Liquid Chromatography Mass Spectrofotometry (LC-MS)

I. Pendahuluan
Kekuatan pemisahan kromatografi modern yang dikombinasikan
dengan selektifitas dan batas deteksi yang sangat rendah dari spektrometer
massa modern memungkinkan untuk menganalisis sampel yang sangat
kompleks dengan tingkat kepercayaan yang tinggi (Linscheid 1994)
Kromatografi cair adalah teknik pemisahan mendasar di bidang ilmu
pengetahuan dan bidang terkait kimia. Tidak seperti kromatografi gas, yang
tidak cocok untuk nonvolatil dan molekul termal rapuh, kromatografi cair
dengan aman dapat memisahkan rentang yang sangat luas dari senyawa
organik juga metabolit obat molekul kecil untuk peptida dan protein (Agilent
2001).
Detektor tradisional untuk kromatografi cair meliputi indeks bias,
elektrokimia, fluoresensi, dan detektor ultraviolet-tampak (UV-Vis).
Beberapa diantaranya menghasilkan data dua dimensi, yaitu data yang
mewakili kekuatan sinyal sebagai fungsi waktu. Lainnya, termasuk
fluoresensi dan detektor UV-Vis diodearray, menghasilkan data tiga-dimensi.
Data tiga dimensi tidak hanya mencakup kekuatan sinyal namun data spektral
untuk setiap titik waktu (Agilent 2001).
Spektrometer massa juga menghasilkan data tiga dimensi. Selain
kekuatan sinyal, juga menghasilkan data spektral massa yang dapat
memberikan informasi mengenai berat molekul, struktur, identitas, kuantitas,
dan kemurnian sampel. Data spektral massa menambahkan kekhususan yang
meningkatkan kepercayaan terhadap hasil kedua analisis kualitatif dan
kuantitatif (Agilent 2001).
Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS, atau alternatif
HPLC-MS) adalah teknik kimia analitik yang menggabungkan kemampuan
pemisahan fisik dari kromatografi cair (atau HPLC) dengan kemampuan
analisis massa spektrometer massa. LC-MS adalah teknik yang banyak
digunakan untuk berbagai aplikasi yang memiliki sensitifitas dan spesifisitas
sangat tinggi. Pada umumnya aplikasinya berorientasi pada deteksi dan

1
identifikasi potensi spesifik bahan kimia terhadap kehadiran bahan kimia
lainnya (dalam campuran yang kompleks) (Sumbono 2010).
Kombinasi kromatografi cair kinerja tinggi dan spektrometri massa
(LC/MS) memiliki dampak yang signifikan terhadap pengembangan obat
selama dekade terakhir. Perbaikan secara terus menerus dalam teknologi
antarmuka LC/MS dikombinasikan dengan fitur canggih untuk analisis
struktur, kualitatif dan kuantitatif, telah menghasilkan lingkup aplikasi yang
lebih luas (Lee 1999).

II. Pembahasan
Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LC-MS) adalah teknik
analisis yang menggabungkan kemampuan pemisahan fisik dari kromatografi
cair dengan spesifisitas deteksi spektrometri massa. Kromatografi cair
memisahkan komponen-komponen sampel dan kemudian ion bermuatan
dideteksi oleh spektrometer massa. Data LC-MS dapat digunakan untuk
memberikan informasi tentang berat molekul, struktur, identitas dan kuantitas
komponen sampel tertentu (Agilent 1998).
Keuntungan dari LC-MS yaitu dapat menganalisis lebih luas berbagai
komponen, seperti senyawa termal labil, polaritas tinggi atau bermassa
molekul tinggi, bahkan juga protein. Senyawa dipisahkan atas dasar interaksi
relatif dengan lapisan kimia partikel-partikel (fase diam) dan elusi pelarut
melalui kolom (fase gerak). Komponen elusi dari kolom kromatografi
kemudian diteruskan ke spektrometer massa melalui antarmuka khusus
(Gates 2005).

2
 Gambar 1 Antarmuka LC-MS dengan ionisasi elektrospray spektrometer
massa (Scripp 2014)

A. Instrumen LC-MS
1. HPLC
Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit
berdasarkan kepolarannya, alatnya terdiri atas kolom (sebagai fasa diam) dan
larutan tertentu sebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC
dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi
untuk mendorong fasa gerak. Campuran analit akan terpisah berdasarkan
kepolarannya dan kecepatannya untuk sampai ke detektor (waktu retensinya)
akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya
terpisah (Himawan 2010).
Dengan bantuan pompa fasa gerak cair dialirkan melalui kolom ke
detektor. Cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara
penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen
campuran, karena perbedaan kekuatan interaksi antara larutan terhadap fasa
diam. Larutan yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar
dari kolom lebih dulu. Sebaliknya, larutan yang kuat berinteraksi dengan fasa
diam maka larutan tersebut akan keluar kolom, kemudian dideteksi oleh
detektor dan direkam dalam bentuk kromatogram (Isnawati 2013).

3
2. Sumber ion
Beberapa sumber ion yang digunakan dalam LC-MS dalam Scripp
2014 yaitu :
Ionisasi elektrospray (ESI)
Ionisasi elektrospray (ESI) adalah metode yang digunakan untuk
analisis peptida, protein, karbohidrat, oligonukleotida kecil, polimer sintetis,
dan lipid. ESI menghasilkan molekul gas terionisasi langsung dari larutan cair
yang menghasilkan semprotan tetesan (droplet) dalam medan listrik. Sampel
larutan disemprotkan dari daerah medan listrik yang kuat di ujung jarum
logam yang dipertahankan pada potensial 700 V sampai 5000 V. Jarum
berfungsi untuk membuat larutan menjadi droplet saat disemprotkan. Gas
kering dan panas, atau keduanya diterapkan pada droplet pada tekanan
atmosfer sehingga menyebabkan pelarut menguap dari setiap droplet. Sebagai
ukuran menurunnya tetesan droplet dilihat dari densitas muatan pada
permukaannya yang meningkat. Tolakan kolom timbal balik antara muatan
dipermukaan menjadi lebih besar sehingga melebihi kekuatan tegangan
permukaan, dan ion dikeluarkan dari droplet melalui Taylor cone (Gambar 2).
Kemungkinan lain yaitu droplet meledak dan kemudian melepaskan ion.
Dalam kedua kasus tersebut, ion-ion yang muncul diarahkan ke dalam lubang
melalui lensa elektrostatik yang mengarah ke vakum dari analisis massa.
Karena ESI melibatkan pergerakan terus menerus dari larutan, sehingga
cocok untuk menggunakan ESI sebagai antarmuka dengan HPLC atau
elektroforesis kapiler .
Ionisasi elektrospray kondusif untuk pembentukan molekul kecil
bermuatan tunggal, tetapi dapat juga untuk molekul bermuatan banyak dari
molekul yang lebih besar, hal ini karena spektrometer massa mengukur rasio
massa terhadap muatan (m/z) sehingga memungkinkan untuk mengamati
molekul yang sangat besar dengan rentang massa yang relatif kecil.
Pelarut yang digunakan dalam ESI dipilih berdasarkan kelarutan
senyawa, volatilitas pelarut dan kemampuan pelarut untuk menyumbangkan
proton. Pelarut utama protik yang biasa digunakan yaitu metanol (50/50,
metanol/air) atau asetonitril (50/50, acetonitrile/H2O), sedangkan untuk

4
pelarut pendukung aprotik digunakan 10% DMSO dalam air, serta isopropil
alkohol untuk meningkatkan kelarutan beberapa senyawa. Bila 100% air
digunakan di ESI, tekanan uap air yang relatif rendah memiliki efek yang
merugikan pada sensitifitas, sensitifitas yang baik diperoleh ketika
menggunakan pelarut organik yang mudah menguap. Beberapa senyawa
memerlukan penggunaan kloroform dengan 0,1% asam format untuk
memudahkan ionisasi.
Buffer seperti Na+, K+, fosfat, dan garam dapat menurunkan tekanan
uap droplet sehingga mengurangi sinyal melalui peningkatan tetesan tegangan
permukaan yang mengakibatkan penurunan volatilitas. Buffer yang mudah
menguap seperti amonium asetat dapat digunakan secara lebih efektif.

Tabel 1 Keuntungan dan Kerugian dari ESI

Keuntungan Kekurangan
Rentang massa praktis hingga Adanya garam-garam dan agen
70.000 Da pasangan ion seperti TFA dapat
mengurangi snsitifitas
Sensifitas yang baik dengan Campuran kompleks dapat
femtomol untuk sensitifitas mengurangi sensitifitas
pikomol tipikal rendah
Metode ionisasi paling lembut, Analisis campuran simultan bisa
mampu menghasilkan kompleks menjadi rendah
nonkovalen dalam fase gas
Mudah beradaptasi dengan Beberapa pengisian dapat
kromatografi cair membingungkan terutama dalam
analisis campuran
Mudah beradaptasi dengan Kemurnian sampel sangat
tandem analisis massa seperti penting
perangkap ion dan instrument
quadrupole tiga
Beberapa pengisian Carryover dari sampel ke sampel
memungkinkan untuk analisis ion
massa yang tinggi dengan kisaran
instrument m/z relatif rendah
Tidak ada gangguan matrik

5
 Gambar 2 Ionisasi elektrospray spektrometer massa

Ionisasi nanoelektrospray (nanoESI)

Elektrospray aliran rendah disebut juga nanoelektrospray (nanoESI)
adalah variasi pada ESI, dimana jarum semprot dibuat sangat kecil dan
diposisikan dekat dengan pintu masuk ke analisis massa sehingga jumlah
sampel yang dibutuhkan menjadi sedikit.
Laju alir untuk sumber nanoESI berkisar puluhan hingga ratusan
nanoliter per menit. Untuk mendapatkan aliran rendah, nanoESI
menggunakan penghasil emisi dan dalam beberapa kasus menggunakan
metalisasi kaca atau leburan silika yang memiliki lubang kecil (~5). Sampel
terlarut ditambahkan ke emitor dan tekanan ~30 PSI diterapkan ke belakang
emitor. Curahan sampel pada laju aliran yang sangat rendah memungkinkan
untuk sensitifitas tinggi. Emiter diposisikan sangat dekat dengan pintu masuk
analisis massa, karena itu transmisi ion ke analisis massa jauh lebih efisien.
Selain itu, karena droplet biasanya lebih kecil dengan nanoESI daripada ESI
normal, jumlah penguapan yang diperlukan untuk memperoleh pembentukan
ion jauh lebih sedikit, sehingga nanoESI lebih toleran terhadap garam dan
kotoran lainnya. Kurangnya penguapan pada nanoESI menyebabkan kotoran
tidak terkonsentrasi turun sebanyak pada ESI .

6
 Gambar 3 Pembentukan ion dari sumber ionisasi elektrospray

Ionisasi kimia tekanan atmosfer (APCI)

APCI menjadi sumber ionisasi penting karena menghasilkan ion
langsung dari larutan dan mampu menganalisis senyawa yang relatif
nonpolar. Sama seperti elektrospray, efluen cair dari APCI dimasukkan
langsung ke sumber ionisasi, tetapi droplet tidak bermuatan dan sumber APCI
berisi pemanas uap dapat mempercepat desolvasi/penguapan dari tetesan.
Molekul sampel menguap dalam wilayah reaksi molekul ion pada tekanan
atmosfer.

Gambar 4 Ionisasi kimia tekanan atmosfer (APCI) spektrometer massa

Ionisasi APCI berasal dari pelarut yang terionisasi dari korona tidak
bermuatan. Ion pelarut berada pada kondisi tekanan atmosfer, maka ionisasi
kimia molekul analit sangat efisien. Pada molekul analit tekanan atmosfer
sering bertabrakan dengan ion pereaksi, sehingga transfer proton (untuk
protonasi reaksi MH+) terjadi dalam muatan positif, dan transfer elektron

7
atau kehilangan proton ([M-H]-) terjadi dalam muatan negatif. Pengaruh
kelompok pelarut pada ion pereaksi dan tekanan gas yang tinggi, dapat
mengurangi fragmentasi selama ionisasi dan menghasilkan ion molekul yang
utuh.

Fotoionisasi tekanan atmosfer (APPI)

Fotoionisasi tekanan atmosfer (APPI) menjadi sumber ionisasi penting
karena menghasilkan ion langsung dari larutan dengan latar belakang relatif
rendah dan mampu menganalisis senyawa yang relatif nonpolar. Sama
dengan APCI, efluen cair dari APPI dimasukkan langsung ke sumber ionisasi.
Perbedaan utama antara APCI dan APPI yaitu pada APPI sampel menguap
melewati sinar ultra-violet (sumber cahaya kripton dipancarkan pada 10,0 eV
dan 10,6 eV). APPI lebih sensitif dibandingkan dengan ESI atau APCI, sebab
memiliki rasio sinyal kebisingan yang lebih rendah karena ionisasi latar
belakang. Sinyal latar belakang yang lebih rendah disebabkan tingginya
potensial ionisasi pelarut standar seperti metanol dan air (masing-masing, IP
10.85 dan 12.62 eV) yang tidak terionisasi oleh lampu kripton.

Gambar 5 Fotoionisasi tekanan atmosfer (APCI) spektrometer massa

Kelemahan dari ESI dan APCI yaitu dapat menghasilkan ion latar
belakang dari pelarut. Selain itu, ESI sangat rentan terhadap efek supresi ion,
dan APCI membutuhkan suhu penguapan berkisar 350-500 C, yang dapat
menyebabkan degradasi termal.
Ionisasi induksi APPI melalui dua mekanisme yang berbeda. Yang
pertama adalah fotoeksitasi langsung, memungkinkan untuk ejeksi elektron

8
dan ion kation radikal positif (M+). Sumber APPI menggunakan energi
cahaya yang lebih tinggi dari potensi ionisasi (IP) dari sebagian besar molekul
target, tetapi lebih rendah dari sebagian besar IP udara dan molekul pelarut,
sehingga menghilangkan pengganggu. Selain itu, karena sedikit kelebihan
energi disimpan dalam molekul sehingga terjadi fragmentasi minimal.
Mekanisme kedua yaitu fotoinduksi ionisasi kimia tekanan atmosfer yang
mirip dengan APCI melibatkan transfer muatan untuk menghasilkan
protonasi (MH+) atau kehilangan proton ([M-H]-) untuk menghasilkan ion
negatif.
Untuk memulai ionisasi kimia, pereaksi fotoionisasi (dopan)
ditambahkan ke eluan. Setelah fotoionisasi dari dopan, transfer muatan terjadi
pada analit. Dopan untuk muatan positif meliputi aseton dan toluena, tetapi
aseton juga dapat berfungsi sebagai dopan untuk muatan negatif. Mekanisme
ionisasi (M+ vs [M+H]+) molekul tergantung pada afinitas proton dari analit,
pelarut, dan jenis dopan yang digunakan.

Matrik dibantu laser desorpsi/ionisasi (MALDI)

Matrix dibantu laser desorpsi/ionisasi spektrometer massa (MALDI-
MS) merupakan alat analisis untuk peptida, protein, dan sebagian besar
biomolekul lainnya (oligonukleotida, karbohidrat, produk alami, dan lipid).
Transfer energi yang efisien dan diarahkan selama desorpsi matrik dibantu
induksi laser memberikan hasil ion yang tinggi untuk analit utuh dan
memungkinkan untuk pengukuran senyawa dengan sensitifitas sampai sub
pikomol, dapat juga untuk analisis sampel heterogen biologis kompleks
seperti mencerna proteolitik.
Dalam analisis MALDI, matriks memainkan peran kunci dalam teknik
ini. Matriks MALDI berupa bahan padat nonvolatil yang memfasilitasi proses
desorpsi dan ionisasi dengan menyerap radiasi laser, sehingga matriks dan
sampel tertanam dalam matriks menguap. Matriks juga berfungsi untuk
meminimalkan kerusakan sampel dari radiasi laser dengan menyerap
sebagian besar energi biasa..

9
 Gambar 6 Transfer energi pada MALDI

Mekanisme desorpsi/ionisasi yang tepat untuk MALDI belum

diketahui, tetapi dipercaya bahwa MALDI menyebabkan ionisasi dan transfer
sampel dari fase terkondensasi ke fase gas melalui eksitasi laser sampel
matriks (Gambar 6). Analit pertama terkristalisasi dari kelebihan molar
senyawa matriks yang biasanya berupa asam organik lemah yang menyerap
UV. Molekul-molekul sampel terkristalisasi juga menguap, tetapi tidak
langsung menyerap energi dari laser.
Setelah dalam fase gas, molekul bermuatan yang terdesorbsi
kemudian diarahkan elektrostatis dari sumber ionisasi MALDI ke analisis
massa. Time-of-flight (TOF) analisis massa sering digunakan untuk
memisahkan ion yang sesuai berdasarkan massa- rasio muatan (m/z) masing-
masing.

Gambar 7 Matriks MALDI

10
Tabel 2 Keuntungan dan kerugian MALDI
Keuntungan
Rentang massa hingga 300.000
Da.
Sensitifitas khas pada femtomol
rendah untuk picomol rendah.
Juga memungkinkan untuk
sensitifitas attomol
Ionisasi lembut dengan sedikit
atau tidak ada fragmentasi
Toleransi garam dalam
konsentrasi milimolar
Cocok untuk analisis senyawa
kompleks
Kerugian
Tidak dapat digunakan pada
senyawa dengan rentang massa di
bawah 700 Da (tergantung bahan
matrik).
Kemungkinan foto-degradasi oleh
desorpsi/ionisasi laser
Matriks asam yang digunakan
dalam MALDI dapat
menyebabkan degradasi pada
beberapa senyawa.

Pemanfaatan MALDI dalam analisis biomolekul terletak pada

kemampuannya untuk memberikan informasi mengenai berat molekul pada
molekul utuh. Kemampuan untuk menghasilkan informasi yang akurat sangat
berguna untuk identifikasi dan karakterisasi protein.

Desorpsi/ionisasi pada silikon (DIOS)

DIOS adalah metode matriks bebas yang menggunakan getaran laser
desorpsi/ionisasi pada silikon (Gambar 8). Permukaan silikon berupa silikon
berpori atau kawat nano silikon semikonduktor yang menyerap UV dengan
area permukaan besar (ratusan m2/cm3). Untuk aplikasi laser desorpsi/ionisasi
spektrometer massa, struktur silikon terstruktur menggunakan perancah untuk
mempertahankan molekul pelarut dan analit, dan absorptifitas UV memberi
mekanisme untuk transfer energi laser untuk analit. Kombinasi ini
memungkinkan karakteristik DIOS digunakan untuk berbagai macam analisis
biomolekul termasuk peptida, karbohidrat, dan senyawa organik kecil dari
berbagai jenis.

11
 Gambar 8 DIOS menggunakan getaran laser UV dari permukaan silikon
terstruktur untuk menghasilkan ion fase gas utuh

DIOS memiliki banyak kesamaan dengan MALDI. Instrumentasi dan

akuisisi dengan menggunakan DIOS-MS hanya membutuhkan sedikit
penyesuaian dengan pengaturan MALDI, chip hanya ditempelkan pada piring
mesin MALDI dan dimasukkan ke dalam spektrometer. Panjang gelombang
sinar laser yang sama (337 nm) yang digunakan dalam MALDI efektif juga
untuk DIOS. Dalam hal sensitifitas DIOS sebanding dengan MALDI yaitu
memiliki beberapa keuntungan : latar belakang rendah dalam kisaran massa
rendah, deposisi sampel air seragam dan penanganan sampel disederhanakan.
Selain itu, format berbasis chip dapat disesuaikan dengan penanganan sampel
otomatis, dimana laser dapat memindai dari bagian ke bagian lain dalam
DIOS sehingga bisa mempercepat dan mempermudah analisis senyawa
dengan berat molekul rendah.

Atom cepat/ion pemboman (FAB)

Pemboman ion atom cepat (atau FAB), merupakan sumber ionisasi
yang mirip dengan MALDI karena menggunakan matriks dan sinar yang
sangat aktif dari partikel untuk desorpsi ion dari permukaan. Perbedaan antara
MALDI dan FAB yaitu pada MALDI, sinar yang digunakan berupa getaran
sinar laser, sedangkan FAB menggunakan sinar ion kontinyu. Matriks
MALDI biasanya berupa kristal padat, sedangkan FAB biasanya memiliki
matriks cair. FAB 1000 kali lebih sensitif dibandingkan MALDI.

12
 Gambar 9 FAB spektometri massa

Pemboman atom cepat (FAB) adalah sumber ionisasi lunak yang

memerlukan penggunaan probe penyisipan langsung untuk pengenalan
sampel dan atom netral Xe atau ion Cs+ untuk menempelkan sampel dan
matriks dari probe penyisipan permukaan langsung, hal ini untuk mendeteksi
ion matriks dalam spektrum FAB serta ion molekul terprotonasi atau kationik
(yaitu M + Na+) dari analit.
Matriks FAB memfasilitasi proses desorpsi dan ionisasi, matriks FAB
adalah bahan cair mudah menguap yang berfungsi untuk terus-menerus
mengisi permukaan dengan sampel baru seperti dibombardir oleh sinar ion.
Dengan menyerap sebagian besar energi, matriks juga meminimalkan
degradasi sampel dari sinar partikel energi tinggi.
Dua matriks yang paling umum digunakan dalam FAB adalah gliserol
dan m-nitrobenzil alkohol. Atom-atom cepat atau bertabrakan dengan matriks
akan menyebabkan matriks dan analit akan teradsorpsi ke fase gas. Setelah
dalam fase gas, molekul bermuatan dapat mendorong elektrostatis ke analisis
massa.

Ionisasi elektron (EI)

Elektron ionisasi adalah salah satu sumber ionisasi yang paling
penting untuk analisis rutin kecil, hidrofobik, molekul termal stabil dan masih
banyak lagi, karena EI biasanya menghasilkan banyak ion fragmen.

13
 Gambar 11 Ionisasi elektron

Sampel dikirimkan sebagai gas dari probe melalui desorpsi termal,

atau melalui kapiler. Setelah dalam fase gas senyawa masuk ke dalam sumber
ionisasi elektron, dimana elektron merangsang molekul, sehingga
menyebabkan ejeksi ionisasi elektron dan fragmentasi.
Kegunaan ionisasi elektron berkurang secara signifikan untuk
senyawa dengan berat molekul diatas 400 Da karena desorpsi termal yang
diperlukan sampel sering menyebabkan dekomposisi termal sebelum
penguapan dapat terjadi. Masalah utama yang terkait dengan desorpsi termal
dalam ionisasi elektron yaitu ketidakstabilan molekul besar, dekomposisi
termal dan fragmentasi yang berlebihan.
Metode atau mekanisme ejeksi elektron untuk hasil pembentukan ion
positif sebagai berikut:
Sampel termal menguap.
Elektron dikeluarkan dari filamen, dipanaskan dan dipercepat melalui
medan listrik pada 70 V untuk membentuk berkas elektron terus
menerus.
Sampel molekul melewati berkas elektron.
Elektron, yang berisi 70 V dari energi kinetik (70 elektron volt atau 70
eV), mentransfer sebagian energi kinetiknya untuk molekul. Hasil
transfer dalam ionisasi (ejeksi elektron) dengan ion internal biasanya
memiliki kelebihan energi yang tidak lebih dari 6 eV.
M + e- (70 eV) M+ (~5 eV) + 2e- (~65 eV)
Kelebihan energi (6 eV) dalam molekul menyebabkan perubahan
fragmentasi beberapa drajat.

14
 M+ ion molekul + ion fragmen + fragmen netral

Ionisasi kimia (CI)

Ionisasi kimia (CI) diterapkan pada sampel yang sama dengan yang
dianalisis oleh EI dan digunakan untuk meningkatkan kelimpahan ion
molekuler. Ionisasi kimia menggunakan fase gas reaksi ion-molekul dalam
vakum dari spektrometer massa untuk menghasilkan ion dari molekul sampel.
Proses ionisasi kimia dimulai dengan pereaksi gas seperti metana, isobutana
atau amonia, yang terionisasi oleh dampak elektron . Tekanan gas tinggi pada
sumber ionisasi adalah hasil dari reaksi ion-molekul antara pereaksi gas ion
dan pereaksi gas netral. Beberapa produk dari reaksi ion-molekul dapat
bereaksi dengan molekul analit untuk menghasilkan ion .
Mekanisme yang mungkin untuk ionisasi CI yaitu :
Reagen (R) + e- R+ + 2 e
R+ + RH RH+ + R
RH+ + analit (A) AH+ + R
Berbeda dengan EI, analit lebih mungkin untuk memberikan ion
molekul dengan mengurangi fragmentasi menggunakan CI. Namun, sampel
harus termal stabil karena penguapan dalam sumber CI terjadi melalui
pemanasan.

3. Analisis Massa
Ada empat jenis umum dari analisis massa yang dapat digunakan
untuk pemisahan ion dalam spektrometri massa (Chemwiki 2014).
Quadrupole Analisis Massa
Quadrupole adalah analisis massa yang menggunakan medan listrik
untuk memisahkan ion. Quadrupole terdiri atas 4 batang/tiang yang paralel, di
mana batang yang berdekatan memiliki polaritas tegangan yang berlawanan.
Tegangan yang diterapkan pada setiap batang adalah penjumlahan dari
tegangan konstan DC (U) dan frekuensi radio yang bervariasi (Vrfcos (wt)),
dimana w adalah frekuensi sudut dari bidang frekuensi radio. Gaya listrik
pada ion menyebabkan ion berosilasi/orbit di daerah antara 4 batang, di mana
jari-jari orbit tetap konstan.

15
 Gambar 12 Quadrupole Analisis Massa

Pergerakan ion dalam gerakan yang sangat kompleks berbanding lurus

dengan massa ion, tegangan pada quadrupole, dan frekuensi radio. Ion-ion
akan tetap mengorbit di daerah antara kutub tanpa terjemahan sepanjang
kutub kecuali ion memiliki kecepatan konstan yang dibuat sebagai ion yang
memasuki quadrupole tersebut. Sebelum memasuki analisis, ion melewati
potensi tegangan tertentu (biasanya dibuat oleh elektroda cincin) untuk
memberikan ion kecepatan konstan sehingga dapat melintang di sepanjang
pusat quadrupole tersebut.
Sementara di quadrupole, lintasan ion berubah sedikit berdasarkan
massanya. Ion massa tertentu memiliki frekuensi tertentu dimana semakin
besar massa, semakin besar frekuensinya.

TOF (Time of Flight) Analisis Massa

Prinsip-prinsip dasar analisis massal menggunakan TOF analisis
massa relatif mudah jika dibandingkan dengan banyak perangkat analisis
massa lainnya dimana ion diambil (atau diproduksi) dalam ledakan singkat
atau paket dalam sumber ion dan dikenakan tegangan percepatan. Ion
kemudian melayang atau terbang dimana kecepatan ion tergantung pada
massa (m) dan muatan (z). Analisis massa ini berguna karena semua ion yang
dideteksi (hampir) bersamaan dapat memindai rentang massa semua ion
dengan sangat cepat, menyebabkan sensitifitas pada instrumen juga
meningkat.

16
 Quadrupole Ion Perangkap Analisis Massa
Analisis ini menggunakan prinsip yang sama seperti analisis
quadrupole dengan menggunakan medan listrik untuk pemisahan ion.
Spektrometer massa perangkap ion bekerja berdasarkan kekuatan ion dalam
perangkap, dan memanipulasi ion dengan menggunakan tegangan konstan
dan bidang retensi. Amplitudo tegangan yang diterapkan memungkinkan
analisis massa perangkap ion membuat ion terperangkap pada perangkat
analisis, dimana ion yang tidak terseleksi diberikan lintasan oleh medan
elektrostatik yang menyebabkan mereka untuk keluar dari perangkap dengan
mengisi perangkap dengan fragmentasi gas inert dari ion yang dipilih
sehingga ini berguna ketika informasi struktural diperlukan.
Sistem memiliki kemampuan yang unik yaitu memindai beberapa
produk ion yang sensitif dengan sangat baik. Spektrum yang diperoleh
dengan analisis massa perangkap ion mungkin berbeda secara signifikan
karena diperoleh dari sistem quadrupole tiga dimana terjadi tabrakan energi
atau gas dalam sistem.

Ion Cyclotron Resonance (ICR)

ICR adalah perangkap ion yang menggunakan medan magnet untuk
menangkap ion ke dalam orbit di dalamnya. Dalam analisis ini tidak ada
pemisahan yang terjadi karena tidak semua ion dapat terjebak di dalam
sehingga medan listrik eksternal diterapkan untuk membantu menghasilkan
sinyal .
Frekuensi orbit tergantung pada muatan dan massa ion, bukan dari
kecepatan. Jika medan magnet tetap konstan, muatan untuk rasio massa dari
masing-masing ion dapat ditentukan dengan mengukur kecepatan sudut.
Muatan dari ion-ion yang berlawanan memiliki kecepatan sudut yang sama,
yang membedakan hanyalah mengorbit dalam arah yang berlawanan.
Dalam orbit energi tinggi, seperti ion yang berosilasi antara dua
piring, elektron menumpuk di salah satu piring atas yang lain dan mendorong
arus untuk berosilasi, berbanding lurus dengan jumlah ion dalam sel pada
frekuensi tertentu.

17
 Fourier Transform ICR (FT-ICR), digunakan untuk diferensial sinyal
yang dijumlahkan untuk menghasilkan hasil yang diinginkan.

4. Detektor
Setelah ion keluar dari analisis massa, ion tersebut harus dideteksi dan
diubah menjadi sinyal yang dapat digunakan. Detektor merupakan elemen
penting dari spektrometer massa yang menghasilkan sinyal dari ion dengan
menghasilkan elektron sekunder, yang selanjutnya diperkuat dengan
menginduksi arus (dihasilkan dengan memindahkan beban).
Sistem detektor ion terbagi dalam dua kelas utama :
1. Detektor titik: ion tidak spasial diselesaikan dan berurutan menimpa
detektor yang terletak pada satu titik dalam geometri spektrometer.

Gambar 13 Detektor titik

2. Detektor array: ion secara spasial diselesaikan dan semua ion tiba secara
bersamaan (simultan atau dekat) dan dicatat di sepanjang pesawat
menggunakan bank detektor.

Gambar 14 Detektor array

18
B. Cara Kerja LC-MS
Cara kerja kromatografi cair adalah sama dengan HPLC atau
kromatografi cair lainnya. Sedangkan cara kerja spektrometer massa
menggunakan metode ESI (Wibowo 2011) adalah sebagai berikut :

Gambar 15 Proses pemisahan analit pada kromatografi cair sampai dengan

penyemprotan (penyemprotan oleh spray needle tip)

1. Analit bersama dengan eluen dari syringe pump atau LC masuk ke dalam
kapilari.
Di dalam kapilari terdapat anoda (kutup negatif) pada Taylor cone dan
katoda (kutup negatif) didekat masukkan analit dan eluen. Kutup ini berfungsi
agar muatan yang berkumpul pada Taylor cone adalah muatan positif
sehingga nantinya saat terjadi penyemprotan dan terbentuk droplet (tetes
tetes) tidak bergabung menjadi droplet yang lebih besar lagi.
2. Analit dan solven (eluen) disemprotkan (spray) melalui Taylor cone.
Akan terbentuk dropletdroplet yang akan mengalami tahap evaporasi
solven untuk mengurangi solven yang menempel di analit.

19
3. Droplet yang mengalami ledakan kolom tersebut akan masuk ke dalam
cone dimana di sisi kiri dan kanannya sudah mengalir gas Nitrogen (N2).
Gas ini berfungsi agar analit yang terjadi stabil dalam bentuknya dan
tidak terganggu oleh pengaruh gas oksigen. Droplet tersebut ditransfer
melalui lubang kapiler untuk dianalisis menggunakan spectrometer
massa.

Gambar 16 Proses setelah analit dipisahkan oleh Liquid Chromatography

Analit yang terikut dalam eluen masuk ke dalam jarum

penyemprot/kapiler, kemudian eluen bersama analit disemprotkan menjadi
bentuk tetes-tetes (droplet). Tetes-tetes tersebut masuk ke dalam
counterelectrode (biru). Tetesan masuk melalui kapiler transfer kemudian
menuju spektrometer massa.
Pada jarum kapiler terdapat Taylor cone dimana daerah tersebut
bermuatan negatif sehingga analit dalam solven yang memiliki muatan positif
akan berkumpul di daerah Taylor cone, pada saat terjadi penyemprotan,
tetesan-tetesan (droplet) permukaannya memiliki muatan positif.
Droplet mengalami evaporasi solven, akibatnya droplet menyusut
sampai titik dimana tegangan permukaan pada droplet tidak dapat menopang
muatan dipermukaannya sehingga terjadi perpecahan dalam droplet tersebut
yang disebut coulombic ledakan menjadi bagian-bagian, dimana bagian-
bagian tersebut antara lain :
a. Analit dengan satu muatan dan beberapa muatan (analit ion)
b. Satu analit bersama solven yang diliputi oleh muatan positif

20
c. Beberapa analit bersama beberapa molekul solven dan diliputi oleh
beberapa muatan positif.

Gambar 17 Proses droplet berubah menjadi analit

Muatan positif pada solven biasanya ditambahkan dari ion-ion Na+,

Li+, K+, NH4+ dan kationik lainnya. Akibatnya pada spektra sering terjadi
penambahan berat molekul ion-ion tersebut disamping penambahan berat
molekul solven. Ion harus dibuat bermuatan positif agar masing-masing
tetesan (droplet) tidak saling menempel lagi (membentuk tetesan yang lebih
besar). Tetesan (droplet) dapat bermuatan positif atau negatif tergantung dari
daya yang ditempelkan pada kapilari. Untuk ion negatif digunakan Cl-.

C. Aplikasi LC-MS
a. Bidang farmasi
Identifikasi benzodiazepin
Identifikasi metabolisme asam empedu
b. Bidang biokimia
Identifikasi protein
c. Bidang klinik
Deteksi sensitifitas trimipramin dan thioridazine dalam sampel urin

21
d. Bidang makanan
Identifikasi aflatoksin dalam makanan
Determinasi vitamin D3 dalam suplemen pakan ternak
e. Bidang lingkungan
Deteksi herbisida fenil urea
Deteksi rendahnya tingkat karbaril dalam makanan

III. Kesimpulan
Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LC-MS) merupakan
teknik analisis yang menggabungkan kemampuan pemisahan fisik dari
kromatografi cair dengan spesifisitas deteksi spektrometri massa.
LC-MS dapat digunakan untuk memberikan informasi tentang berat
molekul, struktur, identitas dan kuantitas komponen sampel tertentu.
LC-MS yaitu dapat menganalisis lebih luas berbagai komponen,
seperti senyawa termal labil, polaritas tinggi atau bermassa molekul tinggi,
bahkan juga protein. Senyawa dipisahkan atas dasar interaksi relatif dengan
lapisan kimia partikel-partikel (fase diam) dan elusi pelarut melalui kolom
(fase gerak). Komponen elusi dari kolom kromatografi kemudian diteruskan
ke spektrometer massa melalui antarmuka khusus untuk kemudian
diidentifikasi oleh spektrometer massa.

22
 Daftar Pustaka

Agilent. 1998. Basic of LC/MS. www.chem.agilent.comlibrary...a05296.pdf

diakses pada tanggal 01 Maret 2014.
Agilent. 2001. Basic of LC/MS.
http://www.chem.pitt.eduwipfAgilent%20LC-MS%20primer.pdf.
diakses pada tanggal 01 Maret 2014.
Chemwiki. 2014. Mass Analyzer (Mass Spectrometry).
http://chemwiki.ucdavis.edu/Analytical_Chemistry/Instrumental_Anal
ysis/Mass_Spectrometry/Mass_Spectrometers_%28Instrumentation%
29/Mass_Analyzers_%28Mass_Spectrometry%29 diakses pada
tanggal 10 Maret 2014
Gates P.. 2005. High Performance Liquid Chromatography Mass
Spectrometry (HPLC/MS).
http://www.bris.ac.uk/nerclsmsf/techniques/hplcms.html diakses pada
tanggal 01 Maret 2014
Himawan R. F.. 2010. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT).
http://rafaeljosephhimawan.blogspot.com/2010/04/kromatografi-cair-
kinerja-tinggi-kckt.html diakses pada tanggal 03 Maret 2014.
Isnawati R.. 2013. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC).
http://yi2ncokiyute.blogspot.com/2013/02/kromatografi-cair-kinerja-
tinggi-hplc.html diakses pada tanggal 03 Maret 2013.
Lee M. S., Kerns E. H.. 1999. LC/MS applications in drugs development.
Mass Spectrometry Reviews 18 (3-4): 187-279.
Linscheid M. & Westmoreland D. G.. 1994. Applications of Liquid
Chromatography-Mass Spectrometry. Pure & Appl. Chem. Vol 66 No.
9 pp. 1913-1930.
Scrip. 2014. Mass Spectrometry.
http://masspec.scripps.edu/mshistory/whatisms_details.php diakses
pada tanggal 03 Maret 2014

23
Sumbono A.. 2010. Kromatografi Cair Spektrometri Massa.
http://ecimansorong.blogspot.com/2010/05/normal-0-false-false-false-
en-us-x-none.html, diakses pada tanggal 01 Maret 2014
Wibowo A.E.. 2011. LC-MS (Liquid Chromatograpy-Mass Spectroscopy).
http://ithengcemani.blog.ugm.ac.id/2010/12/04/liquid-cromathograpy-
mass-spectroscopy-with-electrospray-ionization-methode-lc-ms-esi-2/
diakses pada tanggal 08 Maret 2014

24