PEWARNAAAN MIKROORGANISME

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat
yang khas begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan
kontras dengan air, dimana sel-sel tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati
bentuk sel bakteri sehingga mudah diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau
pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu
mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan. Teknik pewarnaan
bakteri dapat dibagi menjadi dua jenis, yaitu:
Pewarnaan Sederhana
Pewarnaan Differensial

1. Pewarnaan Sederhana
Pewarna yang paling umum digunakan ialah pewarna sederhana, disebut
demikian karena hanya digunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut.
Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena
sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk
pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan
positif)
Pewarnaan sederhana ini memungkinkan dibedakannya bakteri dengan bermacam-
macam tipe morfologi (kokus, basilus, vibrio, spirilium, dan sebagainya) dari bahan-bahan
lainnya yang ada pada olesan yang diwarnai. Disamping itu dapat pula diamati struktur-
struktur bakteri seperti endospora. Berbeda dengan spesimen hidup, sel-sel yang diwarnai
terfiksasi pada kaca obyek sehingga dapat disimpan sebagai dokumentasi untuk jangka
waktu lama.
Beberapa zat warna yang banyak digunakan adalah metilen biru (30-60 detik), ungu
kristal (10 detik) dan fuchsin karbol (5 detik)
Prosedur Pewarnaan Sederhana:
1. Bersihkan preparat gelas dengan alkohol 70 % kemudian difiksasi di atas bunsen.
2. Beri label pada bagian bawah preparat gelas.
3. Pijarkan jarum ose kemudian dicelupkan ke aquades dan teteskan 3 ose aquades
pada preparat gelas menggunakan jarum ose.
 4. Pijarkan lagi jarum ose dan diambil bakteri dari media dengan cara aseptik lalu
letakkan di atas preparat gelas
5. Keringkan
6. Teteskan larutan zat warna methylen blue sebanyak 1 atau 2 tetes
7. Keringkan selama 1 menit
8. Cuci dengan air mengalir
9. Keringkan preparat dengan di anginkan, dan
10. Amati dibawah mikroskop karakteristik dan bentuk bakteri

2. Pewarnaan differensial
Pewarnaan differensial adalah pewarnaan yang menggunakan lebih dari satu
macam zat warna, contohnya pewarnaan gram, pewarnaan tahan asam, pewarnaan flagella,
pewarnaan endospora, pewarnaan kapsul, dan pewarnaan negatif.
a. Pewarnaan Gram
Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metodde empiris untuk
membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram
negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding selnya. Pengujian ini berguna untuk
mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel
mereka.
Dalam pewranaan gram diperlukan 4 reagen yaitu:
Zat warna utama (violet kristal).
Mordan (larutan iodine) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan
warna utama.
Pencuci/peluntur zat warna (alcohol/aseton) yaitu solven organic yang digunakan
untuk melunturkan zat warna utama.
Zat warna kedua/cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel
yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan dengan alkohol.
Bakteri garam negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil
ungu pada metode pewarnaan gram. Sebaliknya, bakteri gram positif adalah bakteri yang
mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan gram.
Prosedur Pewarnaan Gram:
1. Bersihkan gelas preparat menggunakan tisu dan alkohol, kemudian keringkan.
 2. Teteskan 3 ose aquades pada glass preparat.
3. Letakkan bakteri di atas aquades tersebut secara aseptis.
4. Keringkan dengan cara fiksasi
5. Tetesi gram A dan tunggu 1 menit.
6. Setelah itu cuci dengan air mengalir dan keringkan kembali.
7. Setelah kering tetesi dengan gram B dan tunggu 1 menit.
8. Cuci dengan air mengalir dan keringkan.
9. Tetesi dengan gram C dan tunggu 30 detik
10. Cuci dengan air mengalir dan keringkan.
11. Tetesi dengan gram D dan tunggu 2 menit.
12. Cuci dengan air mengalir dan keringkan.
13. Amati dengan mikroskop.

b. Pewarnaan Tahan Asam

Pewarnaan tahan asam ditujukan terhadap bakteri yang mengandung lemak dalam
konsentrasi tinggi sehingga sukar menyerap zat warna, namun jika bakteri diberi zat warna
khusus misalnya karbol fuchsin melalui proses pemanasan, maka akan menyerap zat warna
dan akan tahan diikat tanpa mampu dilunturkan oleh peluntur yang kuat sekalipun seperti
asam alkohol. Karena itu bakteri ini disebut bakteri tahan asam (BTA). Ada beberapa cara
pewarnaan tahan asam, namun yang paling banyak adalah cara menurut Ziehl-Neelsen.
Prosedur pewarnaan tahan asam menurut Ziehl-Neelsen:
1. Larutan carbol fuchsin 0,3 % dituang pada seluruh permukaan sediaan
2. Kemudian difiksasi diatas nyala api sampai keluar asap tetapi tidak sampai mendidih
atau kering.
3. Sediaan kemudian dibiarkan dingin selama 5-7 menit lalu kelebihan zat warna
dibuang.
4. Dicuci dengan air yang mengalir perlahan.
5. Setelah itu larutan asam alkohol 3 % (hydrochloric acid-ethanol) dituang pada
sediaan dan dibiarkan 2-4 menit.
6. Di cuci dengan air mengalir selama 1-3 menit, kelebihan larutan dibuang.
7. Larutan methylen blue 0,1% dituang sampai menutup seluruh permukaan, dibiarkan
1 menit lalu larutan dibuang.
 8. Dicuci dengan air mengalir, kemudian sediaan dikeringkan di udara.
9. Setelah kering, sediaan diamati dibawah mikroskop.

c. Pewarnaan Flagel
Pewarnaan flagel digunakan untuk mengetahui ada tidaknya flagel dan letak flagel
pada bakteri. Metode yang digunakan pada pewarnaan ini adalah Gray. Hasil dari
pewarnaan ini adalah sel bakteri akan berwarna merah ungu, sedangkan flagel akan
berwarna merah ungu muda.
Cara pewranaan flagel / Gray:
1. Dibuat sediaan kemudian ditetesi larutan Beitz selama 7-10 menit.
2. Dicuci di masukkan ke dalam lempeng berisi karbol fuchsin 1 %.
3. Diletakkan di atas dua batang gelas pendek selama 5 menit.
4. Selaput fuchsin yang terdapat pada sediaan dihilangkan dengan di tiup dan
kemudian di keringkan pada suhu kamar.

d. Pewarnaan Endospora
Spora bakteri (endospora) tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan biasa,
diperlukan teknik pewrnaan khusus. Pewarnaan Klein adalah pewarnaan spora yang paling
banyak digunakan. Endospora sulit diwarnai dengan pewarnaan gram. Pewarnaan spora
juga dapat dilakukan dengan cara Schaffer-Fulton.
Prosedur pewarnaan spora dengan cara Schaffer-Fulton:
1. Dibuat suspensi bakteri dengan NaCl fisiologis sebanyak 1 ml.
2. Tambahkan malachiet green 1 ml.
3. Dipanaskan di atas api kecil selama 6 menit.
4. Dibuat sediaan dari suspensi tersebut lalu difiksasi.
5. Sediaan ditetesi dengan H2SO4 1% selama 2-3 detik.
6. Cuci dengan air kran pelan-pelan.
7. Ditetesi dengan larutan safranin 0,5 % biarkan selama 4 menit.
8. Dicuci dengan air kran pelan-pelan dan keringkan.
9. Setelah kering, tetesi dengan minyak imersi.
10. Lakukan pengamatan dibawah mikroskop.
Hasil pewarnaan: spora berwarna hijau, bakteri berwarna merah.
 e. Pewarnaan Kapsul
Pewarnaan ini menggunakan larutan kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat
sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan
dengan air dapat melarutkan kapsul. Gram tembaga juga memberi warna pada latar
belakang, yang berwarna biru gelap.
Pewarnaan kapsul menggunakan dua reagen sebagai berikut:
1. Kristal violet 1% sebagai pewarna dasar yang akan mewarnai kapsul dan dinding sel.
2. Tembaga sulfat (CuSO4.5H2O) 20% sebagai reagen pencuci warna dasar dan
sekaligus menjadi pewarna lawan karena warna dari reagen pencuci akan meresap
dan diikat oleh kapsul pada saat warna dasar habis tercuci, sehingga kapsul akan
berwarna biru muda dan sel akan berwarna violet. Digunakan CuSO4 sebagi pencuci
karena kapsul mudah larut dalam air.

f. Pewarnaan Negatif
Tujuan pewarnaan negatif adalah untuk mengamati morfologi organisme yang sukar
diwarnai oleh pewarna sederhana. Bakteri tidak diwarnai, tapi mewarnai latar belakang.
Ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarnai, seperti Spirochaeta. Pewarnaan negatif
memerlukan pewarna asam seperti cosin atau nigrosin. Dengan pewarnaan ini akan dapat
dilihat bentuk dan susunan sel-sel bakteri.
Prosedur pewarnaan negatif:
1. Bersihkan gelas preparat menggunakan tissu dan alkohol.
2. Beri label pada glass preparat bagian tepi bawah.
3. Tetesi nigrosin pada bagian tepi.
4. Letakkan masing-masing bakteri (E.coli dan Bacillus) di atas nigrosin dengan cara
aseptik.
5. Buat apusan satu arah menggunakan gelass preparat lain yang telah dibersihkan.
6. Keringkan dengan cara fiksasi.
7. Amati menggunakan mikroskop.

Karakteristik Mikroba Yang Digunakan Untuk Pewarnaan

 Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel
bakteri tersebut disuspensikan. Teknik pewarnaan sel bakteri merupakan salahsatu cara
untuk identifikasi mikroba. Pewranaan ini juga berfungsi untuk mengetahui sifat
fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri.
Struktur di dalam sel pada tempat-tempat yang dibentuk oleh spesies ini, disebut
endospora. Endospora dapat bertahan hidup dalam keadaan kekurangan nutrien, tahhan
terhadap panas, kekeringan, radiasi UV serta bahan-bahan kimia.
Karakteristik sifat sel bakteri yang transparan dan tidak berwarna serta ukurannya
yang sangat kecil membuat metode pewarnaan ini sangat diperlukan untuk penelitian-
penelitian mikrobiologi.

Karakteristik Zat Warna Yang Digunakan Untuk Pewranaan Mikroba

Teknik pewranaan bakteri dapat dibagi menjadi dua jenis, yaitu:
Pewarnaan Sederhana
Pewarnaan Differensial
Pewarnaan sederhana adalah metode pewarnaan dengan menggunakan satu jenis
zat warna untuk mewarnai organisme tersebut. Zat-zat warna yang digunakan untu
pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin. Pewarnaan basa yang biasanya digunakan
untuk pewranaan sederhana adalah:
Metilen biru
Kristal violet
Karbol fuchsin
Peluntur cat yang dugunakn untuk mendapat kontras yang baik pada bayangan
mikroskop, antara lain:
- Bahan peluntur untuk lemak: air, aceton, alcohol.
- Bahan peluntur untuk cat basa: HCl, H2SO4, HNO3, dan sebagainya.
- Bahan peluntur untuk cat asam: KOH encer, sabun.
- Garam-garam logam berat: AgNO3, CuSo4, dan sebagainya.
- Garam-garam logam ringan: Na2SO4, MgSO4, dan sebagainya.