I.

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Dalam melakukan diagnosa Mikrobiologi sterilisasi sangat diutamakan baik alat maupun
medianya. Suatu alat dikatakan steril apabila alat atau bahan bebas dari mikroba baik dalam
bentuk vegetative maupun spora. Untuk itu sebagai pemula dalam Mikrobiologi sangat perlu
mengenal teknik sterilisasi, pembuatan media serta teknik penanaman.
Secara umum sterilisasi merupakan proses pemusnahan kehidupan khususnya mikroba
dalam suatu wadah ataupun peralatan laboratorium. Sterilisasi dalam Mikrobiologi adalah suatu
proses untuk mematikan semua mikroorgansime yang terdapat pada atau didalam suatu benda.
Ada tiga cara utama yang umum dipakai dalam sterilisasi yaitu penggunaan panas, penggunaan
bahan kimia, dan penyaringan (filtrasi). Apabila panas digunakan bersama-sama dengan uap air
maka disebut sterilisasi basah, bila tanpa kelembaban maka disebut sterilisasi kering.
Untuk membutuhkan dan mengembangbiakkan mikroba diperlukan suatu substrat yang
disebut medium. Sedangkan medium itu sendiri sebelum digunakaan harus dalam keadaan steril
artinya tidak ditumbuhi oleh mikroba lain yang tidak diharapkan agar mikroba dapat tumbuh dan
berkembangbiak dengan baik di dalam medium, maka diperlukan syarat tertentu yang diantaranya
bahwa didalam medium harus terkandung semua unsur hara yang diperlukan untuk pertumbuhan
dan perkembangan mikroba kemudian susunan makanannya, tekanan osmosis, derajat, keasaman
(pH), dan temperatur.
Dalam bidang penelitian mikroorganisme ini, tentunya menggunakan teknik atau cara-cara
khusus untuk mempelajarinya dan bekerja pada skala laboratorium untuk meneliti mikroorganisme
ini baik sifat dan karakteristiknya, tentu diperlukan pula tentang bagamana caranya menumbuhkan
suatu mikroba ke dalam suatu media, karena kita tahu bahwa beragamnya persyaratan tumbuh
mikroba, maka harus dimengerti jenis-jenis nutrient yang disyaratkan oleh mikroba dan juga
macam lingkungan fisik yang menyediakan kondisi yang optimum bagi pertumbuhannya. Mikroba
amat beragam, baik dalam persyaratan nutrient maupun fisiknya. Jadi, media yang digunakan
harus mengandung komponen-komponen yang dibutuhkan oleh mikroba tersebut.
1.2. Tujuan

Tujuan dari praktikum ini adalah untuk menyiapkan media tumbuh mikroorganisme yang

steril.

II. TINJAUAN PUSTAKA

Medium ialah suatu bahan yang terdiri atas campuran nutrisi (zat makanan) yang dipakai
untuk menumbuhkan mikroba termasuk bakteri patogen tanaman. Selain itu menumbuhkan
mikrobia medium dapat digunakan pula untuk isolasi, memperbanyak, pengujian sifat-sifat
fisiologi dan perhitungan jumlah mikroba (Khaeruni dan Satrah, 2014).
Medium harus mengandung nutrien yang merupakan substansi dengan berat molekul rendah
dan mudah larut dalam air. Nutrien ini adalah degradasi dari nutrien dengan molekul yang
kompleks. Nutrien dalam medium harus memenuhi kebutuhan dasar makhluk hidup, yang meliputi
air, karbon, energi, mineral dan faktor tumbuh (Label, 2008)
NA (Nutrien Agar) adalah medium yang digunakan sebagai media pertumbuhan bakteri. NA
di buat dengan komposisi agaragar yang sudah dipadatkan sehingga NA juga bisa disebut sebagai
nutrisi padat yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri. Fungsi agaragar hanya sebagai
pengental namun bukan zat makanan pada bakteri, agar dapat mudah menjadi padat pada suhu
tertentu. Medium Nutrient Agar adalah salah satu medium padat yang memiliki komposisi yaitu
agaragar yang telah di panaskan dan mencair dengan suhu 950C (Sandra, 2013).
PDA (Potato Dextrose Agar) merupakan media yang sangat umum yang digunakan untuk
mengembangbiakkan dan menumbuhkan jamur dan khamir. Komposisi Potato Dextrose Agar ini
terdiri dari bubuk kentang, dextrose dan jugaagar. Bubuk kentang dan juga dextrose merupakan
sumber makanan untuk jamur dan khami. Potato Dextrose Agar juga bisa digunakan untuk
menghitung jumlah mikroorganisme menggunakan metode Total Plate Count. Perindustrian
seperti industri makanan, industri produk susu dan juga kosmetik menggunakan PDA untuk
menghitung jumlah mikroorganisme pada sample mereka.Karena fungsinya yang dapat
mengembangbiakkan jamur, sekarang ini PDA juga banyak digunakan oleh pembudidayan jamur
 seperti jamur tiram. Untuk memaksimalkan pertumbuhan bibit jamur, biasanya pembudidaya
mengatur kondisi pH yang rendah (sekitar 3,5) dan juga menambahkan asam atau antibiotik untuk
menghambat terjadinya pertumbuhan bakteri (Sugianto, 2012).
Sterilisasi merupakan metode praktis yang dirancang untuk membersihkan dari
mikroorganisme,atau sengaja untuk menghambat pertumbuhannya. Mikroorganisme sangat
berbeda, dalam kelemahannya terdapat berbagai macam agen antimikroba. Sterilisasi dengan
panas adalah unit operasi dimana bahan dipanaskan dengan suhu yang cukup tinggi dan waktu
yang cukup lama untuk merusak mikroba dan aktivitas enzim. Sebagai hasilnya, bahan yang
disterilkan akan memiliki daya simpan lebih dari enam bulan pada suhu ruang. Contoh proses
sterilisasi adalah produk olahan dalam kaleng seperti kornet, sarden dan sebagainya (Irianto,
2006).

4.2 Pembahasan
Nutrient Agar (NA) merupakan suatu medium yang berbentuk padat, yang merupakan
perpaduan antara bahan alamiah dan senyawa-senyawa kimia. NA dibuat dari campuran ekstrak
daging dan peptone dengan menggunakan agar sebagai pemadat. Dalam hal ini agar digunakan
sebagai pemadat, karenasifatnya yang mudah membeku dan mengandung karbohidrat yang berupa
galaktam sehingga tidak mudah diuraikan oleh mikroorganisme.

Nutrien Agar(NA) digunakan sebagai media pertumbuhan bakteri, Pembuatan medium

percobaan ini dengan menggunakan NA (Nutrien Agar), di mana dalam
pembuatanya adalah menimbang media sintetis Nutrien Broth sebanyak 9 gr, kemudian
menimbang agar sebanyak 20 gr setelah menimbang selanjutnya mencampurkan kedua bahan
kedalam gelas kimia berukuran 1000 ml yang telah terisi air aquades sebanyak 1000 ml, kemudian
aduk larutan dengan menggunakan magnetic stirrer guna menghomogenkan kedua bahan, setelah
bahan homogen masukkan kedalam botol schoot dan sterilisasi dengan
menggunakan Autoclave. Hasil yang didapatkan yaitu larutan agar tampak bening agak keemasan
seperti terlihat pada gambar.
Potato Dextrose Agar (PDA) Merupakan media komplek dan media diferensiasi untuk
pertumbuhan jamur dan yeast sehingga sering digunakan sebagai uji untuk menentukan jumlah
jamur dan yeast dengan menumbuhkan mikroba pada permukaan sehingga akan membentuk
koloni yang dapat diikat dan dihitung (Fardiaz, 1993). Selain itu PDA (Potato Dextrose Agar) juga
digunakan untuk pertumbuhan, isolasi dan enumerasi dari kapang serta khamir pada bahan
makanan dan bahan lainnya.
PDA (Potato Dextrose Agar) digunakan untuk menumbuh kancendawan. Pada pembuatan
PDA menggunakan media sintetis Potato Dekstrosa Broth sebanyak 24 gr dana agar
sebanyak 20 gr, kemudian kedua bahan dicampurkan kedalam gelas kimia 1000 ml yang telah
berisi aquades sebanyak 1000 ml selanjutnya homogenkan kedua bahan dengan
menggunakan magnetic stirrer setelah itu masukan kedalam botol schoot dan sterilisasi dengan
mengunakan Autoclave.Hasil yang didapatkan yaitu larutan bening serta kuning kemerahan seperti
pada gambar.
Media EMBA ( Eosin Methylen Blue Agar ) mempunyai keistimewaan mengandung
laktosa dan berfungsi untuk memilih mikroba yang memfermentasikan laktosa seperti
staphylococcus aureus, P. aerugenosa dan salmonella. Mikroba yang memfermentasikan laktosa
akan menghasilkan koloni dengan inti berwarna gelap dengan kilap logam. Sedangkan mikroba
lain yang dapat tumbuh koloninyan tidak berwarna. Adanya eosin dan methylen blue membantu
mempertajam perbedaan tersebut. Namun demikian, jika media ini digunakan pada tahap awal
Karena kuman lainnya juga tumbuh terutama P. aerugenosa dan salmonella sp. Dan dapat
menimbulkan keraguan. Emba yang menggunakan eosin dan methylen blue sebagai indicator
memberikan perbedaan yang nyata antara koloni yang meragikan laktosa dan tidak meragikan
laktosa.
Pembuatan media EMBA yaitu dengan menimbang media sintesis
EMBA sebanyak 37,5 gr, Dicampurkan kedalam gelas kimia 1000 ml yang telah berisi aquades
sebanyak 1000 ml selanjutnya homogenkan bahan dengan menggunakanmagnetic stirrer setelah
itu masukan kedalam botol schoot dan sterilisasi dengan mengunakan Autoclave,SehinggaHasil
yang didapatkan yaitu larutan berwarna gelap dengan kilap logam seperti pada gambar.
Bakteri aerob adalah bakteri yang membutuhkan oksigen untuk hidupnya. Jika tidak ada
oksigen, bakteri akan mati. Bakteri aerob menggunakan glukosa atau zat organik lainnya seperti
etanol untuk dioksidasi menjadi CO2, H2O, dan sejumlah energi. Contoh-contoh bakteri aerob
adalah Nitrobacter, Nitrosomonas, Methanimonas (pengoksidasi metan), Nitrosococcus,
Acetobacter, Hydrogemonas, Nocardiaasteroides (penyebab penyakit paru-paru), Thiobacillus
thiooxidans.
Bakteri anaerob fakultatif adalah bakteri yang dapat hidup dengan baik. baik itu dengan
oksigen atau tanpa oksigen. Contoh-contoh bakteri anaerbo fakultatif adalah Streptococcus,
Aerobacter aerogenes, Escherichia coli, Lactobacillus, Alcaligenesis. Sedangkan Bakteri anaerob
obligat adalah bakteri yang tidak membutuhkan oksigen dalam hidupnya, Jika ada oksigen bakteri
tersebut akan mati. Contoh-contoh bakteri anaerob obligat adalah Prevotella
melaninogenica(menyebabkan abses pada rongga mulut dan faring), Clostridium
tetani (menyebabkan kejang otot), Peptostreptococcus (menyebabkan abses otak dan abses
saluran kelamin wanita), Methanobacterium (menghasilkan gas metana), danBacteroides
fragilis (menyebabkan abses atau tumpukan nanah di usus).
Uji media aerob dan anaerob dilakukan dengan
menggunakan bahan pepton sebanyak 2,0 grdan menambahkan larutan NaCl 5,0 gr serta larutan
KH2PO4 sebanyak 20 gr dengan Bromothymol blue (1%) 3,0
gr), kemudian semua bahantersebut dicampurkan kedalam gelas kimia 1000 ml yang telah berisi
aquades sebanyak 1000 ml, selanjutnya dihomogenkan kedua bahan dengan
menggunakan magnetic stirrer setelah itu masukan kedalam botol schoot dan sterilisasi dengan
mengunakan Autoclave, Sehingga Hasil akhir yang didapatkan yaitu larutan berwarna hitam
kecoklatan seperti yang terlihat pada gambar.

Bakteri Amilolitik merupakan mikroorganisme yang mampu memecah pati menjadi menjadi
senyawa yang lebih sederhana, terutama dalam bentuk glukosa. Kebanyakan mikroorganisme
Amilolitik tumbuh subur pada bahan pangan yang banyak mengandung pati atau karbohidrat,
misalnya pada berbagai jenis tepung. Kebanyakan jenis mikroorganisme amilolitik adalah kapang,
tetapi beberapa jenis bakteri juga ada, jenis yang mempunyai spesies bersifat Amilolitik
misalnya Clostridium butyriciumdan Bacillus subtilis.

Pembuatan media Uji Amilolitik yaitu menggunakan Nutrien Broth sebanyak 9 gr, agar 20 gr,
dan menambahkan 15%Starch/pati, kemudian semuabahan tersebut dicampurkan kedalam gelas
kimia 1000 ml yang telah berisi aquades sebanyak 1000 ml selanjutnya homogenkan kedua bahan
dengan menggunakan magnetic stirrer setelah itu masukan kedalam botolschoot dan sterilisasi
dengan mengunakan Autoclave, SehinggaHasil yang didapatkan yaitu larutan agar
tampak jernihagak kekuningan seperti pada gambar.
Bakteri proteolitik adalah bakteri yang memproduksi enzim protease ekstraseluler, yaitu
enzim pemecah protein yang diproduksi di dalam sel kemudian dilepaskan keluar dari sel. Semua
bakteri mempunyai enzim protease di dalam sel, tetapi tidak semua mempunyai enzim protease
ekstraseluler. Dekomposisi protein oleh mikroorganisme lebih kompleks daripada pemecahan
karbohidrat dan produk akhirnya juga lebih bervariasi. Hal ini disebabkan struktur protein yang
lebih kompleks. Mikroorganisme melalui suatu sistem enzim yang kompleks, memecah protein
menjadi senyawa-senyawa yang lebih sederhana.
Pembuatan media Uji Proteolitik yaitu menggunakan bahan Nutrien Broth sebanyak 9 gr,
agar 20 gr, dan menambahkan 15% Skim Milk. kemudian semua bahan tersebut dicampurkan
kedalam gelas kimia 1000 ml yang telah berisi aquades sebanyak 1000 ml
selanjutnya di homogenkan kedua bahan dengan menggunakan magnetic stirrer setelah itu
masukan kedalam botol schoot dan sterilisasi dengan mengunakan Autoclave, Sehingga Hasil
yang didapatkan yaitu larutan berwarna kuning keruh seperti yang terlihat pada gambar.
Sterilisasi adalah proses penghilangan semua jenis organisme hidup, d a l a m h a l
i n i a d a l a h m i k r o o r g a n i s m e ( p r o t o z o a , f u n g i , b a k t e r i , m y c o p l a s m a , virus)
yang terdapat dalam suatu benda. Perhitungan waktu sterilisasi autoklaf dimulai ketika suhu
di dalam autoklaf mencapai 121 C. Jika objek yang disterilisasi cukup tebal atau banyak, transfer
panas pada bagian dalam autoklaf akan melambat, sehingga terjadi perpanjangan waktu
pemanasan total untuk memastikan bahwa semua objek bersuhu 121 C untuk waktu 10-15
menit.Medium yang akan disterilkan ditempatkan di dalam autoclave selama 15-20 menit, hal ini
bergantung pada banyak sedikitnya barang yang perlu disterilkan. Medium yang akan disterilkan
ditempatkan dalam beberapa botol yang agak kecil daripada dikumpul dalam satu botol yang besar.
Setelah pintu autoclave ditutup rapat, barulah kran pada pipa uap dibuka dan temperatur akan
terus-menerus naik sampai 121oC.
 DAFTAR PUSTAKA
Irianto, K. 2006. Mikrobiologi Jilid 1. Yrama Widya: Bandung.
Khaeruni, A dan V. N. Satrah. 2014. Penuntun Praktikum Mikrobiologi Dasar :
Fakultas Pertanian UHO. Kendari.
Label, J. 2008, Mikrobiologi : Pembuatan Medium, Erlangga : Jakarta.
Sandra, 2013, Mikrobiologi Umum, Erlangga : Jakarta.
Sugianto, 2012, Pembuatan Medium, UGM : Yogyakarta.

II TINJAUAN PUSTAKA
Cara sterilisasi yang dipakai tergantung pada macamnya bahan dan sifat bahan yang
disterilkan (ketahanan terhadap panas, bentuk yang disterilkan, padat, cair ataupun gas).
Penyelidikan suatu spesies mikroorganisme selalu didasrkan atas sifat biakan murni dari spesies
mikroorganisme tersebut. Oleh karena itu, untuk dapat memisahkan kegiatan mikroorganisme yang
satu dengan yang lain atau untuk memelihara mikroorganisme secara biakan murni, perlu
digunakan alat-alat dan medium yang steril (Muhiddin, 2007).
Metode sterilisasi antara lain sterilisasi fisik, kimia dan mekanik. Sterilisasi fisik dipakai bila selama
sterilisasi dengan bahan kimia tidak akan berubah akibat temperatur tinggi atau tekanan tinggi. Cara
membunuh mikroorganisme tersebut adalah dengan panas. Panas kering membunuh bakteri karena
oksidasi komponen komponen sel. (Volk, 2005).
Dalam dunia kesehatan, sterilisasi sangatlah penting dilakukan untuk memberikan efek terapeutik
yang maksimal. Steril artinya bebas dari segala mikroba baik patogen maupun tidak. Sterilisasi
merupakan suatu proses membebaskan suatu peralatan atau bahan dari mikroorganisme yang tidak
dikehendaki. Sterilisasi dalam mikrobiologi merupakan proses penghilangan semua jenis organisme
hidup, dalam hal ini adalah mikroorganisme (protozoa, fungi, bakteri, mycoplasma, virus) yang
tedapat pada atau di dalam suatu benda. Proses ini melibatkan aplikasi biocidal agent atau proses
fisik dengan tujuan untuk membunuh atau menghilangkan mikroorganisme (Pratiwi, 2008).
Dasar makanan yang paling baik bagi pemiaraan baakteri ialah medium yang mengandung zat
zat organik seperti rebusan daging, sayur sayuran, sisa sisa makanan atau ramuan ramuan
yang dibuat oleh manusia. Medium yang banyak digunakan dalam pekerjaan rutin di laboratorium
ialah kaldu cair dan kaldu agar. Medium ini tersusun daripada : kaldu bubuk 3 gram, pepton 5 gram,
air suling 1000 gram (Dwidjoseputro, 2005).

B. Pembahasan
Sterilisasi dan penyiapan media adalah salah satu proses yang sangat penting dalam penelitian
tentang mikroorganisme. Sebab kedua factor ini adalah kunci utama kesuksesan dal;am tahap
pengamatan. Kita ketahui bahwa dialam semesta ini banyak sekali bertebaran mikroorganisme,
mereka hampir terdapat disemua tempat. Tidak heran jika kita bisa terkontaminasi dimana saja,
meskipun kita menganggap tempat tersebut sudah steril. Dalam proses praktikum sebelum kita
menuju kepersiapan media, maka yang harus kita lakukan lebih dahulu adalah sterilisasi.
Pembuatan media percobaan ini dengan menggunakan NA (Nutrien Agar), dimana dalam
pembuatannya terlebih dahulu dengan cara menimbang bahan yang akan digunakan kedalam
timbangan analitik sesuai dengan jumlah yang diperlukan yaitu 5,6 gram, kemudian memasukkan
bahan kedalam Erlenmeyer dimana bahan tersebut adalah aquades 250 ml, NA 5,6 gram,setelah itu
dipanaskan diatas hot plate selama 15 menit atau sampai mendidih dan di ikuti oleh pengadukan
dengan menggunakan magnetic strirrer, tujuan dari pemanasan dan pengadukan ini adalah untuk
menghomogenkan atau pemercepat pelarutan, dan juga mengaduk medium selama sedang
dipanaskan agar tidak terjadi penggumpalan pada NA dengan aquades saat dipanaskan, hot plate
digunakan untuk pemanasan dan dapat mempercepat pelarutan dari Na dan Aqades. Setelah
dipanaskan selama beberapa menit larutan berubah warna dari keruh menjadi bening kekuning-
kuningan hal ini menandakan larutan telah homogen.
Setelah itu larutan ditambahkan KOH 1 % yang bertujuan mendapatkan pH netral yaitu 7
dan didinginkan kemidian diukur pHnya, pH yang diperoleh 7 hal ini menandakan bakteri dapat
hidup pada pH tersebut, hal ini sesuai dengan literatrur yang menyatakan bakteri dapat hidup pada
pH 6,8-7. Kemudian dimasukkan kedalam autoklav dengan mulut Erlenmeyer disumbat dengan
kapas dan dilapisi kertas diluarnya. Tujuan dari penutupan ini agar meminimalkan kontaminasi.
Pembuatan NA berdasarkan konsistennya termasuk medium padat dan menurut kegunaannya
termasuk medium umum.
PDA (Potato Destore Agar) digunakan untuk menumbuhkan cendawan. Pembuatan medium pada
percobaan ini dengan menggunakan PDA (Potato Destore Agar) dimana dalam pembuatannya
terlebih dahulu dengan cara memasukkan 250 ml aqades dan 50 ml ekstrak kentang,62,5 gram
dextrose dan 7 gram agar kemudian dipanaskan diatas hot plate 440 oC diikuti oleh pengadukan
dengan tujuan dari pemanasan dan pengadukan ini untuk menghomogenkan PDA dengan aqades,
dan pemanasan bertujuan mempercepat pelarutan dari PDA. Setelah dipanaskan beberapa menit
larutan berubah warna dari keruh menjadi kuning tua, hal ini menunjukkan larutan telah homogen.
Kemudian larutan didinginkan dan diperoleh pH 5,72 hal ini sesuai dengan liateratur fungi hidup
pada pH 5,2-5,8. Setelah itu dimasukkan kedalam autoklav tetapi sebelum dimasukkan mulut
Erlenmeyer ditutup dengan kapas dan kemudian dibungkus dengan kertas, hal ini bertujuan agar
meminimalkan kontaminasi.
Sterilisasi yang dilakukan bertujuan untuk menghindari kontaminasi, yaitu masuknya
mikroorganisme yang tidak diinginkan. Sterilisasi merupakan suatu proses (kimia dan fisika) yang
membunuh semua bentuk hidup terutama mikroorganisme. Sterilisasi yang digunakan dalam
percobaan ini adalah secara fisika yaitu menggunakan panas, dimana panas yang digunakan
adalah bersama uap air yang biasanya disebut sterilisasi basah.

DAFTAR PUSTAKA
Dwidjoseputro, 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan. Jakarta.
Muhiddin, 2007. Biologi Umum. Universitas gadjah mada. Jogjakarta.
Pratiwi, 2008. Mikrobiologi .Penerbar swadaya. Jakarta.
Volk, 2005. Biologi dasar. Angkasa. Bandung.