaring Dan dipekatkan dengan evaporator berputar di
bawah vakum pada suhu 400C untuk mendapatkan padatan coklat (2 g).

3. Ekstraksi dan isolasi

Ekstrak EtOAc (1,8 g) dikromatografi pada silica Gel (35 x 30 mm i.d)

menggunakan gradien bertahap dari heksana (90%) dalam EtOAc, ke EtOAc (100%)
dan kemudian EtOAc (30%) dalam Metanol (MeOH) untuk mendapatkan delapan
fraksi (F1-F8) berdasarkan TLC. Inhibitor -Glukosidase dan Uji pemulungan
DPPH radikal bebas- menunjukkan bahwa fraksi 6 (900 mg) adalah Paling aktif
dengan IC50 Masing-masing 30.01 dan 45.27 g / mL, Fraksi 6 selanjutnya
dipisahkan secara berulang pada Kromatografi kolom dengan silika gel
menggunakan elusi bertahap dengan Heksana: EtOAc dan kromatografi lapis
preparatif (PLC) Dengan CHCl3: Aseton (3: 1) untuk ,mendapatkan butyrolactone I
(200 Mg), sebagai padatan lengket kekuningan. Spektrum UV (MeOH) max 307
(log 4.3). [] 22.5 D + 68.333 (c, 0,3 dalam MeOH). HRFABMS: [M + H] + M / z
425.1607, calcd untuk C24H25O7] 13 Derajat tak jenuh. 1H NMR (Aseton-d6)
1.56 (3H,S), 1,64 (3H, s), 3,10 (2H, d, J = 6,8), 3,43 (2H, d, J = 14,8), 3,76 (3H, s),
5,51 (1H, br, J = 7,3), 6,49 (1H, dd, J = 8,0), 6,52 (1H, d, J = 8.0), 6,53 (1H, d, J =
3,4), 6,95 (2H, d, J = 9,0), 7,61 (2H, d, J = 9.0). 13C NMR (Aseton-d6) 170,97 (C-
5), 168,72 (C-1), 158,93 (C-4 '), 154,81 (C-4 "), 139,12 (C-2), 132,48 (C-9 "),
132,36 (C-2"), 130,20 (C-6 'dan C-3'), 129,60 (C-6 "), 122,85 (C-1 '), 128,27 (C-3 "),
124,94 (C-1"), 123,43 (C-8 "), 127,95 (C-3), 116,67 (C-5 'dan C-2'), 115,05 (C-5 "),
86,02 (C-4), 53,76 (OCH3), 39,32 (C-6), 28,62 (C-7 "), 25,95 (C- 10 "), 17,82 (C-
11").

Fisik dan spektral (satu dan dua Dimensi NMR, dan FABMS) karakteristik dari
Senyawa terisolasi bertepatan dengan butyrolactone I (-oxo-- (p-hydroxyphenyl) -
 - (p-hydroxy-m-3.3-Dimethylallylbenzy l) --methoxycarbonyl--butyrlactone I)
Dilaporkan dalam literatur [12] - [15].

4. Uji antidiabetes

I. Yeast inhibitor -glukosidase

Dinilai Sebagai Aktivitas penghambatan untuk -glukosidase yang Dilaporkan

oleh Kim et al. [16] Dengan sedikit modifikasi. Yaitu Campuran reaksi mengandung
250 L dari 3mM p-NPG dan 495 L buffer fosfat 100 mM (pH 7.0) ditambahkan
ke tabung Mengandung 5 L sampel yang dilarutkan dalam DMSO pada berbagai
Konsentrasi (5 sampai 100 g / mL). Campuran reaksi Diinkubasi selama 5 menit
pada suhu 370C, reaksi dimulai dengan Menambahkan 250 l -glukosidase
(0,065units / mL) dan Inkubasi dilanjutkan selama 15 menit. Reaksi itu Dihentikan
dengan menambahkan 1mL 0,2 M Na2CO3. Penghambat Efek pada aktivitas -
glukosidase ditentukan dengan pengukuran Jumlah p-nitrophenol dilepaskan pada
400 nm. Individu Kosong untuk sampel uji disiapkan untuk memperbaiki latar
belakang Absorbansi dimana enzim diganti dengan 250 L Buffer fosfat. Semua uji
dilakukan dengan 3 kali replikasi.

II. Uji penghambat -glukosidase tikus

Aktivitas penghambatan terhadap -glukosidase tikus Diuji seperti yang

dijelaskan oleh Sancheti dkk. [17] dengan Sedikit modifikasi: 0,5 gram Bubuk
aseton intestinal tikus disuspensikan dalam 10 mL garam 0,9% (100: 1 b / v), Dan
suspensinya disahkan dua belas kali selama 30 detik pada suhu 40C (tepat). Setelah
sentrifugasi (1000 g, 30 menit, 40C), Supernatan digunakan untuk pengujian. Lima
microlitres Larutan sampel (50-200 g / mL) diinkubasi dengan 595 L buffer fosfat
(pH 7.0) 0,1 M, dan 250 L dari 5 mM Larutan p-NPG dalam buffer fosfat (pH 7.0)
0,1 M. Setelah pra-Inkubasi pada 370C selama 5 menit, ditambahkan 150 L Larutan
-glukosidase usus tikus. Reaksi itu kemudian Diakhiri dengan penambahan 1mL
0,2 M Na2CO3. Pembacaan absorbansi dicatat pada 400 nm. Larutan blanko untuk
sampel uji disiapkan untuk mengoreksi Absorbansi, dimana enzim diganti dengan
150 L Buffer fosfat. Semua uji dilakukan dengan tiga replikasi.
III. Uji inhibitor -amilase pankreas

Pengujian dilakukan menurut Gowri, dkk. [18] dengan Singkat, 40 L sampel uji
(50-200 g / mL) dan 160 L dari 20 mM Buffer fosfat (pH 6,9) mengandung
natrium Klorida 6,7 mM diinkubasi dengan 200 L -Amilase pankreas (0,5 mg /
mL disiapkan dalam air suling dingin) untuk 5 menit. Reaksi dimulai dengan
menambahkan 400 L Larutan pati kentang terlarut (0,5% b / v dalam buffer 20
mM). Tepat 3 menit kemudian, 400 L reagen warna DNS ditambahkan. Campuran
reaksi kemudian diinkubasi dalam bak air (85-900C) selama 10 menit untuk
mengembangkan warna, dan didinginkan pada suhu kamar. Selanjutnya, 500 L
campuran reaksi diencerkan Dengan 1750 L air suling, dan absorbansi Diukur pada
540 nm. Larutan blanko untuk sampel uji disiapkan untuk mengoreksi Absorbansi.
Semua uji dilakukan dengan tiga replikasi. Penghambatan persentase -glukosidase
dan -amilase Dinilai dengan menggunakan rumus berikut:% Inhibition = [1-(As /
A0)] x 100, di mana A0 adalah absorbansi control Reaksi dan As absorbansi dengan
adanya sampel. Nilai IC50 dihitung dari Nilai mean hambat dengan menerapkan
analisis regresi logaritmik.

IV. Penentuan pola penghambatan pada -glukosidase

Untuk mengevaluasi jenis penghambatan terhadap konsentrasi ragi -

Glukosidase, p-NPG yang semakin tinggi Digunakan substrat sebagai ada atau
tidaknya Butyrolactone I. Jenis penghambatan ditentukan dari Lineweaver-Burke
plot.
 III. HASIL DAN PEMBAHASAN

B. Uji antidiabetes

Dalam penelitian ini, aktivitas antidiabetes ekstrak Dan butyrolactone I dievaluasi

menggunakan -glukosidase dari Dua sumber yang berbeda (ragi dan usus tikus) dan -
Amylase inhibition assay. Untuk pengujian umum inhibitor -Glucosidase, enzim ragi dari
S. cereviceae Dikategorikan sebagai -glukosidase tipe I [18] Dipilih Itu Ekstrak A.
terreus dan butirolakton I menunjukkan Aktivitas penghambatan - glukosidase kuat
dengan IC50 masing-masing, 37,01 dan 22,86 g / mL (atau 54M). Namun, quercetin
menunjukkan Penghambatan terkuat dengan IC50 14,6 M pada Tabel I. Butyrolactone I
memiliki efek yang jauh lebih besar dari pada Ekstrak, oleh karena itu dapat diasumsikan
bahwa itu adalah senyawa Bertanggung jawab atas aktivitas ekstrak A. terreus MC751.
Namun, ekstrak, butyrolactone I, dan quercetin Semua ditampilkan secara signifikan
kurang efek pada -Glukosidase usus dibanding -glukosidase ragi seperti pada Gambar.
2. Kebanyakan Melaporkan bahwa penghambat -glukosidase ragi tidak Menunjukkan
aktivitas melawan -glukosidase mamalia akibat Perbedaan dalam pengakuan molekuler
dari target-binding Situs enzim [21]. Adanya Kelompok hidroksil fenolik diasumsikan
berkontribusi terhadap efek penghambatan Butyrolactone I [4], [22] - [24] apalagi,
kehadiran -butyrolakton juga berperan, karena aktivitas -Lactone menghambat sintesis
asam lemak dan mengurangi jaringan adipose [25].
 Pola efek butirolakton pada -Glukosidase ragi, diperkirakan menggunakan plot
Lineweaver-Burke dan dengan penghambatan Konsisten tipe campuran pada Gambar. 3.
nilai Ki (Konstanta penghambatan) butirolaktonasa I adalah 55 M, Ditentukan dari plot
Dixon. Campuran tipe campuran itu Ditandai dengan kombinasi yang kompetitif dan
Hambatan non kompetitif [22] yang menunjukkan bahwa Butyrolactone I mengikat ke
situs selain situs aktif dari Enzim dan menggabungkan dengan baik enzim bebas atau
enzim Kompleks substrat, mungkin mengganggu tindakan Keduanya [3]. Mekanisme
penghambatan butyrolactone I adalah Mirip dengan kuersetin [5], [23].

Pada uji pankreas pankreas -amilase, kedua Sampel (ekstrak dan butirolakton I) dan
kuersetin sebagai Referensi menunjukkan aktivitas penghambatan rendah pada Gambar. 2.
-amilase pankreas adalah enzim utama dalam sistem pencernaan, Mengkatalisis langkah
awal hidrolisis pati menjadi Campuran oligosakarida yang lebih kecil, yang selanjutnya
Terdegradasi oleh -glukosidase menjadi glukosa yang pada penyerapan Memasuki aliran
darah [18]. Penghambat alami, yang memiliki Telah ditunjukkan untuk menghambat
aktivitas -amilase secara lemah dan Aktivitas - glukosidase dengan kuat, dapat
menawarkan terapi yang lebih baik Pilihan untuk mengendalikan hiperglikemia
postprandial dengan Efek samping sedikit [18], [21]. Oleh karena itu, penghambatan -
Glukosidase tampaknya menjadi cara yang lebih efektif untuk mengendalikan Pelepasan
glukosa dari disakarida di usus dari pada -Amilase [18].