PETUNJUK PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI PANGAN

Disusun Oleh:

1. Prof. Dr. Rifda Naufalin, S.P., M.Si.

2. Isti Handayani, S.TP., M.P.
3. Gunawan Wijonarko, S.P., M.P.
4. Karseno, S.P., M.P., Ph.D.

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN

FAKULTAS PERTANIAN
PROGRAM STUDI ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN
PURWOKERTO
2014
 ACARA I
PENGARUH ANTIMIKROBA TERHADAP PERTUMBUHAN MIKROBA

A. Pendahuluan
Menurut Pelezar dan Reid (1979) dalam Sumarto (2008), senyawa antimikroba adalah
senyawa biologis atau kimia yang dapat menghambat pertumbuhan dan aktivitas mikroba. Senyawa
antimikroba dapat bersifat bakterisidal (membunuh bakteri), bakteristatik (menghambat pertumbuhan
bakteri), fungsisidal (membunuh kapang), fungistatik (menghambat kapang), germisidal
(menghambat germinasi spora bakteri), dan sebagainya (Fardiaz, 1992). Mekanisme aktivitas
antimikroba menurut Davidson dan Branen (2005) dalam Sumarto (2008) dapat melalui beberapa
faktor, antara lain (1) mengganggu komponen penyusun dinding sel, (2) bereaksi dengan membran
sel sehingga mengakibatkan peningkatan permeabilitas dan menyebabkan kehilangan komponen
penyusun sel, (3) menginaktifkan enzim esensial yang berakibat pada terhambatnya sintesis protein
dan destruksi atau kerusakan fungsi material genetik.
Senyawa antimikroba yang ditambahkan kedalam bahan pangan baik dapat berupa
antimikroba sintetis maupun alami. Antimikroba sintetis yang diperbolehkan oleh pemerintah dan
biasanya ditambahkan ke dalam bahan pangan antara lain natrium benzoat, sorbat, asam sitrat, asam
asetat. Antimikroba sintetis ini digunakan agar produk pangan yang mudah rusak mempunyai umur
simpan lebih lama. Sedangkan antimikroba alami yang biasanya ditambahkan kedalam makanan
adalah rempah-rempah seperti bawang merah, jahe, kunyit, kencur, lengkuas, dan sebagainya.
Antimikroba alami ini selain meningkatkan flavor pada makanan, juga dapat menghambat
pertumbuhan mikroba karena rempah-rempah mengandung senyawa bioaktif.
Menurut Pelezar (2008), beberapa ciri bakteri Gram-positif dan Gram-negatif, dapat dilihat
dalam tabel berikut:
Perbedaan Relatif
Ciri
Gram-positif Gram-negatif

Struktur dinding sel Tebal (15-80 nm) Tipis (10-15 nm)

Berlapis tunggal (mono) Berlapis tiga (multi)

Komposisi dinding sel Kandungan lipid rendah (1-4%) Kandungan lipid tinggi (11-12%)

Ada asam tekoat Tidak ada asam tekoat

 Genus bakteri yang termasuk gram negatif adalah Enterobactericeae, Salmonella spp,
Shigella spp, E.coli, Yersinia enterolitica. Sedangkan bakteri gram positif adalah Staphylococci,
Strepcocci, Enterococci, Clostridium, Bacillus. (Fardiaz, 1992).

B. Tujuan
Mengetahui pengaruh antimikroba terhadap aktivitas mikroba Gram positif dan negatif.
Mengetahui pengaruh antagonisme dan sinergisme antar mikroba terhaap bakteri Gram
positif dan negatif.

C. Bahan dan Alat

Cawan petri steril Kunyit
Pipet mikro Kencur
Kertas saring Whatman (cakram) Jahe
Jangka sorong Natrium benzoat 0,1%
Medium NA Asam asetat 0,1%
E. coli Asam sitrat 0,1%
Bacillus cereus Aquades (kontrol)

D. Prosedur Kerja
Penggunaan kertas cakram
1. Siapkan 2 cawan petri steril, masukkan masing-masing 1 ml starter mikroba
2. Medium dimasukkan ke dalam cawan petri steril dalam keadaan hangat 450C
3. Cawan diputar-putar untuk meratakan medium
4. Celupkan kertas cakram kedalam larutan pengawet selama 10 menit lalu kering anginkan dan
dimasukkan ke dalam cawan petri yang telah diisi medium
5. Medium diinkubasi selama 48 jam pada suhu ruang dan posisi cawan terbalik
6. Amati zona bening dan lakukan pengukuran penghambat antimikroba terhadap bakteri.
Pengamatan dilakukan 2 kali: setelah 24 jam dan 48 jam.

Penggunaan double kertas cakram

1. Siapkan 2 cawan petri steril, masukkan masing-masing 1 ml starter mikroba
2. Medium dimasukkan ke dalam cawan petri steril dalam keadaan hangat 45 0C
3. Cawan diputar-putar untuk meratakan medium
 4. Kertas cakram 1 dicelupkan kedalam larutan pengawet A selama 10 menit, lalu kering
anginkan dan dimasukkan ke dalam cawan petri yang telah diisi medium
5. Kertas cakram 2 dicelupkan kedalam larutan pengawet B selama 10 menit, lalu kering
anginkan dan dimasukkan ke dalam cawan petri yang telah diisi medium
(diletakkan diatas kertas cakram 1)
6. Medium diinkubasi selama 48 jam pada suhu ruang dan posisi cawan terbalik
7. Amati zona bening dan lakukan pengukuran penghambat antimikroba terhadap bakteri.
Pengamatan dilakukan 2 kali setelah 24 jam dan 48 jam.

Tabel pengamatan single kertas cakram:

Waktu Pengukuran zona bening
pengamatan Bakteri Antimikroba
I II III Rata-rata

E. coli

24 jam

Bacillus cereus

E. coli

48 jam

Bacillus cereus
Tabel pengamatan double kertas cakram:
Waktu Pengukuran zona bening
pengamatan Bakteri Antimikroba
I II III Rata-rata

E. coli
24 jam
Bacillus cereus

E. coli
48 jam
Bacillus cereus
 ACARA II
PENGARUH pH TERHADAP PERTUMBUHAN MIKROBA

A. Pendahuluan
Faktor yang mempengaruhi pertumbuhan mikroba dibagi menjadi 4 yaitu faktor intrinsik,
ekstrinsik, pengolahan dan implisit. Faktor intrinsik meliputi pH, Aw, potensial oksidasi-reduksi,
kendungan nutrisi, kandungan senyawa antimikroba, dan struktur biologi. Sedangkan faktor
ekstrinsik meliputi temperatur, kelembapan relatif lingkungan, dan susunan gas di lingkungan.
Mikroba umumnya hidup pada pH netral (6,6-7,5) namun setiap mikroba mempunyai nilai
pH minimum, pH optimum dan pH maksimum. pH pertumbuhan untuk bakteri adalah 4,0-8; kapang
1,5-12; sedangkan khamir mempunyai daerah pH 1,5-8,5. Berdasarkan daerah pH bagi
kehidupannya, mikroba dibedakan menjadi 3 golongan yaitu:
Mikroba asidofil, yaitu mikroba yang dapat tumbuh pada pH antara 2,0-5,0
Mikroba mesofil/neutrofil, yaitu mikroba dapat tumbuh pada pH antara 5,5-8
Mikroba alkalifil, yakni mikroba yang dapat tumbuh pada pH antara 8,5-9,5

B. Tujuan
Mengetahui pengaruh pH terhadap pertumbuhan mikroba gram positif dan negatif.

C. Bahan dan Alat

Cawan petri steril E. coli
Pipet mikro Bacillus cereus
Kertas saring Whatman (cakram) Asam sitrat (pH 3 dan 5)
Jangka sorong HCl (pH 3 dan 5)
Medium NA NaOH (pH 7 dan 9)

D. Prosedur Kerja
1. Siapkan 2 cawan petri steril, masukkan masing-masing 1 ml starter mikroba
2. Medium dimasukkan ke dalam cawan petri steril dalam keadaan hangat 45 0C
3. Cawan diputar-putar untuk meratakan medium
4. Celupkan kertas cakram kedalam larutan per-pH tertentu selama 10 menit lalu kering
anginkan dan dimasukkan ke dalam cawan petri yang telah diisi medium
5. Medium diinkubasi selama 48 jam pada suhu ruang dan posisi cawan terbalik
 6. Amati zona bening dan lakukan pengukuran penghambat antimikroba terhadap bakteri.
Pengamatan dilakukan 2 kali setelah 24 jam dan 48 jam.

Tabel pengamatan:
Waktu Pengukuran zona bening
pengamatan Bakteri pH
I II III Rata-rata

E. coli

24 jam

Bacillus cereus

E. coli

48 jam

Bacillus cereus
 ACARA III
PENGARUH PEMANASAN TERHADAP MIKROBA

A. Pendahuluan
Mikroba tersebar luas di alam lingkungan dan dijumpai pula dalam makanan. Mikroba
dapat tumbuh dan berkembang dalam berbagai jenis makanan karena didalamnya terdapat bahan
organik dan anorganik yang dibutuhkan untuk kehidupan mikroba.
Pertumbuhan mikroba dapat dicegah dengan cara pengaturan kondisi yang
mempengaruhi metabolisme mikroba seperti suplai zat, suhu, pH, aktivitas air (aw), ketersediaan
oksigen, radiasi dan bahan- bahan kimia. Salah satu cara yang efektiv adalah dengan cara
pemanasan. Berdasarkan perbedaan suhu optimum, mikroba digolongkan menjadi psikrofilik,
mesofilik, dan termofilik. Psikrofilik adalah mikroba yang dapat tumbuh pada suhu antara -5 -
20oC. Mesofilik adalah mikroba yang dapat tumbuh pada suhu 10 45oC sedangkan termofilik
adalah mikroba yang dapat tumbuh pada suhu antara 25- 80oC.

B. Tujuan
Untuk mengetahui pengaruh pemanasan (suhu tinggi ) terhadap kematian mikroba.

C. Bahan dan Alat

Bahan : Alat :
- Biakan Escherichia coli dan Bacillus subtilis - Tabung reaksi
- Medium NA - Penangas air
- Akuades - Petridish
- NaCl 0,85% - Pipet steril

D. Prosedur Kerja
1. Disiapkan 16 tabung reaksi steril
2. Dimasukkan masing- masing ke dalam 8 tabung, 5 suspense E. coli dan 8 tabung lainnya
5 ml suspense B. subtilis yang sudah berumur 24 jam.
3. 4 tabung yang berisi E. coli dan 4 tabung yang berisi B. subtilisdimasukan dalam
penangas air dengan suhu 50oC. Sementara seri 4 tabung lainnya yang berisi E. colidan B.
subtilisdipanasakan dalam penangas air dengan suhu 70 oC.
4. Pemanasan dilakukan selama 0,10,20, dan 30 menit
5. Dilakukan pengenceran sampai 10-5 dan diplating dengan metode pour plate
 6. Cawan diinkubasi pada suhu ruang selama 48 jam dalam keadaan terbalik.
7. Dilakukan pengamatan, lalu dibuat tabel jumlah koloni yang tumbuh, gambar laju
kematian untuk masing- masing mikroba.

Tabel Pengamatan
Jumlah mikroba
Mikroba Waktu Pemanasan
Suhu 50oC Suhu 70oC

0 menit

E. coli 10 menit

20 menit

0 menit

B. subtilis 10 menit

20 menit

Grafik hasil pengamatan

 ACARA IV
PENGARUH PEMBEKUAN TERHADAP MIKROBA

A. Pendahuluan
Mikroorganisme dapat menimbulkan banyak bahaya dan kerusakan, hal ini tampak dari
kemampuananya dalam menginfeksi manusia, hewan, tanaman maupun makanan. Mikroba dapat
menimbulkan kerusakan fisik atau kimia dalam suatu makanan, sehingga makanan yang tercemar
berubah menjadi bersifat toksik.
Mikroba dalam makanan dapat dihambat dan dimatikan dengan perlakuan fisik maupun
kimia. Terdapat beberapa teknik pengendalian mikroba. Salah satunya dnegna penggunaan suhu
rendah (pembekuan, pendinginan). Prinsip dari penggunaan suhu rendah terhadap mikroba
adalah mengubah suhu menjadi dibawah suhu optimum sehingga dapat menekan laju
metabolisme serta menghentikan pertumbuhan mikroba.

B. Tujuan
Untuk mengetahui pengaruh suhu rendah pada berbagai media terhadap penghambatan
pertumbuhan mikroba.

C. Bahan dan Alat

Bahan:
1. Biakan Escherichia coli dan Bacillus subtilis
2. Medium NA
3. Akuades
4. NaCl 0,85%
5. Gliserol 10% : Susu skim 10% (1:1)
6. Larutan gula 10%
7. Pepton water 10%
Alat :
1. Tabung reaksi steril
2. Freezer
3. Cawan petri
4. Pipet steril
5. Erlenmeyer steril
D. Prosedur Kerja
1. Disipakan 4 buah tabung raksi 400 ml steril
2. Masing- masing tabung reaksi diisi :
- 9 ml (gliserol 10% : susu skim 10%) (1:1)
- 9 ml larutan gula 10%
- 9 ml akuades
- 9 ml pepton water 10%
3. Dimasukan 1 ml suspense suspense E. coli dan suspense B. subtilis yang sudah berumur
24 jam.
4. Tabung reaksi disimpan dalam freezer dan catat suhu freezer
5. Setelah 24 jam penyimpanan, segera dilakukan thawing dengan cepat, dengan cara
tabung reaksi dicelupkan secara bersamaan pada penangas air suhu 37 oC selama 10
menit.
6. Dilakukan pengenceran dan perhitungan sel yang hidup dengan metode cawan tuang
pada pengenceran 10-4 dan 10-5
7. Cawan diinkubasikan pada suhu ruang selama 24 jam dengan posisi terbalik
8. Dilakukan pengamatandan dibuat tabel jumlah koloni yang hidup.

Tabel pengamatan
Total Mikroba (TPC)

Mikroba Gliserol : Susu Larutan gula Peptone water Akuades

Skim 10% 10%

E. coli

B. subtilis
 ACARA V
PEMBUATAN PRODUK FERMENTASI

1. Pembuatan Yoghurt

A. Pendahuluan
Istilah yoghurt berasal dari bahasa Turki, yang berarti susu asam. Yoghurt didefinisikan
sebagai bahan makanan yang berasal dari susu dengan bentuk yang menyerupai bubur atau es
krim, yang rasanya asam. Yoghurt merupakan produk kaya protein, memiliki kandungan
kalsium, riboflavin, vitamin B6 dan B12. Yoghurt dibuat melalui proses fermentasi
menggunakan campuran bakteri Streptococcus thermophilus dan Lactobacillus bulgaricus.
Kedua bakteri tersebut merupakan bakteri asam laktat dan menguraikan laktosa menjadi asam
laktat. Adanya asam laktat inilah yang menyebabkan yoghurt berasa asam. Proses fermentasi
menyebabkan kadar laktosa dalam yoghurt berkurang, sehingga yoghurt aman dikonsumsi oleh
lansia ataupun orang ynag alergi terhadap susu.
Lactobacillus bulgaricus adalah bakteri Gram positif berbentuk batang dan tidak
membentuk endospora. Dalam susu, Lactobacillus bulgaricus, akan mengubah laktosa menjadi
asam laktat. Bakteri ini bersifat termodurik dan homofermentatif, dengan suhu optimum untuk
pertumbuhannya sekitar 45oC. Kondisi optimum untuk pertumbuhannya adalah sedikit asam
yaitu pada pH sekitar 5,5. Streptococcus thermophilus adalah bakteri Gram positif berbentuk
bulat, sering pertumbuhannnya berbentuk rantai. Bakteri ini dapat diklasifikasikan sebagai
bakteri homofermentatif dan termodurik dengan pH optimum untuk pertumbuhannya sekitar 6,5
(Risa, 2013).
Yoghurt dengna kualitas yang baik diperoleh jika susu yang digunakan berkualitas baik
pula. Suus yang berkualitas baik ini berasal dari hewan yang sehat, mempunyai bau susu yang
normal, dan tidak terkontaminasi. Selain itu, jenis bakteri yang digunakan dalam fermentasi, cara
pembuatan, dan cara penyimpanan setelah fermentasi (Rochintaniawati, 2013). Proses dasar
pembuatan yoghurt terbagi menjadi beberapa langkah, meliputi pemanasan awal susu
(pasteurisasi), inokulasi, fermentasi dan refrigerasi. Setiap tahapan mempengaruhi karakteristik
produk akhir yoghurt.
 B. Tujuan
- Mengetahui pembuatan yoghurt
- Mengetahui aplikasi mikroba pada olahan pangan

C. Bahan dan Alat

- Susu sapi segar
- Susu skim 10%
- Erlenmeyer 250 ml
- Bakteri Streptococcus thermophilus dan Lactobacillus bulgaricus( konsentrasi 5% ;
7,5%; dan 10% )
- Gula

D. Prosedur Kerja
1. 100 ml susu ditambah gula 10% (v/v) ditempatkan ke dalam Erlenmeyer
2. Pasteurisasi pada suhu 85oC selama 15 detik
3. Cooling hingga 40-45oC
4. Masukan inokulum bakteri kedalam susu pasteurisasi secara steril
5. Inkubasi susu selama 24 jam pada suhu 37oC
6. Amati pH yoghurt dan organoleptiknya pada 15 panelis.

2. PEMBUATAN TAPE

- Alat - Bahan
1. Baskom 1. Singkong
2. Kain Lap 2. Air secukupnya
3. Kompor 3. Daun Pisang
4. Panci Kukus 4. Ragi Tape
5. Penyaring
6. Piring
7. Pisau
 8. Sendok & Garpu

CARA KERJA
1. Kupas singkong dan kikis bagian kulit arinya hingga kesat.
2. Potong singkong yang telah dikupas, kemudian cuci hingga bersih.
3. Kukus singkong hingga matang (daging singkong sudah bisa ditusuk dengan garpu)
4. Setelah matang, angkat singkong lalu taruh di wadah, kemudian didinginkan.
5. Setelah singkong benar benar dingin, masukkan ke dalam wadah yang telah dilapisi dengan
daun pisang lalu taburi dengan ragi yang telah dihaluskanmenggunakansaringan.
6. Singkong kemudian dibungkus rapat dengan daun pisang.
7. Diamkan selama 1-2 hari hingga terasa lunak dan manis.
8. Amati sifat organoleptiknya

3. PEMBUATAN TEMPE

- Alat - Bahan
1. Baskom 1. Kacang Kedelai
2. Saringan 2. Ragi Tempe
3. Dandang 3. Pembungkus (plastik atau daun pisang )
4. Kipas Angin
5. Pengaduk
6. Tampah
7. Kompor

PROSEDUR

1. Kacang kedelai di sortasi kemudian cuci hingga bersih.

2. Rendam kacang kedelai yang telah bersih selama 12-18 jam dengan air dingin biasa (proses
hidrasi agar biji kedelai menyerap air sebanyak mungkin ).

3. Setelah direndam, kedelai diremas-remas untuk melepaskan kulit arinya.

4. Kedelai dicuci kembali sampai bersih.

5. Rebus kedelai dengan air secukupnya sampai mendidih, 30 menit .

6. Setelah biji kedelai terasa empuk, tuangkan biji-biji tersebut pada tampah yang telah
dibersihkan, lalu diangin-angin dengan kipas angin sambil diaduk-aduk hingga biji-biji
tersebut terasa hangat.

7. Taburkan (0,25%, 0,5%, 0,75%) ragi tempe sedikit demi sedikit sambil diaduk-aduk supaya
merata.

8. Siapkan daun pisang untuk pembungkus lalu masukan kedelai ke dalam pembungkusnya
dengan ketebalan 2-3 cm.

9. Proses fermentasi kacang kedelai dilakukan pada suhu kamar selama satu atau dua hari
hingga seluruh permukaan kacang kedelai tertutupi jamur.

Amati sifat organoleptiknya