4

ISOLASI
Menyiapkan dan Memurnikan
cuplikan
Menghilangkan sebagian besar bahan yang tidak
dikehendaki

Partisi Pelarut

Penyaringan

Pengendapan
Kromatografi Datar (Planar)
Kromatografi Lapis Tipis Preparatif
Penyerap
Ketebalan yang paling sering dipakai ialah 0,5- 2
mm
Ukuran plat biasanya 20 x 20 cm atau 20 x 40 cm
Pembatasan ukuran dan ketebalan mengurangi
bahan yang dipisahkan
Penyerap yang paling umum adalah silika gel
Dapat dibuat sendiri atau dibeli sudah terlapisi
penyerap
 Penotolan Cuplikan
Cuplikan dilarutkan dalam sedikit pelarut sebelum
ditotolkan pada plat KLTP
Pelarut yang baik adalah pelarut atsiri (heksan,
diklormetan, etilasetat)
Konsentrasi cuplikan harus sekitar 5-10%
Ditotolkan berupa pita sesempit mungkin
Penotolan dapat dengan tangan atau penotol
otomatis
Untuk pita yang terlalu lebar dapat dilakukan
pemekatan
 Memilih fase gerak dan mengembangkan plat
KLTP
Pemilihan pelarut ditentukan berdasarkan
pemeriksaan pendahuluan memakai KLT analitik
Fasa gerak biner (dalam berbagai perbandingan)
sangat sering dipakai pada pemisahan secara KLTP
Pengembangan Plat KLTP biasanya dilakukan
dalam bejana kaca yg dapat menampung plat
Keefisienan pemisahan dapat ditingkatkan dengan
cara pengembangan berulang
 Isolasi Senyawa yang sudah terpisah
Menyerap sinar UV : kebanyakan penyerap KLTP
mengandung indikator fluoresensi
Untuk senyawa yang tidak menyerap UV, ada
beberapa pilihan
Menyemprot dengan air (saponin)
Menutup plat dengan sepotong kaca, menyemprot salah
satu sisi dg pereaksi semprot
Menambahkan senyawa pembanding
Pita yang kedudukannya telah diketahui kemudian
dikerok
Ekstraksi dari penyerap
 Pencemaran senyawa
Penyerap KLTP mengandung pengikat dan
indikator fluoresensi yg susunan kimianya
biasanya tidak diketahui
Pada kenyatannya semakin polar larutan
pengekstraksi makin banyak pula senyawa yg tidak
diinginkan ikut terekstraksi
Malasah selanjutnya ialah senyawa luar tersebut
sering tidak menyerap UV dan tidak terdeteksi
ketika menganalisis dg KLT akhir senyawa hasil
pemurnian
Kromatografi Lapis Tipis Sentrifugal
Chromatotron
Jantung alat ini adalah plat kaca berdiameter 24 cm,
yang dilapisi penyerap yang cocok untuk preparatif
Plat tersebut di pasang pada poros motor listrik dan
diputar 800 rpm
Pelarut pengelusi dimasukan kebagian tengah melalui
pompa torak yg mampu mengalirkan 1-10 mL /menit
Pengelusi bisa susunan nya tetap atau berupa
landaian dgn lajju 3-6 mL/menit
 Pemasukan cuplikan diikiuti dengan
pengelusian menghasilkan pita2x komponen
berupa lingkaran sepusat
Pada tepi pita-pita terputar keluar dan
ditampung dengan tabung
 Keuntungan
Cara kerja sederhana
Waktu cepat (30 menit)
Tidak perlu mengerok pita
Pelarut tidak boros
Rotor yg sudah dilapisi dapat diregenerasi
Pencemar dari penyerap lebih sedikit
Penotolan cuplikan mudah
Dapat dilakukan pengembangan landaian bertahap
Perolehan kembali lebih besar dari KLTP
Kemungkinan oksidasi senyawa lebih kecil
 Kerugian
Fase diam yag dapat dipilih terbatas
Rotor yang sudah dilapisi tidak ada dalam
perdagangan
Daya pisah terbatas
Cara pendeteksian terbatas
Sistem pengumpul mungkin tercemari
Kromatografi Kolom Khusus
 Kromatografi Kolom Kering
Memerlukan pengisian kolom kromatografi dg
kemasan kering
Cuplikan ditambahkan sebagai larutan pekat atau
setelah dikeringkan bersama penyerap
Pengelusi dibiarkan bergerak melalui kolom ke
bawah karena gaya kapiler sampai garis depan
pengelusi mencapai bagian atas kolom
Aliran pengelusi dihentikan dan pita dalam kolom
diambil dengan cara mendorong keluar kolom,
mengiris atau mencongkel keluar
Ekstraksi dengan pelarut yg cocok
 Waktu cepat (15-30 menit)
Jika menggunakan alumunium, pemisahan
dapat diekstrapolasi langsung dari plat KLT
Nisbah cupllikan terhadap penyerap 1 :300-
1:500
Memberikan daya pisah yang lebih baik drpd
kolom biasa
Kromatografi Cair Vakum
 Penyiapan kolom
Kolom kromatografi dikemas kering dalam
keadaan vakum
Vakum dihentikan
Pelarut yang kepolarannya rendah dituangkan ke
permukaan penyerap lalu di vakum lagi
Kolom dihisap sampai kering dan sekerang siap
digunakan
 Penyiapan Cuplikan
Dilarutkan dalam pelarut yg cocok
Dimasukan langsung atau pada lapisan penyerap
Dihisap perlahan-lahan kedalam kemasan dengan
memvakum nya
Kolom dielusi dg campuran pelarut yang cocok
Kolom dihisap sampai kering pada setiap
pengumpulan fraksi
Kromatografi Cair Tekanan Preparatif
Prinsip Dasar

Keefektian kromatografi tekanan didasarkan

pada kecepatan , daya pisah dan beban
 Urutan untuk melaksanakan pemisahan
secara kromatografi bertekanan
Memilih sistem kromatografi secara mendasar
Memisahkan sedikit cuplikan pada kolom KC
analitik
Mengoptimumkan pemisahan KC analitik
Mengalihkan ke sistem KC preparatif
Melaksankan pemisahan
Memperoleh kembali senyawa yang dimurnikan
Kolom
Parameter kolom lain yang sangat penting untuk pemisahan

Kolom

Penyerap Wadah

Sifat ukuran Ukuran Garis

Panjang Bahan
partikel partikel tengah
Fase Diam
Silika gel
Keporian, luas permukaan dan bentuk partikel
Untuk KCKT analitik yang paling sering diapakai
ialah partikel berukuran 5-10mm untuk KC
preparatif 10-40 mm
Silka gel yang dilapisi perak nitrat
 Kromatografi pasangan ion
Kolom Permeasi gel
Fasa diam Khiral
 Cara mengemas kolom
Bergantung dari cara KC preparatif yang akan
dipakai, ukuran partikel, penyangga dan ukuran
kolom
Keefisienan kemasan bergantung pada ukuran
partikel; untuk silika gel bulat, cara kemas kering
berhasil baik, meskipun partikelnya berukuran 20
mm
 Memasukan cuplikan
Faktor yg perlu dipertimbangkan
Penyiapan cuplikan
Pelarut cuplikan
Massa cuplikan
Valume cuplikan
Mekanisme penyuntikan
Kolom dan fitting
 Pompa
Karena ukuran partikel kemasan yang dipakai pada
KC preparatif lebih besar
Tekanan yang diperlukan untuk mendorong
pelarut lebih rendah
Kecuali dlm KCKT preparatif memakai kolom
berlubang besar yg dikemas dengan partikel
bergaris tengah kecil, diperlukan pompa yg cukup
kuat
 Detektor
Sebagaian besar detektor dirancang untuk KC
analitik
Detektor untuk KC preparatif harus mampu
menampung laju aliran tinggi yg biasa dipakai
Cara mendeteksi pada KC terbatas dan dua cara
yaitu dengan UV dan indekx bias
 Pengelusi
Kemurnian pelarut yang dipakai untuk
menyusun pengelusi sangat penting pada KC
preparatif
Sebab penguapan fase gerak bervolume besar
dari fraksi-fraksi yang mengandung senyawa
murni dapat menghasilkan pencemar yang
berarti walaupun pelarut hanya tercemari oleh
sesespora bahan atsiri
 Mengumpulkan senyawa yang telah
dipisahkan

Berbagai cara kromatografi cairan

tekanan preparatif

Kromatografi Kilat (sekitar 2 bar/30 psi)

KC tekkanan rendah (5 bar/75 psi)
KC tekanan menengah (5-20 bar/75-300 psi)
KC tekanan tinggi (> 20 bar/300 psi)
Kromatografi Lawan Arus
Masalah dalam KLA
Bagaimana menahan fase diam tetap pada
tempatnya dengan melawan aliran fase gerak yg
terus menerus
Bagaimana membagi kolom kromatografi menjadi
sejumlah satuan partisi
Bagaimana meminimumalkan aliran laminar pita
cuplikan
Bagaimana meningkatkan kontak antarmuka
Bagaimana caranya memperkecil tahanan
terhadap alih masa (mencampur fase gerak dan
fase diam)
 KLA tetes

Cara pemisahan cair-cair yang didasarkan pada

partisi linarut antara duua pelarut yang tidak
bercampur, perbandingna nisbi linarut yang
memasuki masing-masing fase ditentukan oleh
Kp linarut
instrumentasi
Kromatografi Lawan Arus Lokulus
Rotasi (KLALR)
 Memilih Pelarut
Sistem biner dapat dipakai, tetapi karena alasan
keselektifan, sistem terner atau kuarterner lebih
disukai
Pemilihan pelarut bifase yang cocok dapat
dilakukan dengan KLT
Masing2x fase digunakan secara bergantian
Jika Rf cuplikan lebih besar dari 0,8 dalam satu
fase dan antara 0,2 dan 0,4 dalam fase yg lainnya,
sistem pelarut cocok untuk KLALR
Kromatografi Lawan Arus Sentrifugal