Agung Dian Kharisma

Bahan-bahan yang digunakan meliputi isolat kultur mikroba campuran yang diambil dari
digester biogas sampah buah pasar Gamping Yogyakarta, resazurin, akuades, hidrogen
peroksida (H2O2) 1M, HCl, NaOH, sistein HCl, larutan stok nutrisi PYG (10 g/L peptone;
10 g/L yeast extract; 0,001 g/L resazurin; 0,5 g/L L-cysteine-HCl; 10 g/L glukosa) dan
medium produksi (5 g peptone; 0,5 g yeast extract;1,2 g KH2PO4; 5,1 g Na2HPO4; 0,5 g
MgSO4.7H2O dan 0,5 g L-sistein-HCl( tanpa glukosa)

Alat
Fermentor sistem bacth, botol vial, chreamper, penangas air, pipet mikro dan tips, gas
nitrogen, gas karbondioksida, autoclave, seal aluminium, membran filter 0,22
mikrometer, syringe gas, tabung ependof 5 mL, botol serum 100 mL, inkubator, gas
chromatography, dan alat-alat gelas yang umum digunakan dalam laboratorium

Pre-treatment kultur mikroba campuran

Kultur mikroba campuran diambil dari digester biogas (substrat limbah buah) di pasar
buah Gemah Ripah, Gamping Yogyakarta. Kultur mikroba campuran terlebih dahulu
masuk dalam tahap pretreatment sebelum digunakan sebagai inokulum untuk
fermentasi. Proses pretreatment berfungsi untuk menonaktifkan bakteri metanogenik
yang bersifat menggunakan H2 membentuk gas metana. Mikroba penghasil hidrogen
lebih tahan terhadap panas dan asam, sedangkan mikroba penghasil metana cenderung
kurang tahan terhadap panas tinggi dan suasana asam. Cheong dan Hansen (2006)
menyatakan mikroba penghasil hidrogen bisa tetap tumbuh pada pH yang rendah
daripada mikroba metanogenik. Mikroba metanogenik tidak dapat tumbuh pada pH
yang rendah dibawah pH 5. Metode yang digunakan adalah penambahan 1M HCl 10% ke
dalam inokulum segar sampah buah hingga pH 3 selama 24 jam. Setelah proses tersebut
selesai, dilanjutkan dengan mengembalikan pH optimal pertumbuhan yaitu pH6-7

Preparasi medium
Pembuatan medium anaerob merupakan tahap awal dalam pembuatan fermentor
biohidrogen ini. Penggunaan medium pada penelitian ini disesuaikan dengan kebutuhan
dengan tujuan penggunaan medium tersebut. Dua medium yang digunakan adalah PYG
(pepton-yeast-glukosa) dan media produksi. PYG akan digunakan untuk pengkayaan
mikroba campuran sebelum digunakan pada medium produksi. Medium produksi
menggunakan media produksi tanpa glukosa dan ditambahkan buah melon sebagai
sumber karbonnya.

Medium pengkayaan kultur mikroba campuran

Pembuatan medium pengkayaan bertingkatbertujuan untuk mendapatkan kultur
mikroba campuran yang bersifat stabil. Fermentor yang digunakan ukuran 100 mL
dengan volume kerja 50 mL. Volume kerja terdiri dari 45mL larutan nutrisi dan 5 mL
inokulum mikroba campuran yang terlah diberi perlakuan pretreatment. Medium
pengkayaan menggunakan PYG (pepton-yeast-glukosa) yang mengandung nutrisi 10 g/L
pepton, 10 g/L yeast extract; 0,001 g/L resazurin, 0,5 g/L L-sistein-Hcl, 10 g/L glukosa.
Medium dikondisikan pada pH 7 sebelum diinokulasikan dengan inokulum. Medium
anaerob dalam pembuatannya memerlukan indikator anaerob sebagai indikator bahwa
medium tersebut telah anaerob. Indikator yang digunakan adalah resazurin. Warna akan
berwarna biru pada awal penambahan resazurin yang menandakan bahwa medium
masih mengandung oksigen. Medium yang telah berisi resazurin kemudian dipanaskan
hingga ada perubahan warna dari biru menjadi merah muda. Sistein HCl sebanyak 2,5
mL ditambahkan pada medium setelah terjadi perubahan warna medium menjadi
merah muda dan dipanaskan kembali. Proses selanjutnya medium dimasukkan dalam
fermentor (45 mL) dan di autoclave selama 15 menit untuk mensterilkan medium serta
menghilangkan oksigen yang kemungkinan masih ada dalam medium. Tahap berikutnya,
fermentor dijenuhkan menggunakan gas nitrogen untuk menjaga kondisi anaerob pada
headspace fermentor. Untuk memberikan kondisi anaerob, digunakan metode Hungate,
dimana bagian headspace masing-masing bioreaktor dilakukan penggantian oksigen
dengan gas nitrogen selama 3 menit (Chung et al, 1997).
Medium pada fermentor akan berubah menjadi warna medium awal apabila medium
sudah anaerob. Inokulum dimasukkan dalam fermentor sebanyak 5 mL setelah medium
pada fermentor menjadi warna medium awal. Fermentor selanjutnya diletakkan pada
inkubator dengan suhu 37 C. Analisa gas akan dilakukan setiap 24 jam sekalis ampai
tidak ada produksi gas lagi yang menandakan bahwa sumber karbon telah habis
digunaka (Jaapar et al., 2011)
Pengkayaan dilakukan sebanyak tiga tingkat pengkayaan. Transfer pengkayaan I
merupakan perpindahan isolat dari medium awal ke medium limbah organik cair,
dimana dengan memindahkan kultur bakteri campuran sebanyak 5 mL pada medium
pengkayaan dan setelah 24 jam dipindahkan pada medium pengkayaan yang baru.
Transfer II dilakukan dengan memindahkan inokulum dari transfer I yang berusia 24 jam
ke medium PYG yang baru. Transfer III yaitu inokulum dari transfer II yang berusia 24
jam dipindahkan kembali ke medium PYG yang baru. Kultur mikroba campuran pada hari
ketiga tlah siap digunakan untuk diinokulasikan pada medium produksi yang akan
digunakan.
Medium produksi:
Medium produksi mempunyai komposisi yang berbeda dengan medium pengkayaan.
Medium mengandung 5 g pepton, 0,5 g yeast extract, 1,2 g KH2PO4, 5,2 g Na2HPO4, 0,5
g MgSO4.7H2O dan 0,5 g L-sistein-Hcl. Volume kerja 50 mL dalam fermentor ukuran 100
mL. Volume kerja berisi nutrisi sebanyak 30 mL dan substrat buah melon 15 mL. Proses
teknis pembuatan medium anaerob sama dengan no 2.1 diatas, dimana hanya jenis dan
jumlah mediumnya saja yang berbeda. Namun terdapat satu tahapan yang berebda yatu
susbtrat melon sebanyak 15 mL ditambahkan pada saat sebelum medium di autoclave.
Medium setelah diautoclavedilanjutkan dijenuhkan dengan gas nitrogen selama 3 menit
dan medium siap digunakan