Isolasi gen bgl dari R.

miehei TEKNIK KLONING

Pemilihan host cell dan vektor
SEDERHANA PADA
BAKTERI
Isolasi plasmid
Strategi Kloning Gen -glukosidase dari
Memperbanyak gen bgl Rhizomucor miehei dengan menggunakan
vektor pUC19 pada Sel Inang E. Coli strain
Penyisipan gen bgl ke vector (modifikasi, restriksi, dan
ligasi)
DH5
KELOMPOK 10
Transformasi DELFINA, MUHAMMAD YUSUF ARYA, NABILA HANA DHIA, RIZKI LARASATI

Mengapa E. Coli DH5 ? Rentang efisiensi yang

Seleksi dan screening tinggi > 106 ke> 109 cfu / g, memiliki lacZM15 untuk
White/Blue Screening, recA1 menjamin peningkatan
stabilitas dan mencegah rekombinasi yang tidak
Protein assay (mengecek apakah gen bgl terekspresi
atau tidak) diinginkan, endA1 meningkatkan hasil dan kualitas
DNA plasmid dibuat
ISOLASI GEN -GLUKOSIDASE
Menentukan strain R. miehei yang ingin digunakan
DARI RHIZOMUCOR MIEHEI (NRRL 5282)

Start Mengisolasi strain R. miehei yang ingin digunakan dari habitatnya

Kodon tanah atau bahan organik yang mengalami fermentasi atau
pengomposan (kompos, feses ternak, dan lainnya).

Total length = 4,063 bp Mengkultur strain R. miehei yang ingin digunakan pada media
yang cocok (media cair glukosa-ekstrak ragi5 g/L ekstrak
ragi dan 20 g/L glukosa) pada suhu 37C dengan pengocokan
kontinu 200 rpm selama 3 hari

Mengambil sebagian spora (miselia) untuk dikultur kembali,

sebagian lagi untuk diekstrak DNAnya.

Memurnikan DNA dalam 0,5 mg/ml

Bukan stop bisbenzimide-CsCl
kodon
TAHAPAN ISOLASI PLASMID pUC19
Kelebihan pUC19:
Dapat dilakukan blue-
white screening

Dapat diinsers hingga 10

ribu pasangan basa

Memiliki fragmen N-
terminal gen beta-
galaktosidase dari LacZ
E.coli

Memiliki antibiotic yang

resistan terhadap ampicilin

Memiliki ukuran yang

relative kecil (2686kb)
 TAHAPAN MEMPERBANYAK GEN -
GLUKOSIDASE
Analisis sekuens gen -Glukosidase memberikan dua primer BGL1 dan BGL2
yang dapat diamplifikasi melalui PCR (Tako et al. 2010)
Seluruh sekuens gen -Glukosidase serta apitan hulu dan hilir dapat dikenali
melalui metode inverse PCR (Ochman et al. 1988)
STRATEGI PENYISIPAN GEN - MODIFIKASI GEN -
GLUKOSIDASE KE PLASMID pUC19 GLUKOSIDASE
Forced cloning menghindari DNA insert disisipkan DESAIN PRIMER, mengandung:
dalam orientasi (arah) yang salah. dengan situs restriksi 18-21 pasangan basa gen
yang banyak ini, dilakukan dengan menggunakan vektor diampilifikasi
yang dipotong dengan 2 enzim yang berbeda
Teknik PCR modifikasi gen bgl agar memiliki situs restriksi
yang diinginkan disesuaikan dgn plasmid Situs restriksi enzim restriksi tidak
memotong wilayah dalam DNA insert
Pemilihan Situs Restriksi pada vektor pUC19 dan sesuai dengan situs restriksi
plasmid resipien/ vektor. KpnI dan
SphI
Penambahan situs restriksi dan pada ujung -
Glukosidase

Pemotongan gen -Glukosidase dengan enzim restriksi

KpnI dan SphI

Pemotongan plasmid dengan enzim restriksi KpnI dan
SphI
Ligasi ujung plasmid dengan gen
Sekuens Tambahan meningkatkan
efisiensi pemotongan dan tidak
membentuk palindromes dan primer
dimer: TAAGCA
 Design primer yang baik:
DESAIN PRIMER Tm diantara 65-75oC
GC content = 40-60%
3-6 nukleotida ditambahkan di
Forward pimer: ujung 5 enzim
5-TAAGCAGGTACCATGCTGCTTTGACTGCGC-3 restriksimeningkatkan efisiensi
cutting
Reverse primer GC Content = 53.33%
Tm = 67 oC
Susunan awal:
5GCAGCCCGGGGGATCCAC TAA GCATGC TAAGCA 3
Reverse-complement: GC Content = 58%
5TGCTTA GCATGC TTA GTGGATCCCCCGGGCTGC-3 Tm = 69.4 oC
Proses PCR
3-CGTCGGGCCCCCTAGGTG

ATGCTGCTTTGACTGCGC GCAGCCCGGGGGATCCAC
TACGACGAAACTGACGCG CGTCGGGCCCCCTAGGTG

ATGCTGCTTTGACTGCGC-3
PENYISIPAN GEN -GLUKOSIDASE KE PLASMID PUC19
Hasil PCR: TAAGCAGGTACC CGTACGACGAAT
ATTCGTCCATGG GCATGCTGCTTA
Pemotongan Hasil PCR dengan enzim restriksi KpnI dan SphI
C C
CATGG
Sekuens bgl GCATG
Pemotongan plasmid dengan enzim restriksi yang sama
(+alkaline fosfatmencegah
self-ligation)

Produk PCR diligasi secara langsung ke dalam molekul vektor

yang mempunyai overhanging C residue T7 DNA ligase
(cocok untuk menyambung ujung nick)
 Strategi Penyisipan Plasmid pUC19 yang mengandung gen
bgl ke Escheria coli strain Dh5
TEKNIK TRANSFORMASI SELEKSI ANTIBIOTIK
Teknik transformasi teknik heat Berdasarkan pemetaan vektor puc19 dapat
shock,Alasannya: menggunakan seleksi antibiotik
Ukuran plasmid yang ditransformasi tidak mengandung gen ampR dan screening blue-
terlalu besar (pUC19 + 4kb) white karena terdapat gen penyandi laktosa,
Tidak memakan biaya besar LacZ.
Dapat menambahkan volume DNA jika Ampisilin dilakukan untuk menyeleksi sel yang
konsentasinya terlalu rendah tidak berhasil ditransformasikan (tidak ada
Efisiensi heat-shock dapat ditingkatkan vektor di dalamnya).
dengan menggunakan sel yang sangat Apabila sel tidak berhasil dimasuki vektor,
kompeten (mis produk DH5) atau
maka sel tersebut tidak mengandung gen
penambahan -Mercaptoethanol (-ME) di
resisten ampisilin AmpR, sehingga ketika sel itu
akhir proses dapat meningkatkan efisiensi
transformasi pUC19 ke E. coli strain Dh5 diletakkan pada medium yang mengandung
meningkat sebesar 140%. ampisilin maka sel tersebut akan mati
 BLUE-WHITE
Insert disisipkan di
Enzim ini memecah
pertengahan gen
substrat X-gal
lacZ yang
menjadi galaktosa &
SCREENING merupakan penyandi
lacZ- subunit dari
enzim -
pre-chromophore 5-
bromo-4-kloro-3-
Ada kemungkinan host dimasuki plasmid yang hidroksindole
galaktosidase
mengalami self-ligation terdapat antibiotik

selanjutnya dioksidasi IPTG menginduce

menjadi 5,5- ekspresi LacZ, karena
dibromo-4,4-dikloro- represor LacI tidak
indigo yang dapat menempel
berwarna biru pada operator lac.

jika insert berhasil

disisip (diligasi)
Gen lacZ utuh
dengan vektor gen
koloni bakteri
lacZ terdisrupsi &
berwarna biru akibat
tidak mampu
pengaruh zat warna
menghasilkan indigo
indigo yang
berwarna biru
dihasilkan.
koloni berwarna
putih.
Protein assay (mengecek apakah b-Glucosidase dapat menghidrolisis
karbohidrat pada bagian residu non-

gen bgl terekspresi atau tidak) reducing b(14) D-glucose dengan

menghasilkan D-glucose..

Preparasi sampel
Sampel ditambahkan 50mM buffer phosphate pada ph 7
Senyawa yang harus dihindari karena dapat mengganggu
aktivitas enzim: reagen yang mengandung thiol (SH) (cth:
dithiothreitol, 2-mercaptoethanol, dan glutathione), Ca2+,
Cu2+, Fe3+/Fe2+, Hg2+, Mg2+, Ni2+, Zn2+, SDS, Triton X-
100, TWEEN, digitonin, EDTA, dan Tris.
Prosedur:
1. Transfer 20 mL aquades ke 2 well pada clear 96 well
plate dan tambahkan 200 mL air pada well 1 dan 200 mL
kalibrator ke well yang lain
2. Preparasi Master Reaction Mix (pada tabel 1)
3. Tambahkan 20 mL sampel ke well yang berbeda
Pada assay ini, aktivitas -glucosidase ditentukan oleh
4. Tambahkan 200mL Master Reaction Mix ke well sampel kemampuan menghidrolisis p-nitrophenyl--D-
5. Mengukur absorbansi awal pada 405 nm (A405)initial glucopyranoside menghasilkan warna pada A405 nm
6. Inkubasi sampel pada suhu ruangan 1 unit b-Glucosidse adalah sejumlah enzim yang
7. Setelah 20 menit, ukur absorbansi akhir (A405)final. mengatalis hidrolisis 1.0 mmol substrat/menit pada pH 7.0.

Sumber: http://www.sigmaaldrich.com/