ISBN No.

978-602-98559-1-3 Prosiding SNSMAIP III-2012

ISOLASI DAN KARAKTERISASI Bacillus sp. PENGHASIL

ANTIMIKROBA DARI SALURAN PENCERNAAN AYAM
KAMPUNG (Gallus domesticus)
1* 1 1 2
Sumardi , Christina Nugroho Ekowati , Kusuma Handayani , dan Nurhayati
1
Jurusan Biologi FMIPA Unila, Jl. S. Brojonegoro No.1, B. Lampung 35145
2
Alumni Jurusan Biologi FMIPA Universitas Lampung

Penulis untuk korespondensi, HP 085216391087 email: sumardi_bio@yahoo.co.id

ABSTRAK

Bacillus sp. memiliki kemampuan untuk hidup dan berkembang dalam usus ternak. Tujuan
dari penelitian ini adalah untuk mencari isolat dan karakter Bacillus sp yang memiliki
kemampuan menghasilkan antimikroba. Dari hasil penelitian diperoleh dua isolat Bacillus
sp. yaitu Bacillus sp.A1 dan Bacillus sp.A2. Kedua isolat bakteri tersebut memiliki
kemampuan menghambat pertumbuhan bakteri patogen Streptococcus, Klebsiella
pneumonia, Vibrio cholera dan Escherichia coli. Kedua isolat bakteri bersifat Gram positif,
mesofil, neutrofil, menghasilkan spora oval yang letaknya di tengah, mampu menfermentasi
gula seperti glokosa, galaktosa, fruktosa dan sukrosa, serta mampu menghasilkan enzim
katalase. Dari hasil karakterisasi berat molekul protein menggunakan SDS-PAGE terbentuk
6 pita protein yang berat molekulnya 30 KDa, 45 KDa, 60 KDa, 105 KDa, 143 KDa dan 165
KDa.
Kata Kunci: isolasi, Bacillus, karakterisasi, ayam kampung, SDS-PAGE

1. PENDAHULUAN 2. METODE PENELITIAN

Ayam kampung lebih tahan terhadap
penyakit dibandingkan dengan ayam ras.
Dari hal tersebut dapat dipastikan bahwa di
dalam tubuh ayam kampung ada bakteri
yang berperan dalam memusuhi mikroba
patogen.
Bakteri Bacillus sp. merupakan salah satu
mikroba flora normal pada saluran
pencernaan ayam kampung (Green et al.,
2006). Bacillus sp. memiliki sifat mampu
hidup dan berkembang dalam usus ternak
dengan baik dan dapat menghasilkan enzim
pencernaan seperti protease dan amilase
yang dapat membantu pencernaan, serta
memproduksi asam-asam organik rantai
pendek yang mempunyai sifat antimikroba.
Hasil penelitian Sjofjan (2003) membuktikan
bahwa Bacillus sp. mampu menghasilkan
antimikroba yang dapat menghambat bakteri
patogen seperti Salmonella sp. dan E.coli.
Pada percobaan in vitro menunjukkan
bahwa kultur Bacillus dapat menekan
perkembangan Salmonella sp. dan E.coli.
Berdasarkan uraian di atas, maka penelitian
ini dilakukan untuk mendapatkan isolat
bakteri Bacillus sp. dan karakterisasinya
yang memiliki kemampuan antimikroba dari
saluran pencernaan ayam kampung untuk
mengurangi terjadinya infeksi pada ayam.
2.1 Isolasi Bakteri Penghasil Antimikroba
Untuk mendapatkan isolat bakteri penghasil
antimikroba, maka di lakukan langkah-
langkah sebagai berikut :
a) Bakteri yang akan diisolasi berasal dari
sampel pakan yang telah mengalami
pelunakan (karena proses pencernaan)
di dalam ventrikulus, sampel pakan
yang telah digiling menjadi molekul
yang lebih kecil di dalam ampela, ayam
kampung.
b) Masing-masing dari sampel tersebut
diambil kurang lebih 1 sendok teh
kemudian di masukkan ke dalam media
pengkayaan/enrichment yaitu media
NB. cair sebanyak 50 ml.. Kemudian di
o
inkubasi selama 5 hari pada suhu 40 C.
c) Setelah diinkubasi selama 5 hari, 1 ml
sampel di inokulasikan ke dalam 20 ml
media NA yang sudah mencair
kemudian ditunggu hingga memadat.
Setelah padat, diinkubasi selama 24
o
jam dalam suhu 40 C. Adanya bakteri
penghasil antimikroba ditandai dengan
adanya zona jernih di sekitar bakteri
yang merupakan bukti bahwa bakteri
tersebut memiliki kemampuan untuk
menghambat pertumbuhan koloni
bakteri yang lain. Koloni ini merupakan
koloni kandidat penghasil antimikroba.
d) Setelah 24 jam, koloni yang tumbuh
diamati dengan melihat pertumbuhan

306
ISBN No. 978-602-98559-1-3
dan morfologi koloni meliputi tepi,
ukuran, bentuk dan warna. Koloni
kandidat yang sudah didapatkan
kemudian ditumbuhkan ke dalam media
NA (Nutrien Agar) dalam agar miring.
Koloni ini disebut koloni murni.
e) Koloni murni ini kemudian diperbanyak
dengan metode streak plate secara
penuh pada cawan petri dengan
menggunakan media NA (Nutrien
Agar).
2.2 Uji Isolat Bakteri Penghasil
Antimikroba terhadap beberapa
Bakteri Patogen
Satu ose bakteri kandidat diinokulasikan ke
dalam 5 ml aquades, divorteks kemudian 1
ml bakteri dimasukkan pada cawan Petri
setelah itu ditambahkan media steril (MC
untuk Streptococcus, NA untuk Klebsiella
pneumonia dan Vibrio cholera, EMBA untuk
Escherichia coli) yang sudah mencair
sebanyak 20 ml kemudian ditunggu hingga
memadat. Setelah padat, kandidat bakteri
penghasil antimikroba yang telah dimurnikan
pada media NA dipotong menggunakan
spatula besi dengan ukuran kira-kira 0,8 cm
kemudian dipindahkan ke masing-masing
media yang telah mengandung bakteri uji.
Untuk setiap cawan petri dapat digunakan 2
isolat bakteri kandidat penghasil
antimikroba. Kultur diinkubasi selama 24 jam
o antimikroba diinokulasikan pada media uji
dalam suhu 40 C. Setelah masa inkubasi
selesai, dilakukan pengamatan terhadap
diameter zona jernih yang terbentuk di
sekitar bakteri kandidat penghasil
antimikroba. Pengukuran dilakukan dengan
menggunakan penggaris. Untuk menghitung
besarnya zona jernih yang dihasilkan,
didapat dengan cara menghitung luas zona
jernih di sekitar koloni bakteri berbanding
luas koloni isolat bakteri atau ditulis dengan
rumus: I = luas zona total / luas koloni isolat.
2.3 Karakteristik Bakteri penghasil
antimikroba
Karakterisasi yang dilakukan pada bakteri
hasil isolasi adalah :
1. Morfologi koloni : melihat bentuk dan
warna koloni.
2. Pengecatan gram. Bacillus adalah
bakteri yang bersifat gram positif
(berwarna ungu) dan yang bersifat
gram negatif berwarna merah.
Uji Enzim Amilase
Sampel yang sudah diperoleh diinokulasi
dengan streak plate methode secara titik
pada media NA padat yang diperkaya
amilum dengan menggunakan ose
Prosiding SNSMAIP III-2012
runcing/lurus. Kemudian diinkubasi selama
o
24 jam dalam suhu 40 C. Setelah di
inkubasi 24 jam, dilakukan pengamatan
dengan mengukur zona jernih yang
terbentuk. Zona jernih itu dapat terlihat jika
di sekitar bakteri yang kita inokulasikan
diberi larutan lugol iodine.
Uji Enzim Protease
Sampel yang sudah diperoleh diinokulasi
secara titik pada media yang diperkaya
amilum dengan menggunakan ose
tumpul/lurus. Kemudian diinkubasi selama
o
24 jam dalam suhu 40 C. Setelah
diinkubasi dilakukan pengamatan dengan
mengukur zona jernih yang terbentuk.
Uji Enzim Selulase
Sampel yang sudah diperoleh diinokulasi
secara titik pada media yang diperkaya
CMC (selulosa) dengan menggunakan ose
tumpul/lurus. Kemudian diinkubasi selama
o
24 jam dalam suhu 40 C. Setelah
diinkubasi ditambahkan 1% Congo red
didiamkan selama 20 menit pada suhu
ruangan setelah itu cawan petri dicuci
dengan 1M Natrium klorida, maka akan
terbentuk zona jernih.
Uji Biokimia
1 ose sampel bakteri kandidat penghasil
biokimia (glukosa, fruktosa, sukrosa, laktosa
dan galaktosa) kemudian diinkubasi selama
o
24 jam dalam suhu 40 C. Setelah waktu
inkubasi selesai, kemudian melakukan
pengamatan terhadap perubahan warna
pada media dan terbentuknya gelembung
udara pada tabung durham. Warna media
awalnya adalah berwarna merah. Jika
terjadi fermentasi asam maka media akan
mengalami perubahan warna media menjadi
kuning. Adanya gelembung udara
menunjukkan bahwa bakteri kandidat yang
didapat dari isolasi saluran pencernaan
ayam kampung merupakan bakteri aerob.
Pengaruh pH terhadap Pertumbuhan
Bakteri (kualitatif)
Sampel bakteri kandidat penghasil
antimikroba yang sudah diperoleh
digoreskan (streak) pada media NA (Nutrien
Agar) dengan pH 4, 7 dan 9, kemudian
o
diinkubasi selama 24 jam dalam suhu 40 C.
Setelah diinkubasi, melakukan pengamatan
terhadap ukuran koloni yang tumbuh pada
media.
307
ISBN No. 978-602-98559-1-3 Prosiding SNSMAIP III-2012

Pengaruh Suhu terhadap Pertumbuhan 30 menit. Untuk mendapatkan pita protein,

Bakteri (kualitatif) gel direndam Natrium karbonat selama 3-5
Sampel bakteri kandidat penghasil menit sampai muncul pita protein. Untuk
antimikroba yang sudah diperoleh menghentikan munculnya pita, gel tersebut
digoreskan (streak) pada media NA (Nutrien dimasukkan dalam larutan fiksasi yang telah
Agar) padat kemudian diinkubasi pada suhu digunakan diatas. Sebelum memasukkan
o o o o
30 C, 40 C, 50 C dan 60 C. Setelah AgNO3, limbah tempat pembuangan ditetesi
diinkubasi, melakukan pengamatan dengan HCl agar tidak bereaksi dengan
terhadap ukuran koloni yang tumbuh pada Natrium karbonat.
media.

Elektroforesis 3. HASIL DAN PEMBAHASAN

Sampel yang akan dielektroforesis adalah
3.1 Isolasi dan Seleksi Bakteri
zat antimikroba yang diproduksi oleh
Penghasil Antimikroba
Bacillus sp. hasil isolasi. Elektroforesis di
lakukan dengan menggunakan piranti Mini Isolasi bakteri penghasil antimikroba dari
Protean II. Berat molekul protein yang saluran pencernaan ayam kampung
muncul diukur dengan menggunakan (tembolok, usus halus, usus besar dan
standar berat molekul rendah yang terdiri ampela) telah dilakukan. Bakteri tersebut
atas fosforilase b (otot kelinci) 94 kDa, dibiakkan dalam media nutrient broth.
albumin (serum bovin) 67 kDa, ovalbumin Setelah 4 hari, ditemukan 7 isolat bakteri
(putih telur) 43 kDa, karbonat anhidrase yang memproduksi antimikroba. Isolat
(eritmoritbovin) 30 kDa, tripsin inhibitor tersebut ditandai dengan adanya zona jernih
(kedelai) 20,1 kDa dan -laktat-bumin (susu yang terbentuk di sekitar koloni bakteri.
bovin) 14,4 kDa. Isolat yang didapat diberi kode berdasarkan
asal isolat. Isolat bakteri yang dihasilkan
Elektroforesis menggunakan gel pemisah dapat dilihat secara lengkap pada Tabel 1.
(8% poliakrilamid) dan gel penahan (4%
Tabel1. Data isolat bakteri kandidat penghasil
poliakrilamid). Gel pemisah digunakan untuk antimikroba
mengetahui lokasi keberadaan protein pada
sampel. Sebelum dimasukkan ke dalam No Kode Asal Organ Zona
sumur, 20 l sampel masing-masing di hambat
campur dengan 5 l buffer sampel di dalam
1 AUB 1 Usus Besar 0,2 cm
tabung mikro kemudian divorteks dan
disentrifuge selama 10 detik. 1 l standard 2 AUB 2 Usus Besar 0,1 cm
dan 25 l campuran tersebut dimasukkan ke 3 AUB 3 Usus Besar 0,1 cm
sumur (lubang) pada gel penahan. Setelah 4 AUH 1 Usus Halus 0,1 cm
gel dipasang pada piranti elektroforesis, 400
5 AUH 2 Usus Halus 0,2 cm
ml buffer elektroforesis pH 8,3 di tuangkan
pada tempatnya (piranti Mini Protean II). 6 AA 1 Ampela 0,1 cm
7 AA 2 Ampela 0,2 cm
Elektroforesis dijalankan pada tegangan Ket: AUB: Ayam Kampung Usus Besar
konstan 110 volt 50 mA selama 2 jam dalam AUH: Ayam Kampung Usus Halus
keadaan dingin (air es). Proses ini disebut AA : Ayam Kampung Ampela
running. Setelah running selesai, gel
Dari ketujuh isolat yang ditemukan tersebut
elektroforesis dilepas dari cetakan dan jarak
akan diuji kemampuan antimikrobanya
migrasi bromofenol biru diukur dari batas
terhadap beberapa bakteri patogen. Hasil
atas gel pemisah dengan menggunakan
dari uji inilah yang akan dikarakterisasi.
penggaris. Setelah itu dilakukan pewarnaan
terhadap gel dengan cara gel direndam
3.2 Uji Isolat Bakteri Penghasil
dalam larutan fiksasi selama 1 jam hingga
Antimikroba terhadap beberapa
semalamdan diinkubasi dalam shaker
Bakteri Patogen
bergoyang dengan kecepatan 30 rpm, lalu
direndam dengan larutan etanol 50% Uji Isolat Bacillus sp. kandidat penghasil
selama 30 menit, direndam 2 kali dalam antimikroba dilakukan untuk mengetahui
larutan etanol 30 % masing-masing 20 kemampuan masing-masing isolat dalam
menit, gel direndam dalam larutan enhancer menghambat bakteri patogen. Hasil dari uji
selama 1 menit, gel dicuci 3 kali dalam bakteri penghasil antimikroba terhadap
aquabides masing-masing 20 detik, gel beberapa bakteri patogen adalah seperti
direndam dalam larutan perak nitrat selama pada Tabel 2 dan Gambar 1

308
ISBN No. 978-602-98559-1-3 Prosiding SNSMAIP III-2012

.Tabel 2. Hasil uji isolat bakteri penghasil antimikroba kesempatan E. coli untuk menempel pada
terhadap beberapa bakteri uji usus jauh berkurang. Dengan demikian, E.
coli hanya berada dalam lumen dan akan
No Bakteri Bakteri Uji Diameter dikeluarkan bersama feses.
Zona
Hambat
(cm) Antimikroba Bacillus dihasilkan pada fase
1 Bacillus sp. Streptococcus 1,2 stationer yaitu pada saat menghasilkan
A1 K. pneumonia 1,7 metabolit sekunder (Todar, 2009). Pada
V. cholera 1,2
fase ini terjadi perubahan fisiologis
(Purwoko, 2007), jumlah sel yang mati
E. coli 1,2 semakin meningkat, dan jumlah sel hidup
2 Bacillus sp. Streptococcus 0 konstan (Sumarsih, 2003). Pada fase ini
A2 K. pneumonia 0 bakteri tidak melakukan perbanyakan sel
V. cholera 0
karena penurunan kadar oksigen, nutrien
habis, dan memproduksi antimikroba yang
E. coli 1,5
banyak (Purwoko, 2007). Produksi
antimikroba diatur oleh kontrol regulasi
Data pada tabel di atas jika ditampilkan keseluruhan yang berperan dalam laju
dalam diagram akan tampak seperti Gambar pertumbuhan dan efek regulasi khusus pada
1. setiap jalur metabolisme, faktor genetik dan
komposisi media.

Kemampuan bakteri Bacillus dalam

menghambat pertumbuhan bakteri patogen
2 juga dipengaruhi oleh struktur dinding sel
Zona suatu bakteri. Bakteri gram negatif lebih
Hambat1,5 rentan terhadap streptomisin. Bakteri gram
(cm) positif umumnya lebih rentan terhadap
1
penisilin dan kurang rentan terhadap
0,5 disintegrasi oleh perlakuan mekanik dan
pemberian enzim-enzim tertentu.
0
BA1 BA2 Bakteri Bacillus sp. menghasilkan kekebalan
dan antimikroba seperti bakteriosin
Bakteri penghasil Antimikroba (Patterson dan Burkholder, 2003). Pada
penelitian lain bakteriosin berasal dari
Bacillus cereus (Torkar et al.,2003), dan
Strep Kleb
Vib E.coli Lactobacillus sp (Sutardi, 2001). Bakteri
Bacillus mampu mengontrol bakteri patogen
(sebagai competitive exclution) di dalam
Gambar 1. Daya Antimikroba Bacillus sp. A1 dan A2
terhadap bakteri patogen saluran pencernaan.

Isolat Bacillus sp. A1 mampu menghambat
beberapa bakteri patogen. Bukti dari
penghambatan tersebut adalah adanya
zona bening di sekitar bakteri uji yaitu
Streptococcus sebesar 1,2 cm, Klebsiella
pneumonia 1,7 cm, Vibrio cholera 1,2 cm
dan Escherichia coli sebesar 1,2 cm
sedangkan Bacillus sp. A2 hanya mampu
menghambat pertumbuhan bakteri
Escherichia coli yaitu sebesar 1,5 cm..Dari
data penelitian diatas maka dapat diambil
kesimpulan bahwa bakteri Bacillus sp. yang
memiliki kemampuan dalam menghasilkan
antimikroba adalah Bacillus sp.A1 dan A2.
Bacillus sp. melakukan adhesi yang kuat
dengan dinding usus, mencegah kolonisasi
usus oleh mikroba patogen, sehingga
3.3 Karakteristik Bakteri hasil Isolasi
Bakteri yang menghasilkan antimikroba
adalah bakteri Bacillus sp. A1 dan A2.
Karakteristik bakteri penghasil antimikroba
dilakukan dengan menggunakan
pengamatan morfologi, fisiologi dan analisis
kandungan protein dengan SDS-PAGE.
Hasil dari pengamatan morfologi yaitu koloni
berbentuk bulat, warna koloni putih, ukuran
koloni tidak begitu besar, memiliki
permukaan cembung dan tepi yang rata.
Dari pengecatan gram dan bakteri BA 1 dan
BA 2 memiliki ciri-ciri morfologi bentuk sel
bakteri batang dan bersifat gram positif
(berwarna ungu). Pada pengecatan spora
bakteri BA 1 dan BA 2 memiliki bentuk spora
oval dan letak sporanya di tengah. Sesuai
dengan Feliatra, dkk. (2004) yang

309
ISBN No. 978-602-98559-1-3 Prosiding SNSMAIP III-2012

mengatakan bahwa bakteri Bacillus memiliki Berdasarkan ciri-ciri morfologi, fisiologi dan
endospora oval, kadang-kadang bundar hasil analisis dengan menggunakan SDS-
atau silinder dan sangat resisten pada PAGE maka dapat diketahui bahwa kedua
kondisi yang tidak menguntungkan. isolat bakteri penghasil antimikroba yang
dihasilkan dari saluran pencernaan ayam
Selain pengamatan secara morfologi, juga kampung merupakan bakteri yang sama.
dilakukan pengamatan fisiologi yang Perbedaan kedua bakteri ini adalah pada
meliputi tes biokomia, pH, suhu dan uji kemampuan isolat bakteri dalam
enzimatik. Pada pengecatan gram Pada uji menghambat pertumbuhan bakteri patogen.
suhu kedua bakteri ini tumbuh optimum
o
pada suhu 30-40 C dan pada pH 7-9. Jika
bakteri ditumbuhkan pada suhu diatas suhu 4. SIMPULAN
optimum maka pertumbuhan tidak terjadi
secara optimal. Hal ini terjadi karena suhu 1. Ada dua isolat bakteri Bacillus sp.
optimum suatu bakteri bergantung pada penghasil antimikroba di dalam saluran
suhu sel tempat bakteri itu berasal atau pencernaan ayam kampung. Kedua
sedikit melebihi suhu sel tersebut (Murray, bakteri tersebut adalah jenis yang
2003). sama.
Bakteri BA 1 dan BA2 memiliki kemampuan 2. Bakteri Bacillus A1 memiliki
dalam memfermentasi karbohidrat terutama kemampuan menghambat
glukosa dan fruktosa serta mendegradasi pertumbuhan beberapa bakteri patogen
protein, amilum dan selulosa. yaitu Streptococcus, Klebsiella
pneumonia, Vibrio cholera dan
3.4 Hasil identifikasi protein dengan Escherichia coli sedangkan Bacillus A2
menggunakan SDS-Page hanya memiliki kemampuan dalam
Isolat bakteri Bacillus sp.A1 dan A2 yang menghambat bakteri Escherichia coli
diperoleh kemudian dianalisis jumlah pita 3. Isolat bakteri Bacillus sp. yang diisolasi
protein dan berat molekulnya dengan SDS dari saluran pencernaan ayam
PAGE. Kemudian hasilnya akan diwarnai kampung memiliki sel berbentuk
dengan menggunakan pewarna gel yaitu batang, bersifat gram positif,
perak nitrat. Hasil yang diperoleh adalah menghasilkan spora, mampu
seperti Gambar 2. memfermentasi karbohidrat, mampu
mendegradasi amilum, protein dan
o
selulosa dan tumbuh pada suhu 40 C
dan pH 7-9.

UCAPAN TERIMAKASIH

Terima kasih kami ucapkan kepada Hibah

Bersaing 2010 Dikti, yang telah mendanai
proyek penelitian ini.

PUSTAKA

Feliatra, et al. 2004. Isolasi dan Identifikasi

Bakteri Probiotik dari Ikan Kerapu
Macan (Ephinephelus fuscogatus)
NB BA1 BA2 M dalam Upaya Efisiensi Pakan Ikan.
Keterangan : Universitas Riau. Pekanbaru
M : Marker Murray, Robert K, dkk. 2003. Biokimia
BA1 : Bakteri penghasil antimikroba spesies 1 Harper edisi 25. Buku Kedokteran
BA2 : Bakteri penghasil antimikroba spesies 2
NB : Nutrien Broth EGC. Jakarta.
Patterson, J. A dan Burkholder K.M. 2003.
Pada hasil analisis SDS-PAGE, pita-pita Application Of Prebiotics and Probiotics
protein yang terbentuk hampir sama antara In Poultry. Poult. Sci 82: 627-631.
NB, BA1 DAN BA2. Purwoko, T. 2007. Fisiologi Mikroba. PT
Bumi Aksara. Jakarta.

310
ISBN No. 978-602-98559-1-3
Sjofjan, O. 2007. Isolasi dan Identifikasi
Bacillus spp. dari Usus Ayam Petelur
sebagai Sumber Probiotik. Tanggal
kunjungan 26 Agustus 2010.
http://library.trunojoyo.ac.id/elib/detil.ph
p?id=2148&PHPSESSID=6098f327dle5
448de20dd2d95b4c2ad7
Sumarsih, S. 2003. Mikrobiologi
Dasar.tanggal kunjungan 12 Agustus
2010. Pukul 11:00 WIB.
http://images.birdfun.multiply.multiplycon
ten.com/attachment/0/SWCaMAoKCDE
AACGId@11/buku-ajar-
mikrobiologi.pdf?nmid=160206209
Sutardi, T. 2001. Produksi Biopreservatif
Atau Feed Supplements (Bakteriosin)
Dari Bakteri Asam Laktat. Abstrak Ilmu
Nutrisi dan Makanan Ternak
FAPET.Tanggal kunjungan 28 Juli
2010.Pukul 10.00 WIB.
Prosiding SNSMAIP III-2012
http://web.ipb.ac.id/~lppm/ID/index.php?
view=penelitian/hasilcari&status=buka&i
d_haslit=X019
Todar, K. 2009. Antimocrobial Agents Used
in the Treatment of Infectious Disease.
Tanggal kunjungan23 Juli 2010 Pukul
09.00WIB.
www.textbookofbacteriology.net
Torkar, K G, dan Matijasi, B B. 2003.
Partial Characterisation of Bacteriocins
Produced by Bacillus cereus Isolates
from Milk and Milk Products. Food
Technol. Biotechnol, 41 (2) 121-
29(2003)
311