I.

Uji HA
Pada uji HA cepat biasanya dipakai untuk mengindentifikasikan virus yang mampu
menghemaglutinasi eritrosit ayam, sedangkan HI cepat biasanya dipakai untuk identifikasi
virus ND. Tujuan dari uji HA adalah mengetahui kemampuan virus untuk mengaglutinasi
virus. Untuk uji HA cepat maka virus dalam cairan allantois diteteskan ke obyek glass,
kemudian di dekat tetesan tersebut diteteskan suspensi eritrosit ayam 23,5% dan satu tetes
lagi di tempat yang berlainan sebagai control. Campurkan virus dengan eritrosit tunggu lima
menit dan amati apakah ada agregat atau tidak. Nampak eritrosit hancur berkepingkeping
karena adanya proses hemaglutinasi dari protein hemaglutinin virus terhadap eritrosit. Virus
memiliki protein hemaglutinin yang mampu mengaglutinasi eritrosit.

Virion dari beberapa keluarga virus berikatan dengan sel darah dan menyebabkan
hemaglutinasi. Bila antibodi spesifik dan virus dicampur sebelum ditambahi sel darah merah,
hemaglutinasi akan dihambat. Uji penghambatan hemaglutinasi ternyata sensitif kecuali untuk
togavirus, sangat spesifik, karena uji itu mengukur antibodi yang berikatan pada protein permukaan
yang paling gampang mengalami perubahan antigenik. Di samping itu, uji ini sederhana
mengidentifikasi isolat dari virus yang menyebabkan hemaglutinasi (Fennner, 1993). Beberapa
virus mampu mengaglutinasikan sel darah merah. Kemampuan ini sebagai contoh dari aktivitas
biologik dan aktivitas ini dapat dihambat oleh antibodi tertentu. Sisi partikel virus yang spesifik
dapat berinteraksi dengan reseptor mukoprotein pada sel darah merah dan permukaan sel lain.
Interaksi dari sisi reseptor dan virion membuat aglutinasi sel darah merah menjadi tampak. Enzim
virus neuraminidase memecah ikatan antara virus dan sel, dan melepas keduanya ke dalam larutan.
Antigen adalah bagian virus yang mengandung ikatan dan antigen dari virus digunakan untuk uji
hemaglutinasi(Stephen, 1980). Virus-virus Avian dapat mengaglutinasi sel darah merah, termasuk
didalamnya NDV (Newcastle Disease Virus), Virus influensa dan virus adenovirus127. Hambatan
dari aglutinasi oleh antibodi spesifik merupakan dasar dari uji HA dan HI cepat pada kaca benda.
Uji HA dan HI cepat pada kaca benda merupakan uji yang sesuai dan cepat dilakukan yang
penerapannya lebih luas untuk kontrol berbagai penyakit Avian seperti Newcastle Disease maupun
Micoplasmosis.

Uji HA dinyatakan valid apabila:

1. Setelah masa inkubasi selesai eritrosit pada sumuran 12 (kontrol) mengendap sempurna.
2. Pada baris sumuran yang berisi kotrol suspensi virus/antigen positif terjadi aglutinasi eritrosit (tidak
ada endapan aliran eritrosit).
3. Pada baris sumuran yang berisi suspensi virus/antigen negatif tidak terjadi aglutinasi eritrosit
(terdapat aliran eritrosit seperti yang terjadi pada sumuran 12).
Titer antigen dapat diketahui dengan melihat sumuran terakhir pada eritrosit ayam pedaging
dengan nomor tertinggi (end point) yang menunjukkan adanya hemaglutinasi positif yang ditandai
dengan adanya agregat-agregat di dasar sumur.
Mikroplate sumuran A1-A2, maka dilihat:
- Sumuran yang eritrosit mengalami hemaglutinasi= n
Rumus, titer antigen = 2n
 II. Uji HI

Angka pengenceran tertinggi dan terjadi hambatan aglutinasi terjadi secara sempurna
terhadap antigen 4HA Unit. Aglutinasi dapat dibaca dengan menegakkan plate. Hanya
sumuran yang mengalami stream pada waktu yang sama, dapat dinilai sebagai hambatan
aglutinasi. Uji serologi HI merupakan gold standard WHO untuk diagnosis infeksi virus
dengue. Uji ini untuk menetapkan titer antibodi anti-dengue yang dapat menghambat
kemampuan virus dengue mengaglutinasi sel darah merah angsa. Antibodi HI bertahan di
dalam tubuh sampai bertahun-tahun, sehingga uji ini baik untuk studi sero-epidemiologi.
Tetapi uji ini membutuhkan sepasang sera dengan perbedaan waktu fase akut dan
konvalesen paling sedikit 7 hari, optimalnya 10 hari. Uji ini dapat digunakan untuk
membedakan infeksi primer dan sekunder berdasarkan titer antibodinya. Prinsip HI adalah
diharapkan reaksi aglutinasi dari protein virus dapat dicegah dengan antibodi antigen yang
terdapat dalam serum. Pada uji cepat terlihat darah tidak mengalami aglutinasi karena
antigen virus yang mengaglutinasi yaitu agglutinin diikat oleh antibodi dalam serum
sehingga tidak memiliki kemampuan untuk mengaglutinasi.

Angka pengenceran tertinggi dan terjadi hambatan aglutinasi terjadi secara sempurna
terhadap antigen 4HA Unit. Aglutinasi dapat dibaca dengan menegakkan plate. Hanya sumuran
yang mengalami stream pada waktu yang sama, dapat dinilai sebagai hambatan aglutinasi.

2.3 Prosedur Kerja

1. Pembuatan RBC
Ambil darah ayam dengan menggunakan disposible 3 cc yang telah di isi dengan
alsaver sebanyak 1,5 ml (1:1).
1,5 ml alsaver dan 1,5 ml darah ayam = 3 ml
Masukan dalam tabung venolect, kemudian di centrifuge dengan kecepatan 200 PPM
selama 30 menit
Buang supernatannya
Masukan PBS centrifugenya
Cuci dengan PBS sebanyak 3 kali
Masukan PBS sesuai dengan sisa sel darah merah yang ada, kemudian di ukur PVC.

2. Pembuatan PCV
Ambil sel darah merah dengan menggunakan hematokrit tubes
Tutup salah satu ujung dengan kilin
Masukan dalam centrifuge haematokrite dengan kecepatan 1500 RPM selama 3 menit
Baca hasil dengan mengukur sel darah merah diatas kaca pengukur
Hasil = PCV 31 %
Untuk mendapatkan RBC 1 % = PBS 30 ml, tambah 1 ml sel darah merah
3. Pembuatan titrasi antigen ND
Masukkan PBS 25 ml dari well 1- 12
Masukkan antigen 25 ml pada well 1
 Encerkan dari well 1-11, buang
Masukkan PBS 25 ml dari well 1-12
Masukkan RBC 1% dari well 1-12
Ayak diatas mikroshaker selama 10-15 detik
Diamkan pada suhu 4 0 c selama 30-40 menit
Baca hasil.

4. Pemeriksaan HA
Masukkan PBS 25 ml dari well 1-12
Masukkan serum 25 ml pada well 1
Encerkan dari well 1-11, buang
Masukkan antigen 4 HA 2 ml dari well 1-12
Shakes 10-15 detik
Diamkan pada suhu 4 0 c selama 30 menit
Masukkan RBC 1 % ke semua well (1-12)
Shakes 10-15 detik
Diamkan pada suhu 4 0 c selama 30-40 menit
Baca hasil.
5. Pembuatan titrasi 4 HA, ND dan AI
Masukkan PBS 25 ml dari well 1-5
Masukkan antigen 25 ml pada well 1-2
Encerkan dari well 2-4, buang
Masukkan PBS 25 ml dari well 1-5
Masukkan RBC 1% dari well 1-5
Diamkan pada suhu 4 0 c selama 30-40 menit
Baca hasil.
6. Pemeriksaan HI
Masukkan PBS 25 ml dari well 1-12 (Pada well 12 PBS= 50 ml)
Masukkan serum 25 ml pada well 1
Encerkan dari well 1-11, buang
Masukkan antigen 4 HA 2ml dari well 1-12
Shakes 10-15 detik
Diamkan pada suhu 4 0 c selama 30 menit
Masukkan RBC 1 % ke semua well (1-12)
Shakes 10-15 detik
Diamkan pada suhu 4 0 c selama 30-40 menita
Baca hasil.