RESUME

Efek dari Eksipien pada kestabilan dan Tampilan Aerosol dari Inhaler bubuk kering Salmon
Calcitonin yang dibuat melalui proses penyemprotan beku kering

Rute parenteral merupakan rute yang tidak nyaman, terutama untuk obat seperti sCT yang
memiliki waktu paruh pendek setelah rute administrasi (sekitar 15-20 menit) dan membutuhkan
injeksi untuk menahan atau menyimpan efek farmakologi. Bentuk dari dosis nasal atau nasal
spray menunjukkan 3-5% efek yang lebih baik daripada pemberian dosis parenteral.

Salmon Calcitonin (sCT) adalah sebuah 32- asam amino hormone polipeptida linier
dengan 1-7 jembatan disulfide. sCT telah disetujui sebagai pengobatan untuk osteoporosis dan
penyakit pagets, berbentuk larutan injeksi ( Calcimar, Miacalcin) dan nasal spray (Fortical,
Miacalcin) merupakan beberapa obat yang digunakan sebagai contoh untuk tujuan pengobatan
ini. Rute parenteral merupakan rute yang tidak nyaman, terutama untuk obat seperti sCT yang
memiliki waktu paruh pendek setelah rute administrasi (sekitar 15-20 menit) dan membutuhkan
injeksi untuk menahan atau menyimpan efek farmakologi. Bentuk dari dosis nasal atau nasal
spray menunjukkan 3-5% efek yang lebih baik daripada pemberian dosis parenteral.

Beberapa metode teknik telah memproduksi serbuk yang sesuai untuk inhalasi, meliputi
mikronisasi dan pencampuran, pengkontrolan pelarut kristalisasi, proses cairan superkritikal,
spray drying dan lain lain. Spray freeze drying (SFD) adalah sebuah teknik untuk memproduksi
partikel respirable dari peptide atau protein. Metode yang digunakan mengkombinasikan
atomisasi dan pembekuan dilanjutkan dengan sublimasi es dibawah vakum. Proses membentuk
partikel yang relative bulat dengan tinggi luas permukaan yang spesifik dan masa jenis yang
rendah dengan distribusi ukuran yang sesuai. Bulatan kecil dengan ukuran aerodinamik yang
kecil lebih mudah untuk mencapai jaringan paru yang lebih dalam untuk endapan yang efektif.

Tujuan dari penelitian terbaru adalah untuk mempersiapkan partikel SFD untuk sCT dan
memperkirakan efek dari factor formulasi pada stabilitas, karakteristik fisika, dan wujud atau
tampilan aerosol dari serbuk. Stabilitas peptide diperkirakan menggunakan kromatografi,
dikroisme sirlkular dan spektroskopi flouresensi. Karakteristik fisika dari serbuk yang stabil telah
di uji menggunakan difraksi sinar laser dan SEM.

Bahan :

Salmon Calsitonin dibeli dari labolatorium polipeptida, USA. Asetonitri, treasol, maltose dan
hidroksil propil--silodekstrin (HPCD) dibeli dari sigma, jerman. Tetrametalammonium
hidroksida dan 80 senyawa kimia kembar telah disediakan oleh merck, jerman, dan kapsul
hidroksipropilmetil selulosa (HPMC) adala sebuah pemberian atau hadiah dari Cipla, India.

Spray Freeze Drying

 1. 4%(m/V) larutan aqueous mengandung 0,5% sCT, gula (treasol atau maltose), HPCD
(0,002 dan 0,04 %) dan 80 senyawa kembar (0 dan 0,001%) telah dipersiapkan
2. Dalam setiap percobaan 0,4 L nitrogen cair dituangkan kedalam 2L gelas container
untuk menghasilkan uap sirogenik.
3. Larutan nutrisi diatomisasi menggunakan 2-pipa semprot fluida kedalam uap diatas
cairan nitrogen pada kecepatan rata rata 6ml/menit menggunakan skala lab Spray dryer
4. Bentuk yang diinginkan keluar dari batang sampai sisa nitrogen terevaporasi dan
droplets beku kemudian di lyofilisasi pada pengering beku
5. Proses pengeringan utama pada suhu -50C dan 0,005 mbar selama 24 jam
6. Proses sekunder pengeringan ditunjuukan dengan penambahan suhu secara perlahan
menjadi -20C sekitar 24 jam. Serbukyang dihasilkan sekitar 85%.

Stabilitas kimia :

Kandugan sCT telah dievaluasi menggunakan sistem RP-HPLC (waters:USA) dan

sebuah kolom C18 (5mikrometer 4.6X 150 mm, Tosoh Bioscience, Jepang) pada 220 nm.
Fase mobile disusun dari komponen A [2:5:93(V/V/V)]1 mol/L tetrametilamonium
hikdrosid/asetonitril/air, pH 2,5] dan komponen B[8:500;492(V/V/V)] 1 mol/L
tetrametilamonium hikdrosid/asetonitril/air, pH 2,5] diaplikasikan sebagai gradient linier
untuk A/B dari 70:30 untuk 47:53 selama 20 menit. Volume yang diinjeksikan sebanyak
80 mikroliter dan kecepatan aliran rata rata 1 mL/menit.

Stabilitas Bentuk :

Kestabilan bentuk dari formulasi stabil secara kimia (sCT recovery>90%) telah diteliti
menggunakan circular dichroism (CD) dan spektroskopi flouresense intrinsic.
Spektroskopi flouresensi instrinsik : spectra flouresensi instrinsik ditujukan untuk
penggunaan spectrometer luminense flouresensi instrinsik dimonitot pada 300 sampai
400 nm dengan eksitasi panjang gelombang untuk280 nm. Sisi eksitasi dan emisi di atur
pada 10nm. Setiap sampel digunakan 1 mikrogram salmon calcitonin untuk generasi
akumulasi dari 5 scan.

Karakterisasi Partikel :

SEM : menyeleksi serbuk SFD yang terhambur diatas wadah, dikeringkan pada 25C dan
diberi percikan emas menggunakan mesin pemercik(BAL-TEC,SwitCzech Republic)
pada arus 25kV.

Analisis Ukuran Partikel :

Ukuran pasrtikel dari serbuk SFD telah diperkirakan menggunakan Malvern matersizer
(Malvern,UK) langkah yang dilakukan , 5mg serbuk disuspensi dalam 5ml asetonitril dan
 sonikasi pada air bak sonikator slama 3 menit. Pengukuran menghasilkan hasil yang tidak
jelas 0,15 untuk 0,2 rangkap tiga.

Endapan Serbuk In vitro :

TSI dignakan untuk mengevaluasi aerodinamik dan endapan stabil formulasi SFD.
Sekitar 10mg serbuk diisikan dalam ukuran 2 kapsul HPMC dan ditempatkan kedalam
siklohaler. Inhaler serbuk kering. 6 kapsul digunakan setiap lari dan setiap lari di
tunjuukan dalam 3 lapisan. Serbuk dubentuk menjadi aerosol menggunakan poma selama
5 detik dengan kecepatan rata rata 60 L/menit.
Setelah aerosolisasi, serbuk dimasukkan pada sebuah alat, atau simulasi kerongkongan,
sates 1 dan stase 2 dicuci dengan air dan kandungan sCT pada setiap larutan diuji
menggunakan RP-HPLC. Dosis recovery (RD) adalah jumlah dari serbuk yang telah diuji
pada alat dan semua bagian dari TSI ketika fine particle dose (FPD)merupakan jumlah
dari sCT yang dimasukkan pada stase 2TSI. Emitted dose (ED) adalah jumlah serbuk
yang keluar dari kapsul dan alat menuju TSI. Fine particle fraction (FPF) adalah
persentasi dari FPD dalam ED.

Stabilitas Pnyimpanan :

Untuk mengevaluasi stabilitas dari penyimpanan serbuk sCT , sampel yang terseleksi
disetorkan dalam vacuum botol gelas yang dilapisi dengan aluminium foil dan tutup karet
yang melekuk, dibawah kondisi penyimpanan yang berbeda suhu 4+/-2 C (suhu kulkas),
25+/-2C (suhu AC ruangan) dan 45 +/-2C (pada oven yang terkontrol). Sampel dari
setiap kondisi dianalisis menggunakan RP-HPLC setelah 3 bulan penyimpanan. Sebuah
set lapis tiga dari sampel digunakan untuk semua kasus pada setiap kondisi penyimpanan.

Analisis statistika :

Semua hasil di presentasikan sebagai rata rata dan standar deviasi dari 3 sampel bebas.
Regresi multiple linier dan analisis one-way untuk varians (ANOVA) ditunjukkan untuk
mendemonstrasi perbedaan statistic (<0,05) menggunakan SPSS versi software 13 (IBM
corporation, USA)

HASIL

Stabilitas Salmon Calcitonin dalam serbuk SFD

Perlakuan yang membuat stress peptide selama SFD dapat menyebabkan degradasi
fisikia dan kimia. Pemeliharaan bahan kimia dan integritas struktur dari biofarmasetikal untuk
pemeliharaan aktivitas biologis adalah sebuah tantangan.
 Hasil menunjukkan jenis gula pembawa tidak secara signifikan mempengaruhi stabilitas
serbuk (>0,05) dan tidak ada perbedaan antara efek stabilisasi dari maltose sebagai gula
reduksi dan trealosa setelah SFD. Konsentrasi HPCD memiliki efek signifikan pada stabilitas
kimia dari serbuk sCT dan kandungan serbuk sCT melalui proses meningkat sesuai dengan
proporsi peningkatan HPCD(<0,05). Meskipun tidak ada laporan lain pada efek dari
siklodekstrin pada stabilitas peptide atau protein selama SFD, hal ini menunjukkan bahwa ada
eksipien mengikuti adanya pola atau susunan yang sama sebagai lyofilisasi.

Efek stabilisasi dari HPCD pada protein ditunjukkan lebih kuat daripada CDs lainnya. Dapat
disebutkan bahwa CD jenis ini telah disetujui sebagai study toksikologi. Efek protective dari
HPCD pada sCT sebagai sebuah peptide telah dievaluasi pada penelitian terbaru. Penambahan
dari 80 formulasi kembar mengandung 0 atau 0,02% HPCD meningkat dengan persentasi dari
sCT recovery (<0,05) tidak ada perbedaan signifikan yang ditemukan pada persen recovery dari
sCT pada formulasi mengandung 0,04% HPCD pada 80 formulasi kembar. Hal ini dapat
menjadi hasil yang lebih tinggi pada efek stabilisasi dari siklodekstrin pada konsentrasi ini, yang
mana dapat menutupi surfaktan pada 80 kembar formulasi. Serbuk mengandung 0,04% HPCD
(F3,F6,F9,F12) bagaimanapun juga jenis gula dan keberadaan 80 kembar formulasi, menunjukkan
lebih dari 90% recovery dan telah diseleksi untuk penelitian lebih jauh.

Stabilitas Struktur :
 Circular dichroism : CD spektroskopi dapat menyediakan informasi berguna tentang
tentang strktur sekunder dan tersier dari peptide dan protein. Gambar 2 dan 3 menunjukkan
pengurangan pelarut pada spectra UV-CD dekat dan jauh formulasi stabil secara kimia
dibandingkan dengan sCT yang tidak diproses. Gambar 2 menunjukkan keseluruhan bentuk dari
spectra UV jauh yang sanagt seragam satu sama lain dan untuk sCT yang tidak diproses. Rata
rata residu berbetuk elips telah dievaluasi untuk perbandingan kuantitatif dari struktur sekunder.
Data dari semua formulasi dan sCT yang tidak diproses menunjukkan kesamaan struktur
sekunder dengan perkiraan 9%-helix, 27%-sheet,28% putaran dan struktur sisa yang terdiri
dari gulungan acak.

Spektroskopi CD telah digunakan pada UV dekat (250-300 nm) untuk memperbaiki

stabilitas konformasi dari formulasi SFD. Pengurangan referensi spectra UV dekatdari formulasi
stabil secara kimia VS sCT yang tidak diproses ditunjukkan pada gambar 3. Kontribusi
predominan dari sCT diperkirakan dari Tyr 22. Pengurangan pelarut spetra UV dekat dari sampel
dibandingkan satu dengan lainnya dan sCT yang tidak diproses. Spektra UV-CD dekat
mengindikasi struktur tersier dari formulasi sCT tidak merubah sama sekali selama SFD.

Gambar 5 menunjukkan partikel morfologi mengandung 80 kembar yang mana berbeda

dengan partikel surfaktan bebas. Perubahan mengenai morfologi surfaktan telah dideskribsikan
oleh shoyele et al. mungkin lebih terlihat menggumpal pada serbuk yang mengandung surfaktan
membuat serbuk menjadi lebih kohesiv daripada partikel bebas surfaktan.

Distribusi ukuran ukuran partikel dari serbuk ditunjukkan pada table II. Volumetric
ukuran partikel rata rata dari serbuk, dinyatakan dengan analisis difraksi laser, 15-16 mikrometer,
yang mana jauh dari ukuran partikel ideal untuk inhalasi. Seperti yang ditunjukkan gambar 5,
partikel SFD sangat berpori, yang membuat mereka sangat cocok untuk inhalasi. Lebih jauh lagi,
ukuran partikel yang besar dapat membantu mereka terhindar dari makrofag. Jenis pembawa ini
atau keberadaan kembar 80 tidak memiliki efek pada ukuran dari serbuk kering (<0,05). Serbuk
SFD menunjukkan ukuran distribusi relative, yang cocok untuk inhalasi.
Endapan In Vitro serbuk SFD

Table III menunjukkan semua serbuk memiliki penerimaan yang relative baik pada fine
particle fractions (FPF) (>40%). Sejak FPF adalah indicator dari endapan in vivo alveolar, semua
serbuk menunjukkan karakteristik inhalasi yang tepat.

Tidak adanya perbedaan yang signifikan dalam FPF telah ditemukan antara treaol dan maltose
mengandung serbuk (>0,05). Ini dapat menjadi sifat untuk bentuk similar dan ukuran serbuk
yang mengandung gula pembawa. Serbuk kembar-bebas menghasilkan nilai FPF lebih tinggi
daripada formulasi yang mengandung kembar. Hal ini dapat digunakan sebagai hasil untuk
meningkatkan penggumpalan pada partikel yang mengandung tween (kembar), yang terdispersi
terbatas.

Penyimpanan stabilitas dari partikel SFD

Formulasi di dimpan pada 4,25 dan 45C selama 12 minggu untuk menentukan stabilitasnya.
Penyimpanan semua formulasi pada 45C dihasilkan pada pengurangan besar kestabilan kimia
dari sCT(gambar 6). Kesetabilan kimia dari F3 (sCT/Tre/HPCD) tidak dipengaruhi dengan
penyimpanan pada 25 dan 4C selama 12 minggu. Seblaiknya, kandungan sCT F6
(sCT/Malt/HPCD)berkurang secara berangsur-angsur setelah 12 minggu. Maltose adalah gula
pereduksi dan reaksi Millard anatar gugus carbonil dan gugus asam amino bebas dari sCT
mungkin menjadi tidak stabil selama penyimpanan. Keberadaan 80 tween pada formulasi
menjadikan untuk sama atau lebih pada kestabilan kimia. Bagaimanapun, surfaktan dengan alkil
rantai polioetilena sperti polisorbat memungkinkan terjadinya autooksidasi, degradasi
pemendekan rantai dan pembentukan residu peroksida. Peroksida ini telah didemonstrasikan
untuk menyebabkan oksidasi protein dalam larutan dan fase padat. Polisorbat meningkatkan
pemendekan waktu stabilitas dari protein yang paling banyak ketika mengekspose kerusakan
induksi permukaan, tetapi toleransi stabilitas protein selama penyimpanan dalam waktu lama,
telah dilaporkan untuk interleukin 2 dan hormone pertumbuhan.

Kesimpulan

Hasil dari penelitian ini mendemosntrasikan bahwa formulasi sCT mengandung

0,04%HPCD yang dapat dikeringkan dengan penyemprotan beku ( spray freeze dried)menjadi
serbuk yang memiliki bahan kimia yang mamadahi dan integritas struktur, dengan bentuk poros
tinggi yang membuat mereka cocok untuk menjadi inhalasi. Jenis gula pembawa tidak merubah
kestabilan mereka atau wujud atau tampilan aerosol. Meskipun penambahan 80 tween tidak
merubah stabilitas sCT, keduanya wujud aerosol dan stabilitas penyimpanan tidak dipengaruhi
oleh komponen ini. Formulasi optimum untuk menghasilkan wujud atau tampilan aerosol
superior dan stabilitas setelah penyimpanan adalah F3 (Sct/Tre/HPCD 0,04%). Ini
mengindikasi bahwa HPCD dan komposisi treasol secara lengkap distabilisasi formulasi sCT
selama SFD dan menghasilkan banyak, mikropartikel poros dengan agregasi rendah, yang ideal
untuk inhalasi.