PETUNJUK PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI DASAR
(TPP 1207)

Disusun oleh :
Dosen Pengampu

KEMENTERIAN RISET, TEKNOLOGI, DAN PENDIDIKAN TINGGI

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS PERTANIAN
PURWOKERTO
2016
 ACARA I
MIKROORGANISME DARI BERBAGAI HABITAT

A. Pendahuluan
Di alam banyak dijumpai berbagai jenis dan spesies mikroba. Mikroba
dapat hidup disemua tempat, dan penyebaran mikroba sangat luas. Penyebaran dan
tempat tumbuh mikroba tergantung dari sifat dan persyaratan tumbuh mikroba
yang bersangkutan. Setiap jenis maupun spesies mikroba mempunyai habitat yang
berbeda dengan jenis dan spesies mikroba yang lain.
Habitan tempat tumbuh mikroba misalnya di udara, dalam tanah, air, di
tanaman, dalam makanan, dan bahkan di tubuh makhluk hidup yang lain. Untuk
membuktikan bahwa mikroba terdapat di berbagai habitat, maka dari habitan
tersebut diambil sampel dan selanjunya ditumbuhkan dalam suatu medium baik
padat maupun cair.
Untuk menumbuhkan mikroba dengan jenis yang berbeda, maka digunakan
jenis medium yang berbeda pula. Medium yang digunakan adalah medium standar
untuk pertumbuhan mikroba tertentu. Untuk menumbuhkan bakteri biasanya
digunakan medium nutrien agar (NA), menumbuhkan kapang dengan medium
potato dextrose agar (PDA), sedang untuk jenis khamir dengan medium malt
ekstrak agar (MEA).

B. Tujuan
Membuktikan bahwa mikroba ada dimana-mana

C. Bahan dan alat

Bahan : media NA, PDA dan MEA
Alat : cawan petri steril, lampu spiritus

D. Prosedur
1. Mikroba dari udara
a. Siapkan 3 cawan petri steril, dibuat 2 ulangan.

1
 b. Medium yang sudah disterilkan dicairkan dalam penangas air, setelah
mencair suhu dibiarkan turun hingga 45 50oC.
c. Tuang medium ke masing-masing cawan petri, setiap ulangan berisi
medium NA, PDA dan MEA.
d. Ratakan medium yang telah dituang dengan cara memutar-mutar cawan
petri di atas meja, biarkan dingin dan memadat.
e. Cawan petri pada ulangan 1 dibuka diudara terbuka selama 10 menit,
sedang pada ulangan 2 tidak dibuka (sebagai kontrol).
f. Cawan kembali ditutup dan selanjutnya diinkubasikan dengan cara cawan
dibalik, inkubasi pada suhu ruang selama 2 x 24 jam.
g. Amati mikroba yang tumbuh dan mikroba apa yang dominan tumbuh pada
masing-masing medium (medium NA, PDA, dan MEA) serta gambarkan
morfologi koloni (bentuk koloni).

2. Mikroba dari air

a. Siapkan 3 cawan petri steril dan air yang akan diuji (air sumur/air sungai).
b. Ambil sebanyak 1 ml air sampel teteskan ke dalam masing-masing cawan
petri steril yang masih kosong, tutup kembali.
c. Medium yang sudah disterilkan dicairkan dalam penangas air, setelah
mencair suhu dibiarkan turun hingga 45 50oC.
d. Tuang medium ke masing-masing cawan petri steril, setiap cawan berisi
medium NA, PDA dan MEA.
e. Ratakan medium yang telah dituang dengan cara memutar-mutar cawan
petri di atas meja, biarkan dingin dan memadat.
f. Selanjutnya diinkubasikan dengan cara cawan dibalik, inkubasi pada suhu
ruang selama 2 x 24 jam.
g. Amati mikroba yang tumbuh dan mikroba apa yang dominan tumbuh pada
masing-masing medium (medium NA, PDA, dan MEA) serta gambarkan
morfologi koloni (bentuk koloni).

2
3. Mikroba dari tanah
a. Siapkan 3 cawan petri steril dan tanah yang akan diuji.
b. Ambil kira-kira 1 gram tanah dan larutkan dalam 5 ml larutan 0,85% NaCl
steril.
c. Pipet sebanyak 1 ml larutan tanah teteskan ke dalam masing-masing cawan
petri steril yang masih kosong, tutup kembali.
d. Medium yang sudah disterilkan dicairkan dalam penangas air, setelah
mencair suhu dibiarkan turun hingga 45 50oC.
e. Tuang medium ke masing-masing cawan petri, setiap cawan berisi medium
NA, PDA dan MEA.
f. Ratakan medium yang telah dituang dengan cara memutar-mutar cawan
petri di atas meja, biarkan dingin dan memadat.
g. Selanjutnya diinkubasikan dengan cara cawan dibalik, inkubasi pada suhu
ruang selama 2 x 24 jam.
h. Amati mikroba yang tumbuh dan mikroba apa yang dominan tumbuh
pada masing-masing medium (medium NA, PDA, dan MEA) serta
gambarkan morfologi koloni (bentuk koloni).

4. Mikroba dari makanan

a. Siapkan 3 cawan petri steril dan makanan yang akan diuji.
b. Ambil kira-kira 1 gram makanan dan larutkan dalam 5 ml larutan 0,85%
NaCl steril.
c. Pipet sebanyak 1 ml larutan makanan teteskan ke dalam masing-masing
cawan petri steril yang masih kosong, tutup kembali.
d. Medium yang sudah disterilkan dicairkan dalam penangas air, setelah
mencair suhu dibiarkan turun hingga 45 50oC.
e. Tuang medium ke masing-masing cawan petri, setiap cawan berisi medium
NA, PDA dan MEA.
f. Ratakan medium yang telah dituang dengan cara memutar-mutar cawan
petri di atas meja, biarkan dingin dan memadat.

3
g. Selanjutnya diinkubasikan dengan cara cawan dibalik, inkubasi pada suhu
ruang selama 2 x 24 jam.
h. Amati mikroba yang tumbuh dan mikroba apa yang dominan tumbuh
pada masing-masing medium (medium NA, PDA, dan MEA) serta
gambarkan morfologi koloni (bentuk koloni).

4
 ACARA II
ISOLASI BAKTERI

A. Pendahuluan
Di alam mikroba pada umumnya berada dalam keadaan tercampur, antara
bakteri, kapang dan yeast dan juga antar spesies mikroba yang sejenis. Untuk
mendapatkan mikroba secara murni (spesies tunggal) maka perlu mengisolasinya.
Ini berarti bahwa spesies tersebut harus dipisahkan dari kelompok mikroba atau
spesies yang lainnya.
Sel mikroba sangat kecil, sehingga apabila diinginkan untuk diambil satu
sel dari suatu kelompok mikroba sangat sulit dan memerlukan peralatan yang
mahal. Untuk mengatasi hal tersebut dapat dilakukan dengan menumbuhkan
campuran sel pada suatu medium padat di dalam cawan petri. Dengan cara ini
setiap sel akan tumbuh membentuk koloni, sehingga memudahkan untuk
memisahkannya.
Cara dalam isolasi dilakukan dengan metode tuang (pour plate) dan
dilanjutkan metode goresan (streak plate) dan diakhiri dengan membuat kultur
simpanan pada agar miring (slant culture) untuk mikroba aerob dan agar tegak
(stab culture) untuk mikroba anaerob. Metode tuang dimaksudkan untuk
menyebarkan campuran mikroba dari bahan yang mengandung mikroba. Dari
mikroba yang tumbuh, diambil satu koloni yang selanjutnya digoreskan pada agar
dalam cawan untuk memisahkan sel-sel mikroba yang barangkali masih ada jenis
atau spesies mikroba yang berbeda. Hal tersebut biasanya dilakukan lebih dari satu
kali sampai diperoleh koloni yang murni yang berasal dari satu jenis mikroba dan
spesies yang sama.
Suatu hal yang menguntungkan adalah bahwa setiap mikroba yang berbeda
sifat genetiknya akan membentuk koloni dengan karakter yang berbeda, baik
ukuran, bentuk maupun warna koloni. Yang perlu diperhatikan adalah koloni
yang akan diambil harus terpisah dari koloni lainnya. Ini berarti bahwa hasil
goresan yang baik adalah yang dapat menghasilkan koloni-koloni terpisah dengan
jarak lebih dari 2 mm, sehingga mudah diambil.

5
B. Tujuan
Mempelajari dan mempraktekan beberapa tahapan dalam isolasi mikroba.

C. Bahan dan alat

1. Medium NA.
2. Sampel sebagai sumber mikroba.
3. Alat : cawan petri steril, tabung reaksi, jarum ose, lampu spiritus.

D. Prosedur
1. Metode tuang (pour plate)
a. Siapkan medium NA steril dengan suhu sekitar 45 50oC.
b. Siapkan cawan petri steril yang masih kosong, teteskan ke dalam cawan 1
ml akuades steril, tetesan diusahakan di tengah cawan.
c. Ambil 1 ose bakteri (dari Acara I dalam medium NA) masukkan dalam
cawan petri dan campurkan dengan akuades yang sudah diteteskan.
d. Tuang medium NA ke dalam cawan, ratakan.
e. Bungkus cawan petri dan inkubasikan selama 2 hari dalam posisi terbalik.

2. Metode goresan (streak plate)

a. Siapkan medium NA steril dengan suhu sekitar 45 50oC.
b. Tuangkan medium ke dalam cawan petri steril, ratakan dan biarkan dingin
dan memadat.
c. Ambil 1 ose bakteri (dari Acara I dalam medium NA) goreskan pada
permukaan agar dalam cawan petri, selama menggores tutup cawan dibuka
secukupnya.
d. Salah satu cara menggoreskan mikroba pada agar cawan adalah goresan
kuadran. Cawan petri dibagi menjadi 4 bagian, goreskan sebanyak 3 baris
pada bagian pertama. Kemudian goresan berikutnya pada bagian
kedua sebanyak 3 baris menyambung goresan yang pertama, dimana akhir
goresan pertama digunakan sebagai awal goresan kedua, demikian
seterusnya sampai bagian keempat.

6
 e. Setiap akan digunakan jarum ose dicelupkan dalam alkohol dan dipijarkan,
kemudian didinginkan dengan cara ditusukan pada bagian pinggir agar
dalam cawan. Demikian pula jika goresan pindah dari bagian pertama ke
bagian berikutnya.
f. Kemudian cawan petri dibungkus dan selanjutnya diinkubasikan selama 2
hari.

3. Agar miring (slant culture)

a. Siapkan medium agar miring steril dalam tabung reaksi.
b. Ambil 1 ose bakteri yang telah murni (ambil koloni yang terpisah dari
lainnya) goreskan secara zig-zag pada permukaan agar. Goresan dimulai
dari ujung tabung (bagian bawah) sampai akhir medium (bagian atas),
tabung reaksi ditutup kembali dengan kapas dan plastik.
c. Inkubasikan selama 2 hari.

4. Agar tegak (stab culture)

a. Siapkan medium agar tegak steril dalam tabung reaksi.
b. Ambil 1 ose bakteri dan tusukan ke dalam agar sepanjang kira-kira
bagian. Jarum ose yang digunakan yang ujungnya runcing. Tabung reaksi
ditutup kembali dengan kapas dan plastik.
c. Inkubasikan selama 2 hari.

Pengamatan : amati pertumbuhan mikroba pada berbagai metode dan gambarkan

morfologi koloni.

7
 ACARA III
PENGECATAN GRAM PADA BAKTERI

A. Pendahuluan
Pengecatan pada bakteri dapat dibedakan menjadi tiga yaitu : 1) pengecatan
sederhana, 2) pengecatan diferensial, dan 3) pengecatan struktural. Pengecatan
sederhana yaitu pengecatan pada sel dengan hanya menggunakan satu macam zat
warna dan proses pengecatan juga hanya satu tahap. Pengecatan ini ditujukan untuk
mengamati bentuk sel dengan mewarnai seluruh sel. Pengecatan diferensial
menggunakan kombinasi zat warna, hal ini berkaitan dengan perbedaan kimia antar
sel. Pengecatan ini mewarnai seluruh sel dari bakteri tipe tertentu. Yang termasuk
pengecatan ini adalah pengecatan Gram. Sedangkan pengecatan struktural hanya
mewarnai bagian tertentu dari sel. Tujuan pengecatan ini adalah untuk
membedakan bagian-bagian dari sel, contohnya pengecatan pada endospora,
flagela, kapsul, dsb.
Pengecatan Gram termasuk pengecatan diferensial karena dapat digunakan
untuk membedakan bakteri dalam dua kelompok besar, yaitu bakteri Gram positif
dan Gram negatif. Perbedaan dari dua kelompok bakteri tersebut disebabkan oleh
perbedaan lapisan dinding selnya. Pada bakteri Gram positif menunjukkan warna
biru-ungu, sedang bakteri Gram negatif berwarna merah.
Dalam pewarnaan diperlukan empat macam reagen, yaitu : 1). Zat warna
utama yaitu kristal violet, 2). Mordan adalah senyawa yang digunakan untuk
mngintensifkan warna utama yaitu berupa larutan Iodin, 3). Reagen untuk pencuci/
peluntur zat warna adalah pelarut organik yang digunakan untuk melunturkan zat
warna utama, reagen tersebut adalah alkohol atau aseton, dan 4). Zat warna kedua
yaitu safranin, digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan
cat utama setelah perlakuan dengan alkohol.

B. Tujuan
Untuk menentukan Gram positif dan Gram negatif pada bakteri yang di uji.
C. Bahan dan alat
1. Biakan murni Bacillus subtilis dan Eschericia coli.

8
 2. Reagen kristal violet, larutan Iodin, etanol 95%, dan safranin.
3. Peralatan : gelas benda dan gelas penutup, pipet tetes, lampu spiritus,
mikroskop.
D. Prosedur
1. Bersihkan gelas benda dan gelas penutup dengan alkohol sampai bebas
lemak dan debu. Ambil kultur bakteri dalam medium cair menggunakan
pipet, teteskan diatas gelas benda 3 tetes, biarkan agak mengering.
2. Lakukan fiksasi dengan cara melewatkan diatas nyala api, sampai
mengering.
3. Teteskan pewarna kristal violet dan biarkan selama 1 menit. Cuci dengan
air mengalir dan kering anginkan.
4. Tetesi dengan beberapa tetes larutan iodin, biarkan selama 1 menit. Cuci
dengan air mengalir dan kering anginkan.
5. Miringkan gelas obyek, cuci dengan etanol selama 20 30 detik atau
sampai warna biru tidak luntur lagi.
6. Teteskan cat penutup safranin, biarkan selama 2 menit. Cuci dengan air
mengalir dan kering anginkan.
7. Tutup bagian yang ada preparatnya dengan gelas penutup. Amati hasil
pengecatan dibawah mikroskop menggunakan lensa obyektif minyak
imersi. Catat hasil pengecatan Gram (+ atau -), catat pula bentuk sel dan
ciri-ciri yang lain (cara pengelompokan) misalnya sel tunggal, berpasangan,
membentuk rantai atau bergerombol.

9
 ACARA IV
PENGHITUNGAN KOLONI BAKTERI

A. Pendahuluan
Metoda yang dapat digunakan untuk menentukan jumlah mikroba di dalam
bahan pangan antara lain metoda hitungan cawan, metoda MPN (Most Probable
Number) dan penghitungan secara langsung dengan mikroskop.
Prinsip dari metoda hitungan cawan adalah menumbuhkan mikroba yang
masih hidup pada medium agar, sel akan tumbuh dan berkembang biak membentuk
koloni yang dapat dilihat langsung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop.
Satu koloni diasumsikan tumbuh dari satu sel. Jumlah koloni yang tumbuh pada
setiap cawan petri yang memenuhi syarat untuk penghitungan yaitu antara 30
300, karena jumlah tersebut secara statistik memberikan akurasi yang baik.
Pada bahan pangan yang diperkirakan mengandung lebih dari 300 sel per ml
atau per gram, maka perlu dilakukan pengenceran sebelum ditumbuhkan pada
medium agar. Pengenceran biasanya dilakukan secara desimal yaitu 1 : 10 (10 -1), 1
: 100 (10-2), 1 : 1000 (10-3), 1 : 10000 (10-4) dan seterusnya.
Larutan yang digunakan untuk pengenceran sebaiknya memiliki sifat osmotik
yang sama dengan mikroba atau dapat mempertahankan keseimbangan ion-ion dari
mikroba. Hal ini disebabkan supaya selama dalam pengenceran tidak terjadi
kerusakan sel, juga dijaga supaya tidak terjadi perbanyakan sel. Larutan pengencer
yang biasanya digunakan adalah bufer fosfat, larutan garam fisiologis (0,85%) atau
0,1% larutan pepton water.
Jumlah koloni bakteri dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut:

1
Jumlah koloni = jumlah koloni dalam cawan x -----------------------------
(per ml bahan) faktor pengenceran

B. Tujuan
Menghitung jumlah koloni bakteri menggunakan metode hitungan cawan.

10
C. Bahan dan alat
1. Kultur bakteri dalam medium cair
2. Larutan 0,85% NaCl
3. Medium NA
4. Alat : tabung reaksi, cawan petri, pipet ukur 1 ml

D. Prosedur
1. Siapkan larutan pengencer dan beri label sesuai dengan pengenceran yang
ditetapkan yaitu 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 dan 10-5 masing-masing ditandai
dengan A, B, C, D dan E.
2. Ambil dengan pipet sebanyak 1 ml kultur bakteri yang akan dihitung dan
masukkan ke dalam tabung A, kocok perlahan supaya tercampur merata.
3. Ambil dengan pipet yang berbeda sebanyak 1 ml kultur bakteri pada
tabung A dan masukkan ke dalam tabung B, kocok perlahan. Lakukan hal
yang sama sampai ke tabung E, dan setiap memindahkan kultur dalam
pengenceran ini menggunakan pipet yang berbeda.
4. Siapkan cawan petri steril dan medium NA yang siap dituang (suhu sekitar
45 50oC).
5. Lakukan penanaman (plating) kultur bakteri yang sudah diencerkan pada
medium agar dari tabung dengan pengenceran tinggi.
6. Ambil masing-masing sebanyak 1 ml kultur dalam tabung C, D dan E dan
teteskan ke dalam cawan petri steril yang masih kosong. Ke dalam cawan-
cawan tersebut tuang medium NA, goyangkan/putar-putar cawan agar
bakteri tersebar merata.
7. Inkubasikan pada suhu 37oC selama 2 hari. Pada akhir inkubasi hitung
jumlah koloni bakteri dalam cawan, pilih cawan petri yang memenuhi
syarat perhitungan koloni. Jumlah bakteri dalam sampel dapat dihitung
menggunakan rumus.

11
 ACARA V
AKTIVITAS MIKROBA

A. Pendahuluan
Aktivitas mikroba diartikan sebagai kegiatan yang berkaitan dengan
pertumbuhan, perkembang biakan dan pembentukan sel-sel baru. Semua aktivitas
sel tersebut dilakukan oleh berbagai enzim yang terdapat dalam sel mikroba.
Untuk berlangsungnya aktivitas tersebut, sel mikroba akan menggunakan
komponen-komponen dalam lingkungannya (substrat/medium) sebagai sumber
enersinya.
Jika di dalam substrat terdapat senyawa sederhana seperti monosakarida,
asam amino atau asam lemak, maka mikroba langsung dapat menggunakannya.
Namun jika di dalam medium dimana mikroba tumbuh terdapat senyawa
makromolekul seperti polisakarida, protein dan lemak, maka untuk dapat
menggunakan senyawa-senyawa tersebut mikroba akan mengeluarkan enzim untuk
mendegradasi makromolekul menjadi molekul yang sederhana. Berlangsungnya
reaksi-reaksi oleh enzim tersebut dapat diketahui dengan berbagai cara, diantaranya
dengan melihat produk akhir dari reaksi enzim tersebut atau dihasilkannya senyawa
hasil aktivitas enzim.
Karbohidrat merupakan sumber enersi utama bagi kebanyakan mikroba.
Masing-masing mikroba berbeda dalam kemampuannya menggunakan berbagai
karbohidrat, dan dalam caranya memecah karbohidrat. Misalnya, metabolisme
glukosa akan dihasilkan berbagai asam organik seperti asam asetat, asam laktat
maupun asam organik yang lain. Demikian juga dari pemecahan glukosa tersebut
ada yang dihasilkan gas (metana, hidrogen, karbon dioksida) atau tidak. Hasil
akhir pemecahan karbohidrat tersebut dapat dilihat melalui berbagai pereaksi.
Terbentuknya asam dapat diketahui dengan terjadinya perubahan pH medium, hal
ini dapat diketahui dengan menambahkan indikator pada medium sebelum
dilakukan inokulasi, sedang dihasilkannya gas dapat ditampung menggunakan
tabung Durham. Misal indikator Bromo Thymol Blue, dalam kondisi basa
berwarna biru, sedang dalam kondisi asam berubah menjadi kuning.

12
 Seperti juga pemecahan pada makromolekul misalnya pati oleh enzim
amilase dapat diketahui dengan menambahkan larutan yod pada akhir inkubasi.
Jika berwarna biru disekitar koloni berarti pati belum dihidrolisis oleh enzim,
tetapi apabila disekitar koloni nampak zona jernih dan tidak berwarna, maka
mikroba telah menghidrolisis pati dengan enzim amilase (mikroba mengeluarkan
enzim amilase). Sedang untuk pengujian hidrolisis protein biasanya digunakan
medium skim milk agar, jika disekitar koloni mikroba tampak jernih berarti terjadi
hidrolisis pada protein.

B. Tujuan
Mempelajari aktivitas mikroba dalam pemecahan mono dan disakarida,
polisakarida (pati) serta polipeptida (protein).

C. Bahan dan alat

1. Medium cair yang mengandung glukosa, fruktosa, sukrosa dan laktosa serta
indikator bromo thymol blue.
2. Medium padat : medium agar pati dan skim milk agar, larutan yod.
3. Kultur murni Bacillus subtilis dan E. coli
4. Jarum ose, lampu spiritus

D. Prosedur
1. Uji pemecahan mono dan disakarida
a. Siapkan medium cair dalam tabung reaksi yang berisi glukosa, fruktosa,
sukrosa dan laktosa yang telah diberi indikator dan tabung Durham,
masing-masing dua ulangan.
b. Pada masing-masing tabung diinokulasikan dengan 1 ose kultur murni B.
subtilis dan E. coli.
c. Inkubasikan selama 2 hari.
d. Amati perubahan yang terjadi, jika menghasilkan asam-asam organik akan
terjadi perubahan warna biru menjadi kuning, terbentuknya gas dapat
diamati dalam tabung Durham.

13
2. Uji hidrolisis pati
a. Siapkan medium agar pati yang telah dicairkan dalam penangas air dan
suhunya turun menjadi 45 50oC, tuang ke dalam cawan petri steril,
ratakan dan dinginkan supaya memadat.
b. Buat garis dibagian bawah cawan, membagi menjadi dua bagian.
c. Ambil 1 ose B. subtilis dan 1 ose E. coli yang masing-masing digoreskan
pada bagian cawan petri (bentuk goresan lurus, panjang 2 cm).
d. Inkubasikan selama 2 hari.
e. Amati adanya zona jernih dengan meneteskan larutan yod pada sekitar
koloni bakteri.

3. Uji hidrolisis protein

a. Siapkan medium skim milk agar yang telah dicairkan dalam penangas air
dan suhunya turun menjadi 45 50oC, tuang ke dalam cawan petri steril,
ratakan dan dinginkan supaya memadat.
b. Buat garis dibagian bawah cawan, membagi menjadi dua bagian.
c. Ambil 1 ose B. subtilis dan 1 ose E. coli yang masing-masing digoreskan
pada bagian cawan petri (bentuk goresan lurus, panjang 2 cm).
d. Inkubasikan selama 2 hari.
e. Amati adanya zona jernih di sekitar koloni bakteri.

14
15