III.

Bahan dan Metode

2.1. Hewan
Sebanyak 5 C57BL betina bebas patogen / 6 tikus (usia 6 minggu, berat 16
- 20 g) disiapkan oleh Pusat Perawatan Biologi di Beijing Militer Komando
Rumah Sakit. Empat puluh (WT) C57BL tipe liar / 6 tikus yang dibeli dari Beijing
Laboratorium Hewan Pusat Beijing Weitonglihua Perusahaan (Beijing, China).
WT C57BL ini / 6 tikus dibagi secara acak menjadi lima kelompok [kelompok A:
kelompok kontrol kosong dengan tikus normal, tidak mengalami adanya
pembuangan; Kelompok B: phosphatebuffered saline (PBS) kelompok kontrol
Model, subkutan disuntikkan ke PBS dalam dosis yang sama seperti bleomycin;
Kelompok C: injeksi lokal bleomycin untuk membentuk model LS; Kelompok D:
kelompok perlakuan Model, injeksi lokal bleomycin untuk membentuk model LS
dan ADSCs transplantasi subkutan untuk mengobati LS; Kelompok E: injeksi
lokal bleomycin dan PBS injeksi subkutan untuk mengatur kontrol model],
dengan 8 tikus di masing-masing kelompok. Semua tikus secara individual
ditempatkan di kamar bersih yang terpisah di bawah cahaya dikontrol dan kondisi
suhu (22 C) dan disediakan dengan makanan dan air ad libitum. Kulit punggung
tikus dicukur, dan tikus kelompok C, D, dan E yang subkutan disuntik dengan 300
m g / mL bleomycin di PBS (Nippon Kayaku Perusahaan, Tokyo, Jepang) dan
tikus kelompok B disuntik hanya dengan PBS setiap hari selama 4 minggu. Tidak
ada pengobatan untuk membuat grup A. Empat minggu kemudian, jaringan kulit
belakang kelompok A, B, dan C yang exsected, dilakukan di bagian histologis dan
perubahan patologis diamati.
2.2. Budidaya ADSCs
ADSCs diisolasi dari 5 C57BL betina bebas patogen / 6 tikus melalui
metode yang didasarkan pada densitas sel dan adhesi, seperti yang dijelaskan oleh
Zuk et al. ADSCs terbudidaya di bagian 3 - 4 telah digunakan dalam studi in vivo.
Sebelum sel-sel disuntikkan ke tikus, mereka dianalisis untuk kapasitas mereka
untuk berkembang biak dan untuk membedakan arah adipogenic, osteogenik,
khondrogenik, dan garis keturunan myogenic seperti yang dijelaskan oleh Park IS
et al. ADSCs dari bagian 4 yang berlapis di piring 96-baik, dan aktivitas
proliferasi sel dievaluasi setelah 1, 2, 3, 5, dan 7 d menggunakan assay MTT.
2.3. Transplantasi lokal ADSCs
Tikus kelompok D menerima injeksi subkutan tunggal ADSCs (2 10 6
sel di 100 m L dari HBSS) di belakang. Kelompok E menerima injeksi subkutan
tunggal HBSS, 100 m L / saja.
2.4. In vivo pencitraan fluoresensi
ADSCs menyatakan protein fluorescent hijau (GFP) ditingkatkan. In vivo
pencitraan fluoresensi berurutan dilakukan pada tikus yang dibius pada hari 7, 14,
21, dan 28 setelah transplantasi menggunakan in vivo sistem pencitraan (IVIS,
LB983NC100, Berthold, Jerman). Kelangsungan hidup ADSCs transplantasi
diamati oleh kamera CCD.
2.5. Imunohistokimia
Tikus kelompok D, E tewas dengan metode dislokasi leher 4 minggu
kemudian setelah pengobatan ADSCs, jaringan kulit kembali yang exsected dan
dibagi menjadi beberapa bagian untuk melakukan hematoxylin - eosin (HE)
eksperimen warna, warna percobaan Masson dan untuk mendeteksi ketebalan
kulit dan konten hidroksiprolin.
2.6. Ketebalan kulit dan analisis serat kolagen
Ketebalan kulit diukur dengan Gambar-Pro Plus 6.1 di bawah mikroskop
elektron setelah pewarnaan HE dan dihitung dari 5 bagian rata-rata. Bagian
formalin tetap tertanam di parafin dan diwarnai dengan MT untuk memeriksa efek
dari bleomycin atau pengobatan ADSC pada jumlah serat kolagen. Gambar yang
diperoleh dengan menggunakan Leica DM2000B + DFC295 mikroskop cahaya
(Jerman) dan dianalisis dengan menggunakan software Image Pro Plus 6.1. Indeks
kepadatan optik (OD) untuk setiap kelompok dihitung untuk analisis kuantitatif
dan perbandingan statistik dari kolagen ekspresi. Indeks pewarnaan serat kolagen
setiap spesimen dihitung sebagai daerah bernoda positif intensitas pewarnaan.
2.7. Konten Hidroksiprolin
Isi total hidroksiprolin terdeteksi dengan menggunakan colorimeter
fotolistrik menurut petunjuk pabrik (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute)
dan dihitung dengan menggunakan persamaan berikut: konten hidroksiprolin ( m
g / berat mg basah) = (sampel OD - OD kosong) / (standar OD - OD kosong)
konten hidroksiprolin standar (5 m g / mL) total volume hidrolisat (10 mL) /
jaringan berat basah (mg).
2.8. Ekspresi TGF b 1 dan VEGF
Sampel snap-beku dalam nitrogen cair, dan 20 m bagian m disiapkan
dalam cryostat untuk analisis imunohistokimia. Akhirnya, bagian diinkubasi
dengan antibodi primer. Antibodi primer berikut digunakan: anti-TGFb 1
diencerkan 1: 250 (ab92486, Abcam, Cambridge, Inggris) dan anti
VEGFdiencerkan 1: 200 (ab52917, Abcam, Cambridge, Inggris). Digitalisasi
dilakukan dengan menggunakan Pannoramic 250 FLASH digital geser scanner
(3DHISTECH) dan CIS VCCF52U25CL 3CCD kamera warna progressive scan
(resolusi: 0.37 m m / pixel). H-Score, jumlah persentase sel
positif bernoda sel dikalikan dengan intensitas pewarnaan tertimbang,
dihitung.
2.9. Statistika
Semua nilai-nilai yang dinyatakan sebagai mean SD. Sarana kelompok
dibandingkan dengan menggunakan sampel independen t tes dengan software
SPSS17.0. P < 0,05 dianggap statistik signifikan fi Perbedaan tidak bisa.