BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Jenis penelitian ini adalah eksperimental yaitu dengan mengamati
kemungkinan diantara variabel dengan melakukan pengamatan terhadap
kelompok eksperimental pada berbagai kondisi perlakuan dan
membandingkan dengan kelompok kontrol, dengan menggunakan rancangan
penelitian Randomised Block Design.

B. Variabel Penelitian
a. Variabel bebas
Variabel bebas dalam penelitian ini adalah konsentrasi ekstrak etanol daun
kumis kucing.
b. Variabel tergantung
Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah:
1. Volume udem kaki tikus.
2. Ketebalan udem telinga tikus.
3. Penurunan serapan plasma.
4. Waktu pendarahan tikus.
c. Variabel terkendali
Variabel terkendali pada penelitian ini adalah:
1. Pemilihan tikus: galur, kondisi, jenis kelamin, umur, berat badan tikus
2. Pemilihan herba: tempat tumbuh, waktu pemanenan, dan bagian
tanaman yang digunakan.
C. Definisi Variabel Operasional
1. Ekstrak etanol daun kumis kucing merupakan ekstrak yang diperoleh dari
penyarian daun kumis kucing menggunakan etanol 70%.
 2. Pengukuran uji aktivitas antiinflamasi dan antiagregasi platelet adalah
pengukuran dengan menggunakan perhitungan volume udem kaki tikus,
pengukuran ketebalan udem telinga tikus, penurunan serapan plasma, dan
waktu pendarahan tikus.
3. Dosis ekstrak yang digunakan sebagai perlakuan yaitu 100 mg/kgBB, 500
mg/kgBB dan 2500mg/kgBB.
4. Galur tikus yang digunakan dalam penelitian ini yaitu jenis galur wistar.
5. Umur tikus yang digunakan dalam penelitian ini yaitu antara 2-3 bulan.
6. Bobot tikus yang digunakan dalam penelitian ini yaitu 150-250 gram.
7. Tikus yang digunakan dalam penelitian yaitu tikus jantan.
D. Bahan dan Alat
1. Bahan
Bahan-bahan yang dibutuhkan dalam penelitian adalah daun kumis
kucing, natrium diklofenak (Phapros) dan aspirin (Phapros) sebagai kontrol
positif. Bahan kimia yang digunakan meliputi :etanol 70% (Brataco),NaCl
0,9 % (Brataco), EDTA, CMC-Na , karagenin, asam arakhidonat(Sigma,
Singapore) dan tikus sebagai hewan uji.

2. Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian adalah alat-alat gelas
laboratorium, maserator, pengaduk kaca, kain saring, cawan penguap,
sudip, penangas air,pipet ukur, neraca analitik,pleistimograf, kertas saring
whatman,microplate reader (Bio Red, Jepang).
E. Cara Penelitian
1. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan pada bulan Januari sampai dengan Juni 2012 di
Laboratorium Biologi Farmasi dan Laboratorium Farmakologi Universitas
Muhamadiyah Purwokerto.
2. Langkah Kerja Penelitian
a. Penyiapan dan Pengumpulan Bahan Tumbuhan
Penyiapan bahan tumbuhan meliputi pengumpulan dan identifikasi
bahan tumbuhan serta pembuatan simplisia. Pengumpulan bahan simplisia
dilakukan tanpa membandingkan dengan tumbuhan serupa pada daerah
lain. Bahan yang dibutuhkan sebagai sampel adalah daun kumis kucing
yang didapat di daerah Kedung Banteng Purwokerto pada bulan Januari
2012.Determinasi dilakukan di Laboratorium Botani dan Genetika
Universitas Muhammadiyah Purwokerto.
b. Pembuatan Simplisia Daun Kumis Kucing
Daun Kumis Kucing yang diperoleh, dikumpulkan,dibersihkan
dari kotoran dan dicuci dengan air mengalir hingga bersih. Setelah itu
ditiriskan, sebarkan diatas kertas hingga air meresap. Setelah itu dijemur
dibawah sinar matahari, dengan ditutup kain hitam dansetelah kering
serbukan dengan menggunakan blender.Ukuran ayakan untuk serbuk
adalah mesh 20/40.
c. Pemilihan Hewan Uji
1. Pemilihan galur, jenis kelamin, umur dan bobot hewan uji yang akan
digunakan dalam penelitian adalah tikus putih jantan galur wistar
dengan umur 2-3 bulan, dengan berat badan 150-250 gram.
2. Hewan uji yang dipilih berdasarkan berbagai kriteria tersebut diberi
perlakuan yang sama. Waktu pengadaptasian hewan uji dilakukan
selama satu minggu sebelum hewan uji mendapat perlakuan.
Kemudian diberi larutan ekstrak etanol daun kumis kucing selama
tujuh hari berturut-turut dengan harapan senyawa yang berfungsi
sebagai agen anti inflamasi telah terakumulasi dalam tubuh.
d. Penentuan Panjang Gelombang
Penentuan panjang gelombang dilakukan dengan tujuan agar
didapatkan absorbansi yang maksimal. Bednar et al (1994), pada
 penelitiannya tentang uji agregasi platelet dengan menggunakan
microplate reader, digunakan panjang gelombang 632 nm. Mengacu pada
penelitian tersebut, maka pada penelitian ini dilakukan orientasi langsung
dengan panjang gelombang yang sama yaitu 632 nm.

3. Tahap Persiapan
a. Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Kumis Kucing
Metode ekstraksi yang digunakan adalah maserasi. Langkah
pembuatan ekstrak etanol daun kumis kucing adalah sebagai berikut :
Ekstrak dibuat dengan cara maserasi menggunakan etanol 70%.
Satu bagian serbuk kering daun kumis kucing dimasukkan ke dalam
maserator, ditambah 10 bagian etanol 70%, direndam selam 6 jam sambil
sekali-kali diaduk, kemudian didiamkan sampai 24 jam. Maserat
dipisahkan dan proses diulang sekali dengan jenis dan jumlah pelarut
setengah dari pelarut semula. Semua maserat dikumpulkan dan diuapkan
hingga diperoleh ekstrak kental.
b. Penentuan Dosis Ekstrak Daun Kumis Kucing
Daun kumis kucing yang mempunyai efek sebagai antiinflamasi
pada tikus adalah490mg/kgBB (Prayoga, 2008)
1). Dosis ekstrak untuk tikus bobot 200 g (dosis 100mg/kgBB)
,

x 0,2 kg=0,02 g


Larutan ekstrak yang diberikan


0,02 g x =0,033 ml ~ 0,03 ml


2). Dosis ekstrak untuk tikus bobot 200 g (dosis 500 mg/kgBB)
,

= x 0,2 kg=0,1 g

 Larutan ekstrak yang diberikan


0,1 g x =0,167 ml ~ 0,2 ml


3). Dosis ekstrak untuk tikus bobot 200 g (dosis 2500 mg/kgBB)
,

= x 0,2 kg=0,5 g


Larutan ekstrak yang diberikan


= 0,5 gx =0,833 ml ~ 0,8 ml


c. Penetapan Dosis Karagenin

Karagenin yang diberikan pada tikus harus mempunyai dosis yang pasti
dan tepat. Septiawan (2011) menyatakan dosis karagenin yang di berikan15
mg/ kgBB cukup baik untuk digunakan. Mengacu pada penelitian tersebut
maka penelitian ini dilakukan orientasi langsung pada dosis 15 mg/ kg BB dan
diamati apakah benar pada dosis tersebut memberikan efek peradangan yang
baik dan mudah diamati.

d. Penentuan Dosis Natrium Diklofenak

Dosis Natrium diklofenak untuk tikus perlakuan ditentukan
berdasarkan faktor konversi dosis manusia dan dosis tikus menurut metode
Laurance dan Baoharach. Perhitungan konversi dosis manusia dengan tikus
adalah:
Dosis pemakaian pada manusia (50kg) = 100 mg sehari
Konversi dosis manusia (70kg) pada tikus (200g) = 0,018

Dosis pemakaian pada manusia (70 kg) = x100 mg



140mg
Dosis untuk tikus (200 g) = 140 mg x 0,018
= 2,52 mg
 2,52mg
Dosis untuk tikus

200gBB

= 0,0126 mg/gram BB
= 12,6 mg/ Kg BB

Larutan suspensi natrium diklofenak 5 % yang diberikan

,

= x 1ml = 0,05 ml



e. Penentuan Dosis Aspirin

Dosis aspirin untuk tikus perlakuan ditentukan berdasarkan faktor

konversi dosis manusia dan dosis tikus menurut metode Laurance dan
Baoharach. Perhitungan konversi dosis manusia dengan tikus adalah:
Dosis aspirin adalah 80-320 mg.
Perhitungan dosis sehari yaitu 80 mg.
Faktor konversi manusia (70 kg) ke tikus (200 g) = 0,018
Rata-rata berat manusia Indonesia adalah 50 kg, sehingga dosis aspirin

yang digunakan x80 mg=112mg



Dosis aspirin untuk tikus (200 g) = 0,018 x 112 mg

= 2,02 mg
Dosis aspirin untuk tikus = 2,02 mg/ 200 g BB
= 0,01 mg/ g BB
= 10 mg/ kg BB
Volume aspirin yang diberikan :
,
= x100ml=0,202~0,2ml

f. Pembuatan Suspensi CMC-Na 1%

Sebanyak 1 gram CMC Na ditaburkan merata ke dalam mortir yang

berisi aquadest panas sebanyak 35 ml. Didiamkan selama 15 menit hingga
diperoleh massa yang transparan, digerus hingga terbentuk gel kemudian
diencerkan dengan sedikit air, dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml, lalu
ditambahkan air suling sampai garis tanda.

g. Pembuatan Larutan Standar Ekstrak Daun kumis kucing 60%

Sebanyak 30 g ekstrak ditimbang seksama dan dimasukkan ke dalam

labu takar 50 mL, ditambahkan dengan CMC-Na 1% sampai tanda dan
dikocok.

h. Pembuatan Larutan Standar Natrium Diklofenak 5%

Sebanyak 5 g natrium diklofenak ditimbang seksama dan dimasukkan
dalam labu takar 100 mL, ditambahkan dengan CMC Na 1% sampai tanda
dan dikocok homogen.
i. Pembuatan Karagenin 1%

Sebanyak 100mg karagenin ditimbang seksama dan dimasukkan

dalam labu takar 10 ml, ditambahkan dengan NaCl 0,9% sampai tanda dan
dikocok.

j. Pembuatan Asam Arakhidonat

Sebanyak 74,6 mg asam arakhidonat ditimbang seksama kemudian
tambahkan 10l etanol absolut dan ditambahkan NaCl 0,9 % (b/v) sebanyak
0,41 ml.
k. Pembuatan Larutan Standar Aspirin 1%
Ditimbang sebanyak 1g serbuk aspirin kemudian digerus dengan
penambahan suspensi CMC-Na 1% sampai homogen, dimasukkan ke dalam
 labu ukur 100 ml, dicukupkan sampai garis tanda dengan suspensi CMC-Na
1%.

4.Tahap Pelaksanaan

Sebelum diberi perlakuan tikus ditimbang dengan bobot rata-rata tikus 200
g. Hewan uji di bagi menjadi 6 kelompok. Pada tiap tikus diberi dengan dosis yang
berbeda. Adapun perlakuan terhadap hewan uji pada masing-masing kelompok,
yaitu:

1. Kelompok I : Kelompok kontrol pelarut yaitu tikus

diberikansuspensi CMC-Na 2% secara per oral selama 7 hari.
2. Kelompok II : Kelompok kontrol positif untuk uji udem yaitu tikus
diberikan suspensi natrium diklofenak 12,6 mg/kgBB secara per oral 2 jam
sebelum perlakuan.
3. Kelompok III : Untuk kontrol positif agregasi platelet
menggunakanaspirin dengan dosis 10 mg/kgBB.
4. Kelompok IV : Kelompok perlakuan dengan pemberian ekstrak dosis
100 mg/kgBB secara per oral selama 7 hari.
5. Kelompok V : Kelompok perlakuan dengan pemberian ekstrak dosis
500 mg/kgBB secara per oral selama 7 hari.
6. Kelompok VI : Kelompok perlakuan dengan pemberian ekstrak dosis
2500mg/kgBB secara per oral selama 7 hari.
Setiap tikus tetap diberi makan selama 7 hari. Kemudian pada hari
ke-7 dilakukan uji sebagai berikut:
1). Uji udema pada telinga tikus
Pengujian udema pada telinga tikus dilakukan pada telinga bagian
kiri.Sebelumnya dilakukan pengukuran ketebalan telinga tikus.
Selanjutnya tiap tikus dioleskan asam arakhidonat kemudian ukur
ketebalan telinga tikus tersebut diukur pada 0,5 ; 1 ; 1,5 ; 2 ; 3 dan 4jam
 dengan menggunakan jangka sorong.Pengukuran dilakukan replikasi
sebanyak tiga kali.
2). Uji udema pada kaki tikus
Uji udem kaki dilakuan dengan memberi tanda pada kaki tikus, kemudian
kaki tikus dimasukan kedalam alat pleistimograf yang berisi cairan
sampai andda batas. Angka dicatat sebagai Vo. Satu jam kemudian kaki
tikus disuntik secara intraplanar dengan larutan karagenin 1%. Setelah 30
menitpengukuran dilkukan kembali dengan cara mecelupkan kaki tikus ke
dalam alat pleistimograf yang berisi cairan sampai tanda batas. Angka
dicatat sebagai Vt. Pengukuran dilakukan setiap 30 menit, selama 360
hari.Pengukuran dilakukan replikasi sebanyak tiga kali.
3). Uji agregrasi platelet
Tikus kelompok I, III, IV, V dan VI diambil darahnya dari ekor,
ditempatkan dalam mikrotube.Kemudian ditambahkan EDTA sebagai
antikoagulan dan digoyang-goyangka.Setelah itu darah disentrifuge
dengan kecepatan 6000rpm selama 3 menit.Supernatan dipisahkan dari
endapan, dan ditempatkan dalam 96 well microplate. Sebanyak 293,5 l
supernatan ditambah dengan 6,5 l asam arakhidonat hingga konsentrasi
akhir 12,38mM. Kemudian dibaca absorbansi menggunakan microplate
reader pada waktu 15 detik, 30 detik serta 1;2;3;4;5;6;7;8;9;10 menit
dengan panjang gelombang 632 nm.
4). Uji waktu pendarahan ekor
Uji waktu pendarahan dilakukan dengan memotong 5 mm ujung ekor
tikus dan ekor ditotolkan pada kertas saring whatman setiap 30 detik
sampai hasil penotolan tidak menunjukan bekas pada kertas.Waktu
pendarahan dihitung antara waktu pemotongan sampai waktu darah
berhenti.
5). Perhitungan Volume Udem, Serapan, dan Waktu pendarahan
a. Perhitungan Volume Udem Telinga
Persen radang dapat dihitung dengan rumus

Persen radang = x 100%

Dimana : Kt = Ketebalan radang setelah setelah pemberian injeksi asam
arakidonat
Ko = Ketebalan radang sebelum injeksi asam arakidonat

Persen inhibisi radang dihitung dengan rumus :


Persen Inhibisi Radang : x100%

Dimana : a = persen radang rata-rata kelompok kontrol
b = persen radang rata-rata kelompok perlakuan hewan uji
b. Perhitungan Udem kaki tikus
Persen radang dapat dihitung dengan rumus :

Persen radang = x 100%

Dimana : Vt = volume radang setelah waktu pemberian injeksi karagenin
Vo = volume awal sebelum injeksi karagenin
Persen inhibisi radang dihitung dengan rumus :

Persen Inhibisi Radang : x100%

Dimana : a = persen radang rata-rata kelompok kontrol
b = persen radang rata-rata kelompok perlakuan hewan uji
c. Agregasi platelet
Uji agregasi platelet ditunjukkan dengan perubahan penurunan
serapan plasma.Penurunan serapan plasma dihitung dengan menghitung
selisih serapan plasma.
 d. Perhitungan Waktu Pendarahan Ekor Tikus
Perhitungan waktu perdarahan dihitung dari periode waktu amputasi
sampai waktu pemberhentian perdarahan.

F. Analisis Statistik
Data yang diperoleh dianalisa secara statistik menggunakan program
SPSS versi 16.Data persentase inhibisi radang diolah dengan menggunakan
analisis anava dua arah.Sedangkan untuk mengetahui perbedaan persen
inhibisi antara udem kaki dan udem telinga digunakan analisis T-test.Data uji
agregasi platelet dan waktu pendarahan, masing-masing dilakukan analisis
dengan anava satu arah untuk melihat adanya perbedaan antar kelompok
perlakuan.