Firda Liesdiana

Biomanajemen - 21317020

Review Jurnal
Loss of Arabidopsis GAUT12/IRX8 causes anther
indehiscence and leads to reduced G lignin associated with
altered matrix polysaccharide deposition
Hao, Zhangying., et all (2014). Frontiers in Plant Science.Volume 5. Article 357

Pengertian Arabidopsis

Arabidopsis atau sering dikenal dengan Arabidopsis thaliana merupakan salah satu jenis

gulma kecil yang tergolong pada famili kubis-kubisan. Salah satu jenis tumbuhan ini dapat

tumbuh didalam tabung reaksi dan setelah 8 10 minggu kemudian menghasilkan ribuan

progeni; seperti tumbuhan kacang Mendel, setiap bunganya memproduksi ovum dan sperma (di

serbuk sari). Untuk penelitian manipulasi gen, para ilmuwan dapat menumbuhkan sel

Arabidopsis dalam kultur dan dapat mengisolasi gen dari sel ini untuk transformasi genetik

sebagai DNA asing. Keuntungan lagi dari Arabidopsis adalah bahwa tanaman ini mempunyai

genom kecil yaitu 70 juta pasangan nukleotida; bahkan lebih kecil dari genom C. elegans dan

Droshopilla.

GAlactUronosylTransferase12 (GAUT12) / IRregular Xylem8 (IRX8)

GAUT12 atau IRX8 adalah glycosyltransferase putatif yang terlibat dalam biosintesis
dinding sel Arabidopsis. GAUT12 / IRX8 ( At5g54690 ) juga merupakan anggota keluarga

CAZy GT8 yang mengandung GTs terkait dengan homogalakturonan (HG): -1,4

galacturonosyltransferase (Galat) GAUT1 (Sterling et al., 2006 ). Matriks ekstraselular tanaman

(yaitu dinding sel) terdiri dari berbagai polimer karbohidrat kompleks dengan sifat kimia dan

fisik yang berbeda. Interaksi kovalen dan nonkovalen antara polimer-polimer ini pada komposit

akhir menentukan banyaknya karakteristik dinding sel. Dengan demikian, mutasi pada

glikosiltransferase individual (GT), yang masing-masing mungkin berperan dalam biogenesis

komponen atau domain dinding sel tunggal, sering mempengaruhi banyak kelas polimer dinding

1
 Firda Liesdiana
Biomanajemen - 21317020
sel dan kadang-kadang menyebabkan tanaman menjadi kurcaci. Sebagai contoh, mutasi mutan

Arabidopsis irx7 (Zhong et al., 2005 ) cacat pada deposisi xylan dan selulosa, sedangkan qua1

(Bouton et al., 2002 ; Leboeuf et al., 2005 ; Orfila et al., 2005 ), parvus -3 / gatl1 (Lao et al.,

2003 ; Shao et al., 2004 ; Brown et al., 2007 ; Lee et al., 2007b ; Kong et al., 2009 ), dan irx8 /

gaut12 mutan (Pea et al , 2007 ; Persson et al., 2007 ) dipengaruhi pada biosintesis pektin dan

xylan. Efek kompleks ini membuat sulit untuk menyimpulkan fungsi gen primer berdasarkan

fenotip mutan saja.

Bahan dan Metode

Bahan Tanaman

Tanaman Arabidopsis tipe liar (Col-0), irx8-5 (SALK_044387), irx8-2 (SAIL_603_G02),

parvus-3 (SALK_045368), dan irx9-1 (SALK_058238) ditanam di tanah pada ruang dengan

lingkungan terkontrol di bawah siklus 14-h-light / 10-h-dark pada suhu 19 dan 15 C. Intensitas

cahaya 150 Em-2s-1 dan kelembaban relatif dipertahankan pada 50%. Tanaman dipanen setelah

7-8 minggu. Penyisipan T-DNA dikonfirmasi dengan menggunakan primer dari daerah genom

yang mengapit T-DNA dan primer kiri T-DNA kiri (Tabel Tambahan S1). Tanaman kolagen

Arabidopsis Col-0 dan irx8 ditransformasikan melalui metode floral dip (Clough and Bent, 1998)

dan tanaman transgenik yang dipilih pada pelat media MS yang mengandung 15 mg / L
hygromycin. Tanaman transgenik yang menyimpan bangunan di Col-0 dan irx8 homozigot

mutant backgrounds genotip menggunakan PCR (Primer terdaftar di Tabel Tambahan S1 ).

Generasi konstruksi GAUT12-EGFP

Urutan pengkodean GAUT12 (CDS) diperkuat dari total RNA (0,5 g) yang diisolasi

dari batang Arabidopsis Col-0 berumur 7 minggu dengan RT-PCR menggunakan Sistem RT-

PCR OneScript SuperScriptTM III dengan Platinum Tag High Fidelity (Invitrogen 12574 -030)

dan kloning menjadi vektor pGEM-T Easy (Promega) (primer tercantum dalam Tabel
Tambahan S1). Amplifier GAUT12 yang diperkuat diverifikasi secara berurutan dan diklon ke

2
 Firda Liesdiana
Biomanajemen - 21317020
dalam konsep over-expression pCambia35tl:egfps2#4 (Pattathil et al., 2005) antara situs

pembatasan NcoI dan KpnI untuk menghasilkan konstruksi GAUT12-EGFP yang didorong oleh

promotor CaMV 35S. Plasmid disterilkan menjadi sel strain kompeten Agrobacterium

tumefaciens GV3101 dan sel yang ditransformasikan yang digunakan untuk mentransformasi

tanaman Arabidopsis wild type (WT) dan heterozigot irx8 .

Pewarnaan Histokimia

Pereaksi Mule dibuat seperti yang dijelaskan (Chapple et al., 1992 ) dengan sedikit

modifikasi dan digunakan untuk mendeteksi S lignin. Bunga terbuka Arabidopsis dan tangkai

batang melintang diolah dengan larutan KMnO4 0,5% (b / v) selama 10 menit dan dibilas dengan

air. Untuk sampel bunga, solusinya dilengkapi dengan deterjen 7X (vv / v) 7X deterjen (Linbro,

Laboratorium Aliran) untuk memecahkan ketegangan permukaan. Sampel diolah dengan HCl

10% (v / v) selama 5 menit, dibilas dengan air dan dipasang pada amonia terkonsentrasi untuk

pengamatan mikroskopik.

Pewarnaan Phloroglucinol-HCl disiapkan baru seperti yang dijelaskan (Guo et al., 2001 ).

Dua bagian 2% (w / v) phloroglucinol dalam etanol 95% (v / v) dicampur dengan satu bagian

HCl pekat. Gambar diambil 10 menit setelah menerapkan noda. Bunga bernoda dipandang
menggunakan ruang lingkup pembedahan (Olympus SZH) di bawah lapangan gelap. Bagian

melintang batang yang bernoda dipandang menggunakan mikroskop Nikon Eclipse80i di bawah

medan terang. Gambar diambil menggunakan kepala kamera Nikon DS-Ril (Nikon, Melville,

NY).

3
 Firda Liesdiana
Biomanajemen - 21317020
Memindai Mikroskop Elektron

Dengan menggunakan ruang pembedahan, antera dari WT dan bunga terbuka mutan

dilepas dengan foringeps bedah (Sigma-Aldrich T4537). Serbuk sari dilepaskan ke tangkai

spesimen di atasnya dengan tab karbon lengket dua sisi dengan mengetuk tang tang dengan

lembut, atau dengan ringan mengetuk anter ke stub. Para antera mutan irx8 pertama kali dibedah

secara manual untuk membukanya dan serbuk sari dengan lembut ditarik keluar menggunakan

ujung forceps dan dipindahkan ke permukaan rintisan. Sampel didehidrasi dan dilapisi dengan

partikel emas selama 120 detik dalam Sputter Coater, dan dicitrakan menggunakan mikroskop

elektron pemindaian JEOL JSM-5800 (SEM / EDAX) atau SEM Topcon Aquila-Hybrid.

Pertumbuhan Tabung Serbuk Sari in vitro dan Persiapan RNA

Tabung serbuk sari ditanam secara in vitro seperti yang telah dijelaskan sebelumnya

(Dardelle et al., 2010 ). Secara singkat, butir serbuk sari WT dikumpulkan dari 40 bunga terbuka

dengan vorteks selama 3 menit dalam tabung mikrokapsul yang mengandung 1 ml media

perkecambahan tepung sariawan (PGM) yang terdiri dari 5 mM CaCl2 2H2O, 0,01% (b / v)

H3BO3 , 5 mM KCl, 1 mM MgSO4 7H2O, dan sukrosa 10% (w / v) (pH disesuaikan sampai 7,5

menggunakan KOH). Bunga-bunga itu diambil dengan hati-hati dan serbuk sari biji-bijian
dipancarkan dengan sentrifugasi 3200 g selama 6 menit. Media lama dikeluarkan, pelet serbuk

sari dengan lembut ditunda ulang dengan 250 L segar (PGM), dan butiran serbuk sari

dipindahkan ke tabung kaca berukuran 13 100 mm, ditutupi pita mikropori 3M dan diatur

dalam kegelapan pada suhu 22 C. untuk 6 atau 24 jam.

Untuk isolasi RNA, serbuk sari dari 200 bunga WT terbuka dikumpulkan di PGM dalam

lima tabung. Serbuk sari dari 200 bunga secara langsung dipanen sebagai butiran serbuk sari

terhidrasi (0,5 h) atau tumbuh sebagai tabung serbuk sari selama 6 dan 24 jam. Biji serbuk sari
yang dihirup (0,5 h) digabungkan dan digiling dengan nitrogen cair menggunakan alu plastik dan

4
 Firda Liesdiana
Biomanajemen - 21317020
tabung mikro. Tabung serbuk sari tumbuh selama 6 jam dan 24 jam untuk isolasi RNA

dikumpulkan dengan sentrifugasi selama 6 menit pada 3.200 g dan digiling dalam tabung mikro-

sentrifugal. Isolasi RNA diulang dengan menggunakan tiga batch jaringan yang dikumpulkan

secara independen.

Fiksasi Jaringan dan Imunolabel

Jaringan tanaman yang baru dipotong dipelihara dalam buffer 25 mM sodium fosfat (pH

7.1) dengan 1,6% (b / v) paraformaldehida dan glutaraldehida 0,2% (b / v) semalam pada suhu

4 C. Dengan menggunakan microwave kelas laboratorium (PELCO BioWave Pro, Ted Pella,

CA) yang ditetapkan pada suhu 250 Watt, jaringan dicuci tiga kali selama 1 menit masing-

masing dengan buffer 25 mM sodium fosfat (pH 7.1) diikuti oleh dua pencucian dengan air.

Sampel kemudian menjalani serangkaian inkubasi gradien etanol 40-bit (35, 50, 75, 95, 100, 100,

dan 100% [v / v]) untuk mengeringkan jaringan. Sampel disusupi dengan resin pelembab LR

White yang dingin (Ted Pella) dengan resin gradien (1: 3, 1: 1, 3: 1: etanol [v / v]) dan akhirnya

tiga kali dengan resin 100%. Setiap langkah dilakukan di bawah vakum (20 "Hg) selama 2,5

menit. Setelah perubahan resin terakhir, sampel disimpan pada suhu 4 C selama 24 jam,

dipindahkan ke kapsul gelatin yang diisi dengan resin, dan dipolimerisasi di bawah sinar UV

365nm pada suhu 4 C selama 48 jam. Penampang jaringan (250 nm) dipotong dengan

ultramicrotome UC16 Leica EM (Leica Microsystems), dipasang pada slide pra-dilapisi

(Colorfrost / Plus, Fisher Scientific) dan digunakan untuk imunolabel atau diwarnai dengan

0,05% (b / v) toluidine blue untuk mikroskop cahaya.

Imunolabel untuk mikroskop fluoresen dilakukan seperti yang dijelaskan (Avci et al.,

2012 ). Untuk seri LM dan antibodi seri JIM, buffer pencuci yang mengandung 10 mM KPBS

(pH 7,2) dan 100 mM NaCl digunakan karena kami menemukan bahwa penggunaan NaCl 500

mM sangat mempengaruhi pengikatan antibodi ini secara konsisten. Antibodi sekunder yang
digunakan untuk seri LM dan JIM adalah Alexa fluor 488 IgG anti-tikus kambing (Cat #

5
 Firda Liesdiana
Biomanajemen - 21317020
A11006, Invitrogen) yang diaplikasikan pada bagian dengan cara yang sama seperti dijelaskan di

atas, namun diencerkan dengan pembersih pencuci garam rendah. Semua data yang ditampilkan

menggambarkan gambar representatif dari tiga gambar yang dilihat untuk setiap jenis bagian

jaringan yang diwarnai dengan masing-masing antibodi.

Mikroskop Elektron Transmisi

Bagian Ultrathin (80 nm) disiapkan menggunakan ultramicrotome (Leica EM UC6,

Austria) dan dikumpulkan pada grid nikel Formular. Grid diwarnai dengan 2% (w / v) uranyl

asetat selama 4 menit diikuti oleh 10 tetes dalam tiga perubahan air deionisasi dan dikeringkan

dengan wicking. Mikrograf dicatat pada film dalam mikroskop elektron transmisi JEOL 100S.

Negatif dikembangkan dan dipindai di Adobe Photoshop.

Untuk label imunogold, bagian ultrathin diblokir di TBS (buffer 10 mM Tris, 150 mM

NaCl, pH 7,5) yang mengandung 0,06% (b / v) serum albumin selama 30 menit pada suhu kamar

di piring petri dengan potongan terlipat Kimwipe yang dibasahi air ke satu sisi piring. Bagian

dipindahkan ke 10 L tetes antibodi primer yang diencerkan (1: 5) di TBS selama 1 jam. Setelah

dicuci tiga kali dengan mencelupkan grid (10 kali) di TBS, antibodi sekunder (IgG anti-tikus

kambing digabungkan menjadi emas 15 nm,) diencerkan 1:10 pada TB (buffer 10 mM Tris) yang
mengandung 0,06% (b / v) albumin serum sapi diterapkan pada bagian. Bagian dicelupkan ke

dalam TB dan air suling untuk dicuci dan dikeringkan dengan wicking. Gambar yang

ditampilkan mewakili empat gambar yang dilihat untuk setiap sampel yang diwarnai dengan

masing-masing antibodi.

6
 Firda Liesdiana
Biomanajemen - 21317020
Isolasi RNA batang dan analisis PCR kuantitatif

Bagian bawah jaringan batang dari jenis liar dan irx8 , di mana dinding sel sekunder

disintesis secara aktif, dilipat beku dalam nitrogen cair dan digiling menjadi serbuk halus di

nitrogen cair di mortir pra-dingin dengan alu. Total RNA diisolasi dari ~ 100 mg bubuk beku

dari tiga sampel jaringan individu dengan menggunakan RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, 74904).

CDNA untai pertama disintesis dari 1 g total RNA menggunakan campuran SuperSript III First

Strand Synthesis Super (Invitrogen, 18080-400) diikuti dengan analisis PCR kuantitatif

menggunakan iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad 170-8882) pada CFX96 Real-Time

PCR Detection System (Bio-Rad) mengikuti petunjuk dari pabriknya. Analisis kurva meleleh

dilakukan setelah masing-masing dijalankan untuk memastikan produksi amplikon ukuran

tunggal. Data rata-rata standar deviasi dari tiga sampel biologis. Data dianalisis seperti yang

dijelaskan (Livak dan Schmittgen, 2001 ). Urutan primer diberikan di Tabel Tambahan S1 .

Persiapan dinding sel (AIR)

Seluruh jaringan induk dipanen dari Col-0 berumur 7 minggu, irx8-5 , irx8-5 + GAUT12

, irx8-2 + GAUT12 , dan WT + GAUT12 , ditumbuk dengan adukan mortar dan alu ke bubuk

halus dalam nitrogen cair, kembali -suspended dalam etanol 80% (v / v) dan diputar dari ujung
ke ujung selama 12 jam. Pelet yang diperoleh pada sentrifugasi 4000 rpm secara berurutan dicuci

dengan etanol 80% (v / v), etanol 100%, kloroform: metanol (1: 1, v / v), dan aseton dengan

suspensi ulang, rotasi selama 12 jam, dan kembali sentrifugasi Residu larut alkohol yang

dihasilkan (AIR) yang dihasilkan dikeringkan selama 24 jam pada suhu kamar.

7
 Firda Liesdiana
Biomanajemen - 21317020
Komposisi komposisi Residu Glikosil

Analisis gula netral dilakukan seperti yang dijelaskan (Albersheim et al., 1967 ) dengan

sedikit modifikasi. Setiap sampel AIR (0,4 mg dengan 20 g myo -inositol sebagai standar

internal) dihidrolisis dengan 30 tetes asam trifluoroasetat 2 N (TFA) selama 2 jam pada 120 C.

Sampel didinginkan sampai suhu kamar dan dikeringkan di bawah aliran udara, dicuci dua kali

dengan isopropanol untuk menghilangkan TFA, dan dikurangi dengan inkubasi selama 1 jam

pada suhu kamar dalam 10 tetes natrium borohidrida (10 mg / ml) yang dilarutkan dalam larutan

amonium hidroksida 1 M. . Reaksi dipadamkan dengan 30-40 tetes aseton dan dikeringkan

dengan udara. Setelah volume dikurangi menjadi setengah, isopropanol (1 ml) ditambahkan ke

setiap sampel untuk memudahkan pengeringan. Oasasilasi dilakukan dengan menambahkan

250l anhidrida asetat diikuti oleh 230 l TFA pekat dan sampel diinkubasi selama 10 menit

pada suhu 50 C. Sampel kemudian dicuci dengan isopropanol dan dikeringkan dengan udara.

H2O (1 ml) dan diklorometana (DCM, 1 ml) ditambahkan dan sampel diortir dan disentrifugasi

untuk memungkinkan pemisahan fasa. Lapisan berair atas dibuang dan lapisan bawah DCM

yang mengandung turunan alditol asetat dikeringkan. Sepuluh tetes DCM ditambahkan ke setiap

sampel sebelum analisis dengan kromatografi gas-cair-deteksi ionisasi api menggunakan sistem

GC Agilent 7890A.

Untuk pengukuran GalA dan GlcA, sampel AIR (0,5 mg) dihidrolisis dalam 2N TFA

pada suhu 105 C selama 1 jam. Hidrolisis tersebut dikeringkan dengan aliran udara, dihidrolisis

kembali dalam HCl methanolik 3N (Thermo Scientific, Rockford, IL) semalam pada suhu 80 C,

dikeringkan secara terpisah dan dilarutkan dalam 100 l suling H 2 O. Sampel disentrifugasi dan

12,5 l supernatan hidrolisat dimasukkan ke kolom analisis CarboPac PA20 (3 150 mm,

Dionex, Sunnyvale, CA). Kolom yang terisi dicuci dengan larutan 49 mM NaOH, 20 mM

NaOAc dan dielusi dengan gradien linier dari 49 mM NaOH, 20 mM NaOAc sampai 40 mM
NaOH, 200 mM NaOAc selama 25 menit. Kolom dielusi pada suhu 30 C dan laju alir

8
 Firda Liesdiana
Biomanajemen - 21317020
0,4 ml /menit dan efluen dipantau dengan detektor ECD. Jumlah GalA dan GlcA ditentukan oleh

perbandingan daerah puncak dengan standar yang dipisahkan dalam kondisi yang sama.

Setiap analisis diulang lima kali untuk setiap sampel, dan bar mewakili rata-rata % mol

setiap residu gula standar kesalahan.

Ekstraksi berurutan dan Glycoma Profiling

Ekstraksi sekuensial sampel dinding sel dan profiling dilakukan seperti yang telah

dijelaskan sebelumnya (Demartini et al., 2011 ; Pattathil et al., 2012 ). Secara singkat, sampel

AIR diekstraksi secara berurutan dengan 50 mM amonium oksalat, pH 5; 50 mM natrium

karbonat [mengandung 0,5% (b / v) natrium borohidrida], pH 10; 1 M KOH dengan 1% (b / v)

natrium borohidrida; 4 M KOH dengan 1% (b / v) natrium borohidrida; 100 mM diasamkan

natrium klorit; dan akhirnya dengan 4 M KOH dengan 1% (b / v) natrium borohidrida untuk

ekstraksi pasca-klorit. Ekstrak dinding digunakan untuk analisis NMR dan diskrining oleh

ELISA menggunakan antibodi monoklonal yang diarahkan tanaman glycan (CCRC, JIM, dan

seri MAC) dari pusat Penelitian Karbohidrat Kompleks yang tersedia melalui Layanan

CarboSource (http: //www.carbosource.net ). Deskripsi terperinci masing-masing mAbs yang

digunakan dalam penelitian ini dapat ditemukan di Informasi Pendukung yang mencakup tautan
ke database web bernama Wall MAb DB ( http://www.wallmabdb.net ).

Pirolisa Molekuler Massa Spektrometri (pyMBMS)

Sekitar 4 mg sampel ditimbang dan dipindahkan ke dalam cangkir sampel stainless steel

80-l dari sebuah sampler otomatis dari pirolizer tembakan ganda (PY-2020iD, Frontier Ltd.).

Sampel dipolrolisis pada suhu 500 C dan residu dianalisis dengan menggunakan Spektrometer

Beam Massal Super Sonic Molekuler (Extrel Model MAX-1000).

9
 Firda Liesdiana
Biomanajemen - 21317020
Data spektral massa dari m/z 30-450 diperoleh pada Merlin Automation Data System

versi 3.3. Analisis multivariat dilakukan dengan menggunakan software Unscrambler versi 10.1

(CAMO). Intensitas puncak lignin dijumlahkan dan dirata-ratakan untuk memperkirakan

kandungan lignin dalam sampel (Evans dan Milne, 1987 ). Puncak lignin total berkorespondensi

dengan m / z 120, 124, 137, 138, 150, 152, 154, 164, 167, 168, 178, 180, 181, 182, 194, 208, dan

210. Puncak syringyl berhubungan dengan m / z 154, 167, 168, 182, 194, 208, dan 210, puncak

guaiakol berkorespondensi dengan m / z 124, 137, 138, 150, 164, dan 178, dan fenol puncak

sesuai dengan m/z 120 dan 122. Syringyl Rasio Guaiacol (S/G) ditentukan dengan

menjumlahkan puncak syringyl dan membagi dengan jumlah puncak guaiacol. Nilai lignin yang

dihasilkan dan dihitung dibandingkan dengan WT. Karena standar NIST (Standar Institut

Nasional dan Teknologi) untuk Arabidopsis tidak tersedia, persentase lignin dikoreksi dengan

menggunakan standar kayu kapas timur ( NIST 8492 ) untuk mendapatkan nilai persentase lignin

yang setara dengan klason lignin. Analisis ini dilakukan di Pusat Penelitian Karbohidrat Pusat

Penelitian Kompleks, University of Georgia

(http://www.ccrc.uga.edu/services/ccrcanalyticalservices/index.html).

Penentuan Komposisi Monomer Lignin dengan Spektroskopi HSQC NMR

Garam cair piridinium perdeuterasi (cairan ionik) disintesis seperti yang dijelaskan (Jiang

et al., 2009 ). Sekitar 2 mg ekstrak dinding sel ditimbang dan dilarutkan dalam 180 l cairan

ionik [DMSO- 6 / piridin 5 (2: 1, v / v)] pada 65 C. Data dikumpulkan pada suhu 60 C pada

spektrometer Drive Langsung Agilent 600 MHz yang dilengkapi dengan probe dingin 5 atau 3

mm. Program Pulse Agilent standar ("HSQCAD") digunakan untuk mendapatkan spektrum

berkorelasi heteronuklear 13 C- 1 H. Dimensi proton 1200 titik data kompleks meliputi 20 ppm

yang berpusat pada 6 ppm, dan dimensi karbon dari 48 atau 64 titik kompleks berpusat pada 92

ppm dengan lebar masing-masing 100 atau 184 ppm. Dalam kasus sebelumnya, beberapa
resonansi di daerah alkil atau aromatik dilipat sepanjang sumbu F1. Waktu akuisisi data total

10
 Firda Liesdiana
Biomanajemen - 21317020
berkisar antara 7 sampai 16 jam, dengan jumlah transien antara 240 dan 400 per t 1 kenaikan.

Data diolah dengan NMRPipe (NIH) dan divisualisasikan dengan NMRViewJ (One Moon

Scientific) atau dengan MNova (Mestrelab Research). Biasanya, fungsi jendela kosinus kuadrat

diterapkan pada kedua dimensi setelah pengisian nol dan prediksi linier pada t 1 . Pergeseran

kimia direferensikan ke DMSO pada 2,50 ppm dalam proton dan 39,51 ppm karbon. Korelasi

Single-Quantum Correlation Heteronuklir (HSQC) ditentukan dan dirujuk seperti yang

dijelaskan (Kim and Ralph, 2010 ).

Generasi kultur suspensi arabidopsis dan sel transgenik GAUT12-EGFP

Kultur suspensi Arabidopsis jenis liar dihasilkan dari kalus benih seperti yang telah dijelaskan

sebelumnya (Doelling dan Pikaard, 1993 ). Sel disubkultur setiap 10 hari dengan transfer 7 ml

sel yang dikemas ke dalam 100 ml media penghasil kalus segar (CIM). CIM mengandung 3,2 g /

L media baseg Gambaran B-5 dengan bahan organik minimal (Sigma-Aldrich G5893 atau

PhytoTechnology Laboratories G398), 2 mg / L 2,4-D, 0,05 mg / L kinetin, dan sukrosa 20 g / L

(pH 5.7). Konstruk GAUT12-EGFP diubah secara stabil menjadi sel kultur suspensi tipe liar
melalui strain Agrobacterium tumefaciens GV3101. Alikuot dari 1 ml sel yang dikemas dari

kultur empat hari dikultivasi dalam 8 ml CIM segar dengan 100 l sel Agrobacterium yang

menyimpan vektor GAUT12-EGFP yang tersuspensi kembali di CIM ke OD 600 0,8.

Agrobacteria sebelumnya dibudidayakan benih dalam semalam dengan media 3 ml YEP

ditambah dengan rifampisin 50 mg / L, kanamisin 50 mg / L, dan gentamisin 50 mg / L dan

dikulturkan kembali dalam 25 ml media YEP di atas. Ko-budaya dilakukan di petri-dish dalam 1

inci dalam kegelapan pada shaker gyrotory pada 130 rpm selama 24 jam. Sel-sel dikeluarkan dari
media co-budidaya dan dicuci tiga kali dengan CIM dan kemudian dengan CIM dilengkapi

11
 Firda Liesdiana
Biomanajemen - 21317020
dengan 500 mg / L sefotaksim dalam tabung elang 50 ml. Pada setiap pencucian, media lama

benar-benar dilepas dan 20 ml media baru diperkenalkan dan di vortex selama 30 detik. Sel

dicuci dilapisi ke CIM 0,6% (w / v) agar piring mengandung 300 mg / L sefotaksim dan 15 mg/L

hygromycin. Kalus transgenik tahan higromisin muncul dalam 2-3 minggu dan dipindahkan ke

piring media segar dan tumbuh hingga 4 minggu. Setelah dua sampai tiga siklus transfer, kalus

bebas dari Agrobacteria dan digunakan untuk memulai kultur suspensi. Bertahannya kalus

genotip, dan RT-PCR digunakan untuk menentukan tingkat ekspresi transkrip GAUT12-EGFP .

Transkrip GAUT12-EGFP tertinggi pada hari ke 5 dibandingkan dengan hari ke 2 dan 8. Oleh

karena itu, sel-sel dipanen pada hari ke 6 untuk persiapan mikrosom.

Persiapan Membran Mikrosomal

Selaput mikrosomal yang digunakan untuk uji aktivitas enzim disiapkan pada suhu 4 C

dengan modifikasi seperti yang dijelaskan (Orfila et al., 2005 ). Batang Arabidopsis (10 gram)

dipotong kecil-kecil, dilipat beku dalam nitrogen cair, dan dihomogenkan pada es dalam 20 ml

buffer homogenisasi pra-dingin yang mengandung 50 mM Hepes (pH 7,3), 0,4 M sukrosa, 0,1 M

sodium askorbat, 0,25 mM MnCl 2 , 25 mM KCl, 1% (w / v) polyvinylpyrrolidone (PVPP), dan

koktail inhibitor protease bebas EDTA (Roche) sampai jaringan bubur. Homogenate disaring

melalui tiga lapis miracloth dan filtrat yang disentrifugasi pada suhu 4 C selama 30 menit pada

4000 g untuk menghilangkan puing-puing sel dan sel utuh. Supernatan tersebut disentrifugasi

dengan cepat pada 110.000 g selama 1 jam, menghasilkan pelet mikrosom yang ditangguhkan

kembali pada es di buffer penyimpanan pra-dingin (buffer homogenisasi tanpa PVPP,

30 l buffer/gram fresh weight) dengan menggunakan homogenizer kaca. Total protein diukur

dengan menggunakan metode Bradford (Bio-Rad Protein Assay 500-0006) dengan BSA sebagai

standar. Aliquot dari microsomes digunakan secara langsung atau berkedip beku dalam nitrogen

cair dan disimpan pada suhu -80 C untuk digunakan kemudian dalam uji enzim dan percobaan
immunoprecipitation.

12
 Firda Liesdiana
Biomanajemen - 21317020
Generasi anti-GAUT12 Antibodi Poliklonal dan Western Blotting

Antibodi poliklonal anti-GAUT12 dihasilkan terhadap peptida sintetis yang sesuai

dengan residu asam amino GAUT12 101-114 (EQPLSEQELKGRSD) dan dimurnikan antigen di

atas kolom yang dikemas dengan antigenic-peptide (layanan melalui New England Peptide, http:

//www.newenglandpeptide.com/). Antibodi anti-GAUT12 yang dimurnikan tidak bereaksi silang

dengan GAUT1 atau GAUT7. Serum pra-imun tidak mengandung antibodi anti-GAUT12.

Antibodi anti-GAUT1 dan anti-GAUT7 dihasilkan sebelumnya (Sterling et al., 2006; Atmodjo et

al., 2011 ). Untuk western blotting, faktor pengenceran 1: 5000, 1: 10000, 1: 3000, dan 1: 2000

diterapkan untuk anti-GAUT12, anti-GAUT7, anti-GAUT1, dan anti-GFP (abcam, ab6556),

masing-masing. Entah antibodi sekunder anti-kelinci (RAD), antibodi sekunder anti-kelinci (FIS)

atau beta basa (B) yang diikuti oleh reaksi dengan substrat yang sesuai untuk menghasilkan

presipitat warna biru atau ungu pada pita protein target.

Imunopresipitasi GAUT12 untuk HG: uji enzim GALAT

Antibodi anti-GAUT12 yang dimurnikan (1,14 mg /ml) diinkubasi dengan Dynabeads

M-280 Sheep anti-Rabbit IgG (Invitrogen, 112-04D) dengan perbandingan 1:20 (v/v) selama 2

jam pada suhu 4 C pada sebuah tabung rotator dan manik-manik yang dikumpulkan pada
bantalan magnet dan dicuci tiga kali dengan PBS isotonik (pH 7,4, 139 mM NaCl, 5,5 mM Na 2

HPO4 , 1,2 mM NaH2PO4). Manik-manik itu kemudian dicuci sekali dengan penyangga

penyimpanan (lihat bagian persiapan mikrosom). Setiap reaksi mengandung 30 l butil

terkonjugasi anti-GAUT12 yang diinkubasi dengan ~ 500 g mikrosom Triton X-100 pada suhu

4 C selama 2 jam pada tabung rotator. Deterjen nonionik Triton X-100 (TX-100) telah

digunakan untuk melarutkan aktivitas Galat selama pemurnian GAUT1 dan GAUT7 (Doong dan

Mohnen, 1998 ; Sterling et al., 2006 ; Atmodjo et al., 2011 ). Konsentrasi 4% (v / v) TX-100

digunakan untuk menghomogenkan mikrosom batang WT di atas es dan mereka segera

13
 Firda Liesdiana
Biomanajemen - 21317020
diencerkan dengan buffer penyimpan hingga konsentrasi deterjen akhir 0,5% (v / v) untuk

inkubasi dengan anti-GAUT12- manik magnetik terkonjugasi.

Setelah inkubasi end-to-end 2 jam pada suhu 4 C, manik-manik dicuci dengan buffer

penyimpan pra-dingin pada es tiga kali dan manik-manik 30 l asli diganti kembali dalam buffer

penyimpanan 13 l pra-pendingin untuk setiap reaksi enzim. Immunoabsorbed-GAUT1

disiapkan dengan menginkubasi Dynabeads M-280 Sheep anti-Rabbit IgG dengan anti-GAUT7

anti serum dengan perbandingan 1: 3 (v / v) secara paralel seperti yang dijelaskan (Atmodjo et

al., 2011 ). Antibodi anti-GAUT7 sebelumnya ditunjukkan untuk immunoabsorb aktivitas

HG: Galat yang mengandung kompleks inti GAUT1-GAUT7 (Atmodjo et al., 2011 ).

HG: Uji aktivitas enzim GALAT

UDP-D- [14C] GalpA (aktivitas spesifik 180,3 mCi/mmol; 1 Ci = 37 GBq) disintesis

secara enzimatik dari UDP-D- [14C] GlcpA menggunakan UDP-D-GlcpA 4-epimerase seperti

yang dijelaskan (Atmodjo et al., 2011 ). HG: Aktivitas Galat diuji dalam 30-L reaksi yang

mengandung enzim (15 l total mikrosom, ~ 100 g protein total) atau 13 l manik-manik

immunoabsorbed, 50 mM Hepes (pH 7,3), 0,2 M sukrosa, 0,05% (b / v) BSA, 25 mM KCl, 1,9

mM MnCl2, 1 mM HG oligosakarida (disebut oligogalakturonida, OGA) dengan tingkat

polimerisasi (DP) 7-23, dan 6,9 M UDP- [14C] GalpA (aktivitas spesifik 180,3 mCi/mmol;

1 Ci = 37 GBq). Reaksi diinkubasi selama 3 jam pada suhu 29 C dalam rendaman air dan

diakhiri dengan penambahan 5 l NaOH 400 mM dengan vorteks. Seluruh reaksi (~ 35 l)

terlihat pada kotak kertas sekat 1 inci 2 yang telah diolah sebelumnya dengan cetylpyridinium

chloride (CPC) seperti yang dijelaskan (Sterling et al., 2005 ). Saringan yang terlihat

dikeringkan, dicuci 3 dalam 150 mM NaCl masing-masing selama 15 menit untuk

menghilangkan akses UDP- [14C] GalpA, dikeringkan, dan ditambahkan ke 4 ml koktail

ScintiVerse BD untuk penghitungan kilau.

14
 Firda Liesdiana
Biomanajemen - 21317020
Kromatografi cair-tandem mass spectrometry (LC-MS / MS)

Sebuah immunoprecipitation GAUT12 skala besar dilakukan untuk analisis LC-MS/MS.

Alikuot 500 l manik-manik magnetik konjugasi anti-GAUT12 diinkubasi pada suhu 4 C

semalam pada tabung rotator dengan mikrosom batang WT Arabidopsis (protein total 5 mg).

Mikrosom pada es dihomogenisasi dengan 4% (v / v) TX-100 dilengkapi dengan 200 mM NaCl,

100 mM NaOAc, dan 2 mM EDTA dan segera diencerkan dengan PBS sampai konsentrasi

deterjen akhir 0,5% (v / v) untuk inkubasi dengan manik-manik magnetik anti-GAUT12-

terkonjugasi. Manik-manik dicuci 5x dengan PBS (pH 7,4) dan manik-manik yang dipulihkan

didenaturasi dalam SDS 3% (w / v) dan dikurangi dalam 25 mM DTT. Bahan yang terikat pada

manik-manik dilepaskan oleh pemisahan magnetik dan dipisahkan oleh elektroforesis pada gel

SDS-PAGE 10%. Potongan gel yang sesuai dengan ukuran GAUT12 (antara 55 dan 70 penanda

protein KDa) dipotong dan trypsin dicerna dalam gel seperti yang dijelaskan (Atmodjo et al.,

2011). Sampel peptida dari proteolitik digestions dianalisis pada Agilent 1100 capillary LC (Palo

Alto, CA) dihubungkan langsung ke spektrometer massa perangkap ion linier LTQ (Thermo

Fisher, San Jose, CA). Fase gerak A dan B masing-masing adalah asam format formaldehida H 2

O-0,1% (v / v) dan asetonitril-0,1% (v / v). Peptida dielusi dari kolom C18 ke dalam

spektrometer massa selama gradien linier 80 menit dari 5 sampai 55% (v / v) fase gerak B pada
laju alir 4 l /menit. Instrumen ini ditetapkan untuk memperoleh spektrum MS / MS pada

sembilan ion prekursor yang paling melimpah. Spektrum massa tandem mentah yang dihasilkan

diubah menjadi format mzXML dan kemudian masuk ke daftar puncak menggunakan perangkat

lunak ReAdW diikuti oleh perangkat lunak mzMXL2Other (Pedrioli et al., 2004 ). Daftar puncak

dicari dengan menggunakan Maskot 2.2 (Matrix Science, Boston, MA).

15
 Firda Liesdiana
Biomanajemen - 21317020
Pencarian Database dan Identifikasi Protein

Sebuah database target dibuat menggunakan urutan Arabidopsis dijelaskan yang diperoleh dari

database protein. Database umpan (decoy) dibangun dengan membalik urutan dalam database

normal. Pencarian dilakukan terhadap database normal dan umpan menggunakan parameter

berikut: penuh tryptic pembelahan enzimatik dengan dua kemungkinan perpecahan terjawab,

toleransi peptida 1000 ppm, toleransi ion fragmen 0,6 Da. Modifikasi tetap ditetapkan sebagai

carbamidomethyl karena carboxyamidomethylation residu sistein (57 Da) dan modifikasi

variabel dipilih sebagai oksidasi residu metionin (16 Da) dan deamidasi residu asparagin (1 Da).

Protein statistik signifikan dari kedua pencarian ditentukan pada protein tingkat 1% palsu

penemuan (FDR) menggunakan algoritma ProValT, seperti yang diterapkan dalam ProteoIQ

(BioInquire, LLC, Athens, GA) (Weatherly et al., 2015)

HASIL

GAUT12 diperlukan untuk Anther Dehiscence

Sebelumnya Persson dkk. (2007) telah menggambarkan mutan irx8 sebagai semi steril

(irx8-1 dan irx8-2 ) yang memiliki filamen antera lebih pendek, serbuk sari lebih sedikit daripada

jenis liar, dan tidak ada biji (Persson et al., 2007). Memang, penulis tidak dapat memulihkan

benih dari tanaman irx8-2 atau irx8-5. Mutan kerdil lainnya dengan fenotipe xilem yang roboh,

terutama irx9 dan parvus-3, memiliki antiserum yang tidak mengikat yang melepaskan serbuk
sari (Supplemental Figure S4) dan menghasilkan benih dengan kondisi pertumbuhan yang sama.

Hal ini diyakini bahwa IRX9 terlibat dalam pemanjangan tulang belakang xylan dan GAUT12

bersama dengan PARVUS / GATL1 yang terlibat dalam biosintesis XRES (Brown et al.,

2007a,b; Pea et al., 2007 ). Hasilnya menunjukkan bahwa fungsi GAUT12 setidaknya pada

lapisan sel endothecium yang penting untuk dehidrasi antera, berbeda dari IRX9 dan PARVUS /

GATL1 dalam hal sintesis xylan dan lignin dan pengendapan. Sebagai alternatif, anter

16
 Firda Liesdiana
Biomanajemen - 21317020
dehiscence pada mutan irx9 dan parvus-3 dapat disebabkan oleh ekspresi gen fungsional

berlebihan pada lapisan sel endotheium.

Pengurangan lignin di dinding sel antera irfa, bersama dengan pengurangan xilan yang

dikenali oleh LM10 dan LM11 di dinding sel endotheium, berkontribusi pada kurangnya

penebalan dinding sekunder pada irx8 lapisan endothecium. Akibatnya, ketegangan yang relatif

rendah selama dehidrasi dinding antera menyebabkan antera yang tidak diinginkan pada mutan

irx8 . Butir serbuk sari yang dihasilkan oleh irx8, walaupun ukurannya lebih kecil, tetapi dapat

dilakukan saat pelepasan manual dan mampu menyuburkan pocet heterozigot wild type dan irx8.

Selanjutnya, pemupukan manual pistil tipe liar dengan pollen heterozigot irx8 menunjukkan

bahwa serbuk sari irx8 memiliki viabilitas yang sama terhadap serbuk sari jenis liar. Dengan

demikian, fungsi GAUT12 tidak penting untuk kelangsungan hidup serbuk sari dan pemupukan.

Analisis transkripsi dan proteomik yang dipublikasikan sebelumnya dari serbuk sari dan tabung

serbuk sari belum mendeteksi transkrip GAUT12 atau protein dalam jaringan ini (Wang et al.,

2008 ; Zou et al., 2009 ). Namun, dengan menggunakan RT-PCR kuantitatif, kami mendeteksi

ekspresi GAUT12 yang rendah pada butiran serbuk sari terhidrasi dan tabung serbuk sari

memanjang, menunjukkan peran potensial GAUT12 dalam serbuk sari, mungkin terkait dengan

ukuran serbuk sari.

Kurangnya fungsi GAUT12 Menghasilkan jJumlah yang Dikurangi dan Mengubah

Ekstrabilitas G Lignin di bBatang Arabidopsis

Jurnal ini mengidentifikasi pengurangan lignin dalam detil imunohistokimia mutasi dan

imunohistoksi irama, pyMBMS, dan 2D13C-1H HSQC NMR untuk mengkarakterisasi ini.

Fenotip mutan secara rinci serta mempelajari kemungkinan hubungan antara lignin dan deposisi

xilan. Pada analisis semi-kuantitatif 2D13C-1H HSQC NMR, hanya sejumlah trace H dan S lignin

yang ditemukan dalam ekstrak klorit dari WT, irx8-5 , dan irx8-5 + GAUT12. Sinyal lignin,

bagaimanapun, diidentifikasi dalam ekstrak oksalat, karbonat, 1 M dan 4 M KOH dari kedua WT
dan irx8 , dengan sinyal utama terletak pada ekstrak MOH 1 M. Hasil ini menunjukkan bahwa H

17
 Firda Liesdiana
Biomanajemen - 21317020
lignin terdapat pada fraksi dinding pektin dan hemiselulosa. Kehadiran H lignin dalam fraksi

pektin konsisten dengan pengamatan bahwa H lignin diendapkan pada lamella tengah dan sudut

dinding sel (Donaldson, 2001) dan karenanya diekstraksi dengan pektin. Pengamatan bahwa

sebagian besar sinyal H lignin ditemukan pada fraksi 1 M KOH menunjukkan bahwa bagian H

lignin ini secara langsung atau tidak langsung (misalnya melalui pektin) yang terhubung ke KOH

xylan atau xiloglucan yang dilubangi dalam fraksi ini, atau bahwa H lignin terhubung melalui

hubungan ester alkali-labil (Balakshin et al., 2011), dan dengan demikian, diekstraksi dalam

buffer alkali. Hubungan spesifik antara hemiselulosa / pektin / lignin, namun , remai n yang akan

ditentukan. Sinyal lignin dalam irx8 tampak sedikit lebih menonjol daripada di WT, mungkin

karena jumlah xilan yang lebih rendah dalam ekstrak MOH 1 M irx8, menghasilkan peningkatan

lignin pada berat xylan. perbandingan. Jumlah total H lignin dalam irx8 , bagaimanapun, serupa

dengan WT seperti yang ditentukan oleh pyMBMS. Dengan demikian, hasilnya tidak

mendukung peran GAUT12 dalam menghasilkan struktur yang dibutuhkan untuk pengendapan

lignin H.

Diperkirakan bahwa ekstraksi klorit yang dilakukan dalam penelitian ini dapat

menghilangkan 50-80% total lignin berdasarkan studi tentang efisiensi perlakuan natrium klorit

asam dalam menghilangkan lignin pada pohon cemara hitam, switchgrass, dan poplar (Ahlgren

dan Goring, 1971). ; Kumar et al., 2013 ). Oleh karena itu, sinyal lignin yang diamati pada
ekstrak klorit dan PC4MKOH oleh HSQC NMR kemungkinan adalah bagian dari residu lignin

(20-50%) yang diperoleh dari setiap ekstraksi pada, atau setelah, perlakuan natrium klorit. Ini

mungkin menjelaskan mengapa kita tidak mengidentifikasi sinyal lignin S di semua fraksi,

walaupun tidak jelas apakah S lignin tersusun dari molekul yang lebih kecil dan terkuras selama

ekstraksi dan dialyses sekuensial. G lignin di WT diidentifikasi sebagian besar dalam ekstrak

klorit dan PC4MKOH, yang menunjukkan bahwa sebagian G lignin terkait dengan polisakarida

dinding melalui ikatan alkali-tahan, seperti seperti benzil eter dan fenil glukosida, dan bahwa

hanya kondisi keras seperti natrium klorit asam yang mampu menurunkan keterkaitan ini. Dalam
irx8 , fraksi klorit hampir habis dari sinyal lignin G.. Anehnya, sebagian besar sinyal lignin irx8

18
 Firda Liesdiana
Biomanajemen - 21317020
G, walaupun jumlahnya jauh berkurang dibandingkan dengan WT, ditemukan pada ekstrak

MOH 1 M, fraksi dinding yang dilepaskan sebelum perlakuan klorit asam, dengan jelas

menunjukkan adanya ekstraksi G lignin yang berubah pada mutan irx8 . Namun tetap tidak

diketahui apakah ada bagian G lignin dalam mutan irx8 yang tidak tahan terhadap perlakuan

klorit asam dan karenanya akan dikeluarkan selama dialisis berikutnya. Secara keseluruhan

hasilnya konsisten dengan pengurangan pewarnaan phloroglucinol-HCl dari penampang batang

irx8 dan penurunan kadar monomer G lignin yang diidentifikasi oleh pyMBMS. Hasil kami

menunjukkan bahwa dalam mutan irx8, baik (i) G lignin menghubungkan diri mereka sendiri

atau (ii) polimer yang mengikat G lignin sebagian basa-labil, dan karenanya, lebih mudah

diekstraksi dari dinding dalam mutan ini daripada pada WT.

Interdependensi lignin, pektin dan xilan pada biogenesis dinding

Efek pleiotropik irx8 pada xylan, lignin, dan pektin selama pembentukan dinding

sekunder menegaskan bahwa biogenesis dinding normal bergantung pada interaksi antara

polimer dinding sel yang berbeda dan menunjukkan bahwa mungkin ada urutan yang diperlukan

dimana mereka disimpan di muro . Lignifikasi, yang menciptakan resin yang relatif kaku dan

tidak kedap dalam jaringan polisakarida dinding, telah diusulkan terjadi dalam dua tahap yang

berbeda. Di dinding primer tampak bahwa deposisi lignin dimulai sejak pembentukan lamella
tengah di pelat sel, diikuti oleh deposisi pada sudut dinding sel - urutan yang telah diambil untuk

menyiratkan adanya kemungkinan inisiasi / nukleasi pektin. situs untuk deposisi lignin dinding

primer (Donaldson, 2001). Data kami menunjukkan bahwa persimpangan trisellular serat

Arabidopsis digabungkan dengan HG yang tidak diesterifikasi terhadap HG rendah, sebagaimana

diakui dalam bentuk segitiga yang solid dengan antibodi anti-HG CCRC-M38 dan JIM5.

Persimpangan segitiga trisellular ini juga mengandung sejumlah kecil HG yang diesterifikasi

tinggi seperti yang diberi label oleh JIM7. RG-I backbone, seperti yang diakui oleh CCRC-M14,

tampak hadir ke lapisan luar segitiga HG ini, di mana pelabelan dengan antibodi ini diamati
sebagai segitiga kosong pada persimpangan triselular. Lignin di daerah persimpangan triselular

19
 Firda Liesdiana
Biomanajemen - 21317020
ini diwarnai dengan kuat untuk kedua G dan S lignin dalam serat irx8), menunjukkan bahwa

proses ini tidak mungkin dipengaruhi oleh mutasi pada GAUT12 . Pada tahap kedua lignifikasi,

lignin dinding sel sekunder diendapkan dalam tipe sel yang terdiferensiasi secara spesifik,

terdiferensiasi (Donaldson, 2001). Kami menunjukkan dengan pewarnaan kolorimetrik bahwa

kedua G dan S lignin berkurang dalam pembuluh xilem irx8 dan sel serat, tampaknya karena

pengurangan ketebalan dinding pada sel-sel ini. G lignin dalam irx8 berkurang secara signifikan,

dan dilepaskan pada ekstrak MOH 1 M dan bukan pada ekstrak klorit dan PC4MKOH sebagai

terjadi pada WT, menunjukkan kemungkinan korelasi antara pengurangan xilan dan perubahan

lignin pada irx8 . Kami juga menemukan penurunan yang signifikan dalam ekspresi empat enzim

biosintesis lignin utama (C4H, C3'H, CCoAOMT1, dan COMT1) yang dapat menyebabkan

berkurangnya produksi prekursor lignin dalam irx8. Hasil ini konsisten dengan penurunan total

lignin di dinding irx8 , terutama melalui pengurangan G lignin. Data kami mendukung proposisi

bahwa formasi lignin diturunkan dalam mutan xylan yang cacat, dan fungsi GAUT12 yang

berkurang mempengaruhi pengendapan xylan dan lignin.

Telah dilaporkan bahwa hilangnya subunit selulosa sintase utama CESA3 pada mutan

eli1 dikaitkan dengan pengendapan lignin ektopik dan peningkatan respons pertahanan (Cano-

Delgado et al., 2003), yang ditafsirkan sebagai upaya oleh sel untuk mempertahankan sel.

integritas dinding Sebaliknya, penurunan lignin diamati pada mutan irx8 , dan dilaporkan juga
pada mutan irx7 dan irx9 (Petersen et al., 2012). Pengamatan ini menunjukkan bahwa hilangnya

polisakarida matriks menyebabkan reduksi lignin pada mutan irx tersebut dan menunjukkan

bahwa polisakarida matriks memberikan fungsi struktur yang berbeda dari selulosa selama

lignifikasi. Pengurangan lignin dalam mutan irx8 dapat menjadi efek sekunder karena hilangnya

~ xilan xilan pada irx8 , karena hubungan antara xylan dan lignin telah dilaporkan. Sebagai

contoh, 4- O- methylglucuronoxylan adalah karbohidrat utama yang terkait dengan lignin dalam

kayu (Yuan et al., 2011) dan xylan dan lignin dihubungkan melalui fermentasi ester pada jagung

(Grabber et al., 2000). Hubungan lignin-karbohidrat yang tepat pada mutan irx8 saat ini sedang
diselidiki.

20
 Firda Liesdiana
Biomanajemen - 21317020
Fungsi GAUT12 diperlukan untuk Membentuk Struktur Lamellate di Dinding Sel

Sekunder

Pola lamellate-like yang sesuai dari pelabelan xylan di dinding sel serat liar pada

imunolabel dengan antibodi terpilih xylan yang dipilih. Hasil ini menunjukkan bahwa

pengendapan struktur xilan yang berbeda mungkin terjadi. LM10 dan LM11 mengikat xylo-

oligomer sekecil disakarida, sementara pengikatan CCRC-M149 memerlukan struktur xylotriose

yang tidak tersubstitusi, dan CCRC-M138 dan CCRC-M160 memerlukan xylopentaose yang

tidak tersubstitusi untuk pengenalan (S. Pattathil, U. Avci, dan MG Hahn, hasil yang tidak

dipublikasikan). Pada sel serat liar, label LM10 lebih kuat di sisi dinding serat yang berdekatan

dengan sel yang berdampingan, dan pelabelan menurunkan intensitas ke sisi lumen dinding.

LM11 memiliki keseluruhan pola pelabelan bertitik yang menutupi seluruh dinding sekunder

pada sel serat CCRC-M137 dan CCRC-M149 menunjukkan label yang sebanding dan relatif

bahkan di sepanjang dinding serat. Keempat antibodi tersebut telah mengurangi labeli ng di

dinding sel serat irx8 karena salah satu dari jumlah epitop yang dikurangi yang dikenali oleh

antibodi ini atau untuk mengurangi ketebalan dinding. Sel serat di GAUT12 - dilapisi ( irx8 +

GAUT12 ), bagaimanapun, menunjukkan pemulihan parsial pola pelabelan WT dengan LM10,

LM11, dan CCRC-M137. Meskipun serat irx8 + GAUT12 memiliki dinding yang lebih tebal

daripada irx8 , intensitas pelabelan yang lebih rendah (yaitu kerapatan epitop) dengan LM10,
LM11, dan CCRC-M137 pada serat irx8 + GAUT12 menyerupai mutan irx8. Sebaliknya,

CCRC-M149 memberi label pada dinding yang lebih tipis dengan serat irx8 dengan intensitas

yang sama (yaitu kepadatan epitop) pada tanaman irx8 dan irx8 + GAUT12 dibandingkan

dengan tanaman WT, yang menunjukkan bahwa xilan kaca CCRC-M149 secara tidak langsung

dapat dipengaruhi oleh irx8 mutasi. Dengan kata lain, pengurangan label CCRC-149 pada

dinding serat irx8 kemungkinan disebabkan oleh ketebalan dinding yang berkurang dan

kerapatan epitop yang tidak berkurang.

21
 Firda Liesdiana
Biomanajemen - 21317020
Pola pelabelan yang paling menarik diamati dengan menggunakan antibodi CCRC-M138

dan CCRC-M160, yang menunjukkan pola pelabelan cincin ganda di dinding sel serat liar. Pola

tersebut menunjukkan bahwa tengah Lapisan dinding sekunder tipe serat liar antara cincin ganda

berlabel mengandung xylan (seperti yang diakui oleh CCRC-M149) dengan daerah xylan yang

tidak tersubstitusi lebih sedikit seperti yang diakui oleh CCRC-M138. Cincin ganda masih ada di

dinding sel serat irx8 , seperti juga terlihat jelas di sudut sel, namun telah runtuh di dinding sel

serat irx8 karena ketebalan lapisan tengah material dinding berkurang. Selain itu, tekstur

pelabelan CCRC-M138 pada dinding serat irx8 berbeda dari pada WT. , menunjukkan dinding

sekunder yang terorganisir kembali dengan konfigurasi deposisi xilan yang diubah pada mutan

irx8. Hal ini juga tercermin dalam pola ekstraksi xilan yang telah diubah pada irx8 yang diamati

dengan profil penguji, yang menunjukkan bahwa secara signifikan lebih sedikit xylan diekstraksi

dalam ekstrak amonium oksalat-, natrium karbonat, dan 1 M KOH di dinding mutan irx8

dibandingkan dengan dinding WT. Tidak jelas mengapa pelabelan CCRC-M138 sedikit tidak

merata pada garis komplementer GAUT12. Penjelasan yang mungkin adalah bahwa promotor

35S mendorong ekspresi tidak konsisten dari GAUT12 yang mengarah pada produksi yang tidak

merata dari epitop xilan yang sesuai.

Pola imunolabeling dinding sel pada penampang sel serat yang diperoleh dengan

menggunakan enam antibodi monoklonal yang reaktif terhadap epitop xylan yang beragam
mengindikasikan bahwa GAUT12 diperlukan untuk pembentukan lapisan mengandung xilan

tengah yang terletak di antara lamella-proksimal (tengah lamella-proksimal) dan bagian dalam

(membran plasma-proksimal) lapisan xilan. Ketiga lapisan ini terlihat jelas pada penampang sel

serat WT yang diberi imunolabel menggunakan antibodi LM11, CCRC-M138 dan CCRC-M160.

Immunolabeling penampang sel serat dari mutan irx8 menunjukkan hilangnya lapisan yang

mengandung xilanium tengah dan keruntuhan lapisan xilan dalam dan luar satu sama lain.

Karena beberapa antibodi yang diarahkan xylan memberi label pada lapisan tengah, begitu juga

lapisan xilan luar dan dalam (misalnya CCRC-M137 dan CCRC-M149), jelas bahwa lapisan
tengahnya berisi xilan. Dengan demikian, kurangnya lapisan tengah, dan retensi lapisan xilan

22
 Firda Liesdiana
Biomanajemen - 21317020
luar dan dalam, meskipun dalam pola terputus-putus dalam mutan irx8 , menunjukkan bahwa

GAUT12 diperlukan untuk menghasilkan arsitektur xylan WT dan bahwa, dengan tidak adanya

GAUT12, Arsitektur ini tidak dibuat atau ambruk. Hasil saat ini tidak menjelaskan apakah

pengurangan xilan pada mutan irx8 disebabkan oleh ketidakmampuan pabrik untuk membuat

subfraksi xilan yang memerlukan GAUT12 untuk sintesis, atau lebih tepatnya, apakah tidak

adanya GAUT12 menghasilkan arsitektur xilan yang berubah yang menyebabkan akumulasi

xylan surplus yang bertindak sebagai sinyal negatif untuk meregulasi sintesis xilan.

Fungsi GAUT12

Pengurangan Galida -1,4-linked dalam pecahan endopolygalacturonase / pektin

metilesterase (EPG / PME) -bahan yang dapat diakses dari dinding mutan irx8 meningkatkan

kemungkinan bahwa GAUT12 terlibat dalam sintesis senyawa yang belum ditentukan Spesies

HG HG yang bergantung pada GAUT12 dapat dikaitkan erat dengan xylan dan bila hilang,

mengganggu biogenesis dan / atau pengendapan xylan (Persson et al., 2007). Pektin dan / atau

xylan yang bergantung pada GAUT12 mungkin selanjutnya menjadi fondasi dimana G lignin

terakumulasi.

Baru-baru ini, Tan et al. ( 2013 ) menemukan struktur dinding sel baru yang diisolasi dari

kultur sel suspensi Arabidopsis yang diberi nama ARABINOXYLAN PECTIN

ARABINOGALACTAN PROTEIN1 (APAP1), yang berisi proteoglikan unik dengan xilan yang
terhubung dengan peregangan RG-I yang diapit oligomer HG pendek (Tan et al. , 2013 ).

Meskipun kita tunjukkan dalam penelitian ini bahwa GAUT12 tampaknya tidak memiliki HG

GAUT1-like: Aktivitas Galat, yaitu, GAUT12 tidak mengkatalisis penambahan GalA dari UDP-

-GalA ke akseptor oligogalacturonide (DP 7-23, fungsi yang mungkin untuk GAUT12 adalah

sintesis sub-domain HG semacam itu dengan menggunakan sub-domain RG-I (oligomer) sebagai

primer untuk sintesis struktur mirip APAP1 di dinding serat. Hipotesis ini konsisten dengan

penurunan yang signifikan pada Xyl dan GalA di dinding sel induk irx8 dan dengan peningkatan

imunolabel lapisan dinding serat dengan antibodi reaktif RG-I CCRC-M14. Meskipun tidak ada
perubahan yang nyata dalam komposisi residu glikosil dinding saat GAUT12 terlalu banyak

23
 Firda Liesdiana
Biomanajemen - 21317020
diekspresikan dalam latar belakang WT, ekspresi over GAUT12 dapat menyebabkan

peningkatan produksi sub-domain RG-I / HG yang dapat membebani kapasitas mesin biosintesis

xylan, yang menghasilkan akumulasi bahan reaktif CCRC-M14 pada membran plasma seperti

yang diamati pada dinding sel serat WT + GAUT12.

Sebagai alternatif, pengurangan mutan irx8 dari urutan akhir xilan mengurangi [XRES, -

d -Xyl p - (1 3) -- lhaR - p (1 2) -- d -Gal p A - (1 4) - d -Xyl p ] menyebabkan

spekulasi bahwa GAUT12 dapat mengkatalisis penambahan GalA ke XRES yang baru lahir

(Pea et al., 2007 ). Namun, tetap tidak diketahui bagaimana sintesis XRES dimulai atau apakah

ia bertindak sebagai primer atau terminator selama biosintesis xylan (York dan O'Neill, 2008 ).

GAUT12 tampaknya tidak memiliki homolog fungsional pada monokotil yang mencurigakan

(Caffall et al., 2009 ; Yin et al., 2010 ). Tidak adanya XRES pada spesies rumput yang diperiksa

sampai saat ini (Kulkarni et al., 2012 ) akan konsisten dengan fungsi GAUT12 dalam sintesis

struktur ini. Sejauh ini, bagaimanapun, kami tidak dapat menunjukkan bahwa GAUT12

menambahkan GalA ke XRES. Diperlukan penelitian lebih lanjut untuk mengidentifikasi fungsi

enzimatik GAUT12, serta perannya dalam hubungan karbohidrat-lignin.

Singkatnya, kami menunjukkan bahwa GAUT12 memiliki peran dalam ketidaknyamanan

antera dan mempengaruhi jumlah G lignin dan koneksinya terhadap xilan dalam bahasa

Arabidopsis. Pekerjaan kami menunjukkan bahwa mutasi pada glikosiltransferase tunggal

menyebabkan perubahan pada xilan, pektin, dan lignin, sehingga memberikan bukti lebih lanjut

untuk kemungkinan asosiasi atau hubungan antara polimer dinding yang berbeda. Meskipun

aktivitas katalitik GAUT12 masih harus ditentukan, kami telah menunjukkan bahwa GAUT12

bukanlah HG: Galat dengan spesifisitas substrat yang sebanding dengan GAUT1 dan bahwa

produk GAUT12 dapat terhubung ke struktur yang mengandung RG-I dan yang diperlukan untuk

native Arsitektur xylan di dinding sel sekunder.

24