PERCOBAAN II

PEMBUATAN PREPARAT JARINGAN HEWAN

(Dengan Metode Paraffin Block)

A. Tujuan
Mahasiswa dapat mengetahui teknik pembuatan preparat jaringan pada
organ hewan, dengan menggunakan metode paraffin block.

B. Dasar Teori
Menurut Ahmad (2009: hal. 1), histoteknik adalah metoda atau
cara/proses untuk membuat sajian histologi dari spesimen tertentu melalui
suatu rangkaian proses hingga menjadi sajian yang siap untuk diamati atau
dianalisa. Sajian histologi yang baik dapat digunakan untuk:
1. Bahan pengajaran dan praktikum mahasiswa, guna mempelajari bentuk
dan struktur jaringan tubuh tertentu yang normal.
2. Riset, guna mempelajari perubahan jaringan dan organ tubuh hewan
percobaan yang mendapat perlakuan tertentu atau mempelajari
pertumbuhan dan perkembangan jaringan atau organ tubuh tertentu.
3. Membantu menegakkan diagnosa penyakit yang diderita oleh seorang
pasien
Pada percobaan kali ini akan digunakan pembuatan sediaan mikroskopis
dengan menggunakan metode parafin. Metode pembuatan sediaan dengan
penyelubungan parafin disebut juga sebagai metode embedding. Pembuatan
sediaan dengan pemotongan jaringan menggunakan parafin dan mikrotom
sebagai alat pemotongnya. Kelebihn metode ini adalah irisannya jauh lebih
tipis dan prosedurnya juga lebih cepat jika dibandingkan dengan metode
seliondin maupun metode beku. Alat pemotomg mikrotom yang digunakan
bekerja berdasarkan suatu ulir yang berfungsi untuk mendorong maju blok
preparat atau pisau. Prosedur pembuatan sediaan menggunakan metode
parafin pada umumnya sama baik pada jaringan hewan maupun tumbuhan.
Pertamatama organ yang akan dijadikan preparat diisolasi terlebih dahulu,
kemudian difiksasi minimal 24 jam, didehidrasi dengan alkohol bertingkat
selama 30 menit, diclearing dengan xilol murni juga selama 30 menit,
diinfiltrasi agar parafin yang masuk berfungsi sebagai penyangga jaringan
saat diiris dengan mikrotom, lalu diembedding (proses penanaman) yaitu
merendam jaringan ke dalam parafin cair, dan parafin akan masuk ke seluruh
bagian jaringan, proses pemotongan dengan mikrotom, penempelan pada kaca
objek, pewarnaan dengan haematoksilin (pada umumnya bahan ini yang
sering digunakan untuk jaringan hewan) sedangkan jaringan tumbuhan
seringkali menggunakan safranin ataupun fast green. Setelah diwarnai lalu
dimounting, diberi perekat entellan, dan diberi label nama (Kurniawan, 2010:
hal. 2).
Metode parafin adalah suatu cara pembutan sediaan baik itu tumbuhan
ataupun hewan dengan menggunakan parafin. Kebaikan-kebaikan metode ini
ialah irisan jauh lebih tipis dari pada menggunakan metoda beku atau metoda
seloidin. Dengan metoda beku, tebal irisan rata-rata diatas 10 mkron, tapi
dengan metode parafin tebal irisan dapat mencapai rata-rata 6 mikron. Irisan-
irisan yang bersifat seri dapat dikerjakan dengan mudah bila menggunakan
metode ini. Kelemahan dari metode ini ialah jaringan menjadi keras, mengerut
dan mudah patah. Jaringan-jaringan yang besar tidak dapat dikerjakaan, bila
menggunakan metode ini. Sebagian besar enzim-enzim yang terdapat pada
jaringan akan larut dengan menggunakan metode ini (Kurniawan, 2010: hal.
4).
Cara mendapatkan sediaan permanen yang menyerupai keadaan sel atau
jaringan pada waktu masih hidup, diperlukan perlakuan khusus yaitu fiksasi.
Yang dimaksud dengan fiksasi adalah suatu usaha untuk mempertahankan
elemen-elemen sel atau jaringan agar tetap pada tempatnya dan tidak
mengalami perubahan bentuk maupun ukuran. Untuk melakukan fiksasi
diperlukan bahan atau media fiksatif baik berupa bahan fisatif tunggal
(sederhana) maupun bahan fiksatif mejemuk (campuran). Berbagai hal yang
harus diperhatikan sewaktu melakukan fiksasi adalah jaringan yang akan
difiksasi jangan dijepit, dan jaringan irisan jangan terlalu tebal. Larutan fiksasi
dapat berfungsi menghentikan proses metabolisme sel atau jaringan dengan
cepat, mengawatkan elemen-elemen sitologis dan histologis, mengawaetkan
bentuk sel dan jaringan yang sebenarnya, mengeraskan jaringan lunak,
mengubah indeks bias jaringan terhadap terhadap cahaya, serta meningkatkan
afinitas jaringan terhadap warna. Dalam pemilihanbahan fiksatif harus
memperhatikan sifat bahan fiksatif, yaitu kemampuan penetrasi bahan ke
dalam jaringan, waktu fiksatif, perlu tidaknya perlakuan pasca fiksasi, serta
sifat bahan yang akan difiksasi (Laboratorim Biologi. 2017: hal. 5).
Menurut Kurniawan (2010: hal. 6) Alat khusus yang dirancang untuk
menyayat material atau jaringan dalam sayatan-sayatan yang cukup tipis untuk
penelaahan dengan mikroskop adalah mikrotom. Syarat memperoleh hasil
sayatan yang baik :
1. Jaringan yang telah dipersiapkan dengan sempurna
2. Pisau yang cukup tajam
3. Pemilihan jenis mikrotom yang tepat
4. Operator yang cukup terampil dan terlatih
Dengan beberapa pengecualian, kebanyakan jaringan tak berwarna
sehingga sulit untuk memeriksa jaringan yang tak berwarna di bawah
mikroskop. Oleh karena itu telah ditemukan metode-metode pewarnaan
jaringan yang tidak hanya membuat berbagai komponen jaringan menjadi
mencolok, tetapi memungkinkan pula diidentifikasi komponen-komponen.
Pewarnaan hemitoksilin dan eosin atau (H dan E) adalah jenis pewarnaan rutin
yang paling umum di pakai. Prosedur ini di gunakan dalam proses pembuatan
preparat histopatologi dari berbagai spesies hewan sakit atau mati dan
memerlukan pemeriksan histopatologi untuk peneguhan diagnosis hewan yang
bersangkutan (Muntiha, 2001: hal. 157).
Bahan utama teknik pembuatan preparat histopatologi berupa potongan
jaringan hewan yang telah difiksasi dengan buffer neutral formalin (BNF)
10%. Larutan yang di perlukan adalah ethanol absolute, xylol, paraffin,
gliserin 99,5% ewit (albumin), larutan hematoksilin, litium karbonat, larutan
eosin, DPX, dan larutan dekalsifikasi (untuk jaringan tulang) (Mutiha, 2001:
hal. 157).
Menurut Laboratorium Biologi (2017: hal. 5), bahan fiksatif sederhana
yang umum digunakan dalam pembuatan sediaan permanen adalah:
1. Etanol (C2H5OH)
Konsentrasi yang sering digunakan sekitar 70%-100%. Kelebihan
dari larutan ini adalah penetrasi ke dalam jaringan cepat danjaringan yang
tidak perlu di cuci pasca proses fiksasi, namun memiliki kekurangan yang
sangat mengerutkan jarangan sehingga jarang digunakan.
2. Crocmic acid (H2Cr2O4)
Konsentrasi yang digunakan antara 0,5%-1% kelebihannya dapat
memfiksasi lemak dengan baik, sangat baik untuk memfiksasi
mitokondria, glogi apparatuz dan glikogen, tidak menimbulkan
pengerutan pada jaringan. Jaringan akan terpulas dengan baik setelah
menggunakan bahan fiksatif ini, namun kelemahannya adalah sering
terdapat endapan warna kuning di dalam jaringan jaringan mengeraskan
jaringan dan menyebabkan denatuasi protein.
3. Formalin (HCHO)
Konsentrasi yang sering digunakan antara 4%-10%. Kelebihannya adalah
proses fiksasi lebih cepat sekitar 24-48 jam, dapat mengeraskan jaringa
lunak, mampu mengfiksasi protein, glikogen, serta dapat meningkatkan
afinitas inti sel terhadap warna biasa, tidak perlu perlakuan khususpasca
proses fiksasi. Kelemahan dari bahan ini adalah uapnya dapat mengiritasi
mata dan epitel saluran pernafasan, dan meninggalkan artefak coklat pada
jaringan.
Tujuan fiksasi selain mengawetkan jaringan, juga di perlukan
mempertahankan struktur jaringan agar tidak berubah oleh bahan fiksasinya
sendiri. Salah satu larutan fiksasi yang terbaik untuk pengamatan rutin dengan
mikroskop cahaya, adalah larutan formaldehit dengan kadar 4% yang isotonis
dengan membubuhkan larutan buffer (pH 7) (Subowo, 2009: hal. 6).
 Pada dasarnya jaringan tubuh hewan bening tidak menujukkan kontras
antara bagian-bagiannya. Agar sayatan jaringan dapat dipelajari strukturnya
dengan mikroskop cahaya biasa, perlu diberikan kontras melalui pewarnaan.
Metode pewarnaan jaringan bertujuan selain agar tampak nyata, juga agar
bagian-bagian jaringan dapat dibedakan.bahan pewarna secara selektif akan
mewarnai bagian-bagian jaringan. Sebagian baha pewarna sebagai bersifat
senyawa asam atau basah serta mempunyai kecendrungan mengikat jaringn
membentuk garam. Komponen jaringan yang terwarna lebih oleh bahan
pewarna basa disebut basofilik, dan yang terwarna oleh pewarna asam disebut
asidofilik (Subowo, 2019: hal. 9).
Menurut Kurniawan (2010: hal. 10-11), mikrotom ada beberapa macam
yaitu :
1. Mikrotom geser (sliding mikrotome). Pada alat ini, jaringan tetap berada
pada tempatnya, sedang pisaunya yang bergerak. Pada umumnya jaringan
yang akan dipotong dengan mikrotom geser adalah jaringan yang tanpa
penanaman (embedding) terlebih dulu. Disini tidak akan terjadi pita irisan.
Jaringan yang akan diiris sebelumnya dapat diwarnai dengan pewarnaan
tunggal, ataupun tanpa pewarnaan terlebih dahulu. Metode ini banyak
dikerjakan untuk pengirisan jaringan tumbuh-tumbuhan.
2. Mikrotom beku (freezing microtome). Alat ini dihubungkan dengan tabung
berisi CO2 dingin, melalui suatu pipa karet. Mikrotom ini, keadaannya
sama dengan mikrotom geser yaitu jaringan tetap berada pada tempatnya
sedang pisau mikrotomnya yang bergerak ke muka dan ke belakang.
Jaringan dapat dipotong dengan mikrotom ini, tanpa fiksasi terlebih dahulu
atau dengan fiksasi. Fiksasi dapat dijalankan setelah pemotongan dan
sebelum pewarnaan.
3. Mikrotom putar (rotary microtome). Berbeda dengan 2 jenis mikrotom
diatas, yaitu bahwa pada mikrotom ini, pisau tetap pada tempatnya sedang
jaringannya yang bergerak ke atas dan ke bawah. Jenis mikrotom ini yang
biasanya digunakan untuk pembuatan sediaan irisan dengan metode
paraffin.
 Menurut Muntiha (2001: hal. 157), persyaratan dalam pengambilan
sampel:
1. Sampel untuk pemeriksaan histopatologi hewan harus segar, artinya
jaringan diambil secepat mungkin setelah hewan mati. Keterlambatan
pengambilan jaringan, terlebih dalam suhu lapangan yang panas,
mengakibatkan jaringan cepat menjadi busuk.
2. Apabila di dalam kelompok hewan yang mati masih ada hewan yang lain
yang sedang sakit, maka dianjurkan untuk mengambil sampel dari hewan
tersebut. Pada jaringan yang masih mengalami perubahan maka diambil
jaringan pada perbatasan antara jaringan yang sakit (mengalami
perubahan) dengan jaringan yang sehat.
3. Ukuran jaringan yang diambil sekitar 1 cm3. Jaringan tersebut harus segera
di fiksasi. Potongan jaringan yang terlalu besar mengakibatkan jaringan
yang terletak di dalamnya tidak terfiksasi dengan sempurna, sehingga
dapat membusuk.
4. Jika jaringan berupa tulang, maka perlu di lunakkan terlebih dahulu dalam
larutan dekalsifikasi dengan perbandingan antara jaringan dan lautan 1: 20
dengan waktu perendaman 24 jam.
Menurut subowo (2009: hal. 6), jika diinginkan sediaan di simpan lama
maka jaringan lunak perlu diawetkan. Pengawetan jaringan bertujuan agar
struktur jaruingan tidak berubah. Perubahan tersebut dicegah melalui:
1. Penghentian metabolism dalam sel
2. Pencegahan degradasi jaringan oleh enzim
3. Pembunuhan mikroorganisme pathogen seperti bakteri, jamur dan virus
4. Pengerasan jaringan sebagai akibat ikatan silang antara protein
Preparat jaringan hewan dan tumbuhan dapat diperiksa dibawah
mikroskop apabila sudah terlihat warna yang kontrase baik maka diberi
canada balsam lalu ditutup dengan kaca penutup, dan terakhir diberi label
preparat permanen tersebut. Dikarenakan keterbatasan waktu dan tidak
adanya mikrotom yang baik di laboratorium maka pekerjaan tidak bisa sampai
selesai. Hasil akhir dari pekerjaan hanya sampai pada balok parafin keras.
Hasil kerja hanya sampai pada terbentuknya balok parafin. Untuk
mendapatkan hal tersebut maka harus menjalani beberapa prosedur dengan
alat dan bahan tertentu (Kurniawan, 2010: hal. 7-8).
C. Alat dan Bahan
1. Alat
a. Alat bedah 1 unit
b. Botol plakon 12 unit
c. Cawan petri 1 buah
d. Gelas 24 buah
e. Gelas kimia 500 ml 14 buah
f. Gunting 1 buah
g. Holder 1 buah
h. Hot plate 1 unit
i. Incubator 1 unit
j. Kaca objek 15 buah
k. Kertas karton 1 buah
l. Kertas lebel 1 pack
m. Kuas kecil 1 buah
n. Labu ukur 500 ml 1 buah
o. Labu ukur 100 ml 1 buah
p. Mikroskop 1 buah
q. Mikrotum rotary 1 unit
r. Penutup gelas 24 buah
s. Pinset 1 buah
t. Pipet tetes 3 buah
u. Shaker laboratorium 1 unit
v. Silet 6 buah
w. Spatula 1 buah
x. Stanining jer 1 unit
y. Tissue 1 roll
2. Bahan
a. Albumen telur atau putih telur
b. Alkohol bertingkat 70%, 80%, 90%, 95% dan absolute
c. Aquadest
d. Canada balsam
e. Cat eosin
f. Erlich
g. Glycerine
h. Jaringan organ hewan yang terdiri dari jantung, hati, labung, usus,
insang, dan otot
i. Larutan bouins
j. Larutan paraffin bertingkat
k. Larutan toluol atau toluene
l. Larutan tolu0l paraffin
m. Larutan xylol