LAPORAN PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI DASAR

ACARA III

PENGECATAN GRAM PADA BAKTERI

Oleh:
Kelompok 2 Rombongan 2
Penanggung Jawab :
Annisa Wulansari (A1F015026)

KEMENTERIAN RISET, TEKNOLOGI DAN PENDIDIKAN TINGGI

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS PERTANIAN
PURWOKERTO
2016
 I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Titrasi pengendapan merupakan titrasi yang melibatkan pembentukan

endapan dari garam yang tidak mudah larut antara titran dan analit. Hal dasar

yang diperlukan dari titrasi jenis ini adalah pencapaian keseimbangan

pembentukan yang cepat setiap kali titran ditambahkan pada analit, tidak adanya

interferensi yang mengganggu titrasi, dan titik akhir titrasi yang mudah diamati.

Salah satu jenis titrasi pengendapan yang sudah lama dikenal adalah

melibatkan reaksi pengendapan antara ion halida ( Cl-, I-, Br- ) dengan ion perak

Ag+. Titrasi ini biasanya disebut sebagai argentometri, yaitu titrasi penentuan

analit yang berupa ion halida dengan menggunakan larutan standar perak nitrat

AgNO3.

Dasar titrasi argentometri adalah pembentukan endapan yang tidak mudah

larut antara titrant dan analit. Sebagai contoh yang banyak dipakai adalah titrasi

penentuan NaCl dimana ion Ag+ dari titran akan bereaksi dengan ion Cl- dari

analit membentuk garam yang tidak mudah larut.

B. Tujuan

Praktikum ini dilaksanakan dengan tujuan untuk menentukan Gram

positif fan Gram negatif pada bakteri yang di uji.
 II. TINJAUAN PUSTAKA

Mikrobioligi adalah ilmu yang mempelajari makhluk-makhluk hidup

yang kecil, yang hanya dapat dilihat dengan mikroskop (mikros= kecil, bios= hidup,
dan logos= ilmu). Makhluk hidup yang kecil ini disebut mikroba atau mikro-
organisme. Bakteri berasal dari kata latin bacterium (jamak, bacteria) , adalah
kelompok raksasa dari organisme hidup. Mereka sangatlah kecil (mikroskopik) dan
kebanyakan uniseluler (bersel tunggal), dengan struktur sel yang relatif sederhana
tanpa nucleus (inti sel, cytoskeleton, dan organel lain seperti mitoondria dan
kloroplas. Istilah bakteria telah diterapkan untuk semua prokariota atau kelompok
besar mereka, tergantung pada gagasan mengenai hubungan mereka. Bakteri adalah
yang paling berkelimpahan dari semua organisme. Mereka tersebar (tersebar dimana-
mana) di tanah, air, dan sebagai simbiosis dari organisme lain. Banyak pathogen
merupakan bakteri. Kebanyakan dari mereka kecil, biasanya hanya berukuran 0,5,
meski ada jenis yang dapat mencapai 0,3mm. Meski umumnya memiliki dinding,
seperti sel tumbuhan dan jamur, tertapi dengan komposisi yang sanngat berbeda
(peptidoglikan). Banyak yang bergerak menggunakan flagella, yang berbeda dalam
strukturnya dari flagella kelompok lain. Bakteri pertama ditemukan oleh Anthony van
Leewenhoek pada tahun 1674. Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai
morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang
hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana el-sel bakteri tersebut di
suspensikan,. salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah
untuk diidentifikasi ialah degan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga
berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel
bakteri melalui serangakaian pengecatan (Entjang, 2003).

Bakteri merupakan organisme prokariot. Umumnya ukuran bakteri sangat

kecil, bentuk tubuh bakteri baru dapat dilihat dengan menggunakan mikroskop
dengan pembesaran 1.000 X atau lebih (Waluyo, 2004). Sel bakteri memiliki panjang
yang beragam, sel beberapa spesies dapat berukuran 100 kali lebih panjang daripada
sel spesies yang lain. Bakteri merupakan makhluk hidup dengan ukuran antara 0,1
sampai 0,3 m. Bentuk bakteri bermacam macam yaitu elips, bulat, batang dan
spiral. Bakteri lebih sering diamati dalam olesan terwarnai dengan suatu zat pewarna
kimia agar mudah diamati atau dilihat dengan jelas dalam hal ukuran, bentuk,
susunan dan keadaan struktur internal dan butiran. Sel sel individu bakteri dapat
berbentuk seperti bola/elips, batang (silindris), atau spiral (heliks) (Pelczar & Chan,
2007).
Pewarnaan bakteri bertujuan untuk memudahkan melihat bakteri dengan
mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan
struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-sifat fisik
dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan kontras
mikroorganisme dengan sekitarnya. Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat
dibedakan menjadi tiga macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan diferensial
dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain
dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan,
yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang
menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba
disebut teknik pewarnaan diferensial (Pelczar & Chan, 2007). Teknik pewarnaan
warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi tiga macam yaitu pengecatan sederhana,
pengecatan diferensial dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri atau
jasad- jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada
lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana.
Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba atau
bagian-bagian sel mikroba disebut teknik pewarnaan diferensial (Pelczar & Chan,
2007).
Bakteri yang diwarnai dengan teknik pewarnaan Gram terbagi dua
golongan, yaitu: Gram positif , bila warna zat pewarna pertama (karbol gentian violet)
tetap bertahan, dengan demikian warna se bakteri tampak ungu tua; dan Gram negatif,
bila warna zat pewarna pertama tidak bertahan (luntur) kemudian tercat oleh zat
pewarna tandingannya, misal: air fuchsin, safranin, dan oleh zat pewarna tandingan
lainnya. (Razali, 1987)
Penyebab terjadinya dua golongan bakteri yaitu Gram positif dan Gram
negatif ialah setelah diberi zat pewarna fenomenanya ini, berhubungan dengan
struktur dan komposisi dinding sel. Perbedaan ketebalan antara kedua golongan itu
dapat merupakan hal yang penting; dinding sel bakteri Gram negatif pada umumnnya
lebih tipis dari yang dimiliki bakteri Gram positif. Presentasi kandungan lipid bakteri
Gram negatif lebih tinggi daripada Gram positif. Kenyataannya dalam eksperimen
pengecatan mennjukkan bahwa perlakuan dengan alkohol mengeskstrak lipid, yang
menyebabkan poisitas atau permeabilitas didding sel meningkat. Denagn demikian,
kompleks karbol gentian violet dan lugol dapat disari keluar dan bakteri Gram negatif
terwarnakan. Keterangan lain yang hampir sama juga mendasarkan pada perbedaan
permeabilitas antara kedua golongan bakteri itu, yaitu pada bakteri Gram negatif
kandungan peptidoglikan jauh lebih sedikit sehingga kerapatan jalinannya jauh lebih
sedikit daripada baktri gram posiif. Pori-pori dalam peptidoglikan bakteri Gram
negatif tetap masih cukup besar untuk dapat disari keluar kompleks karbol gentian
violet dan lugol. Selautnya, bila sel-sel Gram psitif diperlakukan dngan lisozim untuk
menyingkirkan dinding selnya, sisa strukturnya yang disebut protoplas atau sel tanpa
dinding akan tercatat juga oleh kompleks karbol gentian violet dan lugol. Tetapi, sel
ini mudah dihapuskan oleh alkohol. Kenyataan ini menunjukkan bahwa struktur
dinding sel bakteri Gram positif itu yag menjadi tempat tertahannya zat pewarna
pertama yaitu karbol gentian violet. (Razali, 1987).
Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu
ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif.
Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena
reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang
digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri. Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua
golongan yaitu asam dan basa. Jika warna terletak pada muatan positif dari zat warna,
maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat pada ion negatif, maka disebut zat
warna asam. Contoh zat warna basa adalah methylen blue, safranin, netral red, dan
lain-lain. Sedangkan anionnya pada umumnya adalah Cl-, SO4-, CH3COO-,
COOHCOO. Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih
cepat dengan bagian sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan
bagian-bagian inti sel. Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti :
fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna
penutup (Sutedjo, 1991).
Prinsip dasar dari pewarnaan adalah adanya ikatan ion antara komponen
selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen.
Ikatan ion dapat terjadi karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler
maupun pada pewarna. Terdapat tiga mcam metode pewarnaan yaitu pewarnaan
sederhana, pewarnaan diferensial dan pewarnaan gram. Pewarnaan sederhana
menggunakan pewarna tunggal, pewarnaan diferensial memakai serangkaian larutan
pewarna atau reagen. Pewarnaan gram merupakan metode pewarnaan yang paling
umum digunakan untuk mewarnai sel bakteri (Umsl, 2008).
Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan ion negatif,
salah satu di antaranya berwarna. Pada zat warna yang bersifat basa, warna terdapat
pada ion positif (zat pewarna+ Cl-) dan pada pewarna asam, warna akan terdapat
pada ion negatif (zat pewarna- Na+). Hubungan antara bakteri dengan zat pewarna
basa yang menonjol disebabkan terutama oleh adanya asam nukleat dalam jumlah
besar dalam protoplasma sel. Jadi, jika bakteri itu diwarnai, muatan negatif dalam
asam nukleat bakteri akan bereaksi dengan ion positif zat pewarna basa, Kristal violet,
safranin dan metilin blue adalah beberapa zat pewarna basa yang biasa digunakan.
Sebaliknya zat pewarna asam ditolak oleh muatan negatif bakteri menyeluruh. Jadi,
mewarnai bakteri dengan zat pewarna asam akan menghasilkan hanya pewarnaan
pada daerah latar belakang saja. Karena sel bakteri tak berwarna di atas latar belakang
yang berwarna (Volk & Wheeler, 1993).
Pewarnaan gram ditemukan pada tahun 1884 oleh seorang dokter
kebangsaan Denmark Christian Gram (membuat zat pewarna khusus) pewarna
tersebut merupakan pewarna differensial karena dapat membagi bakteri menjadi dua
kelompok fisiologi, yang akan memudahkan untuk identifikasi. Prosedur pertama dari
pewarnaan gram ini adalah memberi pewarna kristal violet, setelah 1 menit dibilas
dan kemudian akan diberikan pewarna yodium, setelah satu menit dibilas dan
kemudian akan diberi laputan alkohol 95% selama 30 detik, kemudian dibilas dan
diberi pewarna safranin atau bismarck (untuk buta warna merah) selama 1 menit. Zat
pewarna kristal violet dan yodium akan membentuk senyawa yang kompleks.
Beberapa bakteri akan melepaskan zat pewarna dengan mudah apabila dicuci dan
beberapa bakteri yang lain zat pewarna akan bertahan walaupun dicuci dengan
alkohol 95%. Bakteri gram positif akan terwarna ungu (kristal violet) dan bakteri
gram negatif akan terwarna merah (safranin) (Umsl, 2008).
Pewarnaan terhadap bakteri yang paling sering dilakukan adalah
pewarnaan Gram dan ZiehlNelsen. Pewarnaan tersebut untuk mengetahui morfologi,
struktur, dan karakteristik bakteri. Pewarnaan Gram dapat mengidentifikasi penyakit
infeksi. Prosedur pewarnaan Gram dimulai dengan pemberian kristal violet, setelah
itu ditambahkan larutan iodium maka semua bakteri akan berwarna biru. Setelah itu
ditambah alkohol. Bakteri Gram positif membentuk kompleks Kristal iodine yang
berwarna biru. Setelah di tambahkan safranin, bakteri Gram positif akan berwarna
ungu. Contoh bakteri Gram positif adalah Streptococcus, Bacillus, Stapilococcus,
Clostridia, Corynebacterium dhypteriae, Peptococcus, Peptostreptococcus, dll.
Sedangkan bakteri Gram negatif akan terdekolorisasi oleh alcohol dan pemberian
safranin akan memberikan warna merah pada bakteri Gram negatif. Contoh bakteri
Gram negative adalah Neisseria, Klebesiella, Vellonella, Shigella, Salmonella,
Hemophillus, dll (Cappuccino & Sherman, 1983).
Proses pewarnaan gram ini memerlukan 4 jenis reagen. Bakteri terbagi
atas dua kelompok berdasarkan pewarnaan ini, yaitu bakteri gram positif dan bakteri
gram negatif. Perbedaan ini berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri.
Reagen pertama disebut warna dasar, berupa pewarna basa, jadi pewarna ini akan
mewarnai dengan jelas. Reagen kedua disebut bahan pencuci warna (decolorizing
agent). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bila
komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci
sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat mengikat warna dasar, maka warna
akan tercuci. Reagen terakhir adalah warna pembanding, bila warna tidak tercuci
maka warna pembanding akan terlihat, yang terlihat pada hasil akhir tetap warna
dasar. Larutan yang biasa dipakai adalah ungu kristal, lartan iodium, alkohol dan
safranin (Tracy, 2005).
Teori Salton menjelaskan bahwa ada konsentrasi lipid yang tinggi pada
dinding sel bakteri Gram negatif. Sehingga jika lipid dilarutkan dalam pemberian
alcohol, maka poripori akan membesar dan tidak mengikat pewarna. Hal ini
menyebabkan bakteri menjadi tidak berwarna. Sedangkan bakteri Gram positif akan
mengalami denaturasi selama pemberian alcohol. Hal ini akan mengecilkan poripori
sehingga menghasilkan kompleks kristal iodium. Bakteri Gram positif memiliki
dinding sel yang kuat dan lapisan peptidoglikan sebanyak 30 lapisan sehingga
permeabilitas dinding selnya menjadi berkurang. Sedangkan bakteri Gram negatif
hanya memiliki 12 lapisan peptidoglikan sehingga memiliki permeabilitas dinding
sel yang lebih besar. Pewarnaan Gram terdiri atas Gram A (violet) (Kristal violet,
Aalkohol, Ammonium oksalat, Aquades), Gram B (cokelat) (Iodium, Kalium iodide,
Aquades), Gram C (Aseton, Alcohol), Gram D (merah) (Safranin, Alcohol, Aquades)
(Madigan, 2003).
Pewarnaan gram ditemukan pada tahun 1884 oleh seorang dokter
kebangsaan Denmark Christian Gram (membuat zat pewarna khusus) pewarna
tersebut merupakan pewarna differensial karena dapat membagi bakteri menjadi dua
kelompok fisiologi, yang akan memudahkan untuk identifikasi. Prosedur pertama dari
pewarnaan gram ini adalah memberi pewarna kristal violet, setelah 1 menit dibilas
dan kemudian akan diberikan pewarna yodium, setelah satu menit dibilas dan
kemudian akan diberi laputan alkohol 95% selama 30 detik, kemudian dibilas dan
diberi pewarna safranin atau bismarck (untuk buta warna merah) selama 1 menit. Zat
pewarna kristal violet dan yodium akan membentuk senyawa yang kompleks.
Beberapa bakteri akan melepaskan zat pewarna dengan mudah apabila dicuci dan
beberapa bakteri yang lain zat pewarna akan bertahan walaupun dicuci dengan
alkohol 95%. Bakteri gram positif akan terwarna ungu (kristal violet) dan bakteri
gram negatif akan terwarna merah (safranin) (Umsl, 2008).
 Pewarnaan terhadap bakteri yang paling sering dilakukan adalah
pewarnaan Gram dan ZiehlNelsen. Pewarnaan tersebut untuk mengetahui morfologi,
struktur, dan karakteristik bakteri. Pewarnaan Gram dapat mengidentifikasi penyakit
infeksi. Prosedur pewarnaan Gram dimulai dengan pemberian kristal violet, setelah
itu ditambahkan larutan iodium maka semua bakteri akan berwarna biru. Setelah itu
ditambah alkohol. Bakteri Gram positif membentuk kompleks Kristal iodine yang
berwarna biru. Setelah di tambahkan safranin, bakteri Gram positif akan berwarna
ungu. Contoh bakteri Gram positif adalah Streptococcus, Bacillus, Stapilococcus,
Clostridia, Corynebacterium dhypteriae, Peptococcus, Peptostreptococcus, dll.
Sedangkan bakteri Gram negatif akan terdekolorisasi oleh alcohol dan pemberian
safranin akan memberikan warna merah pada bakteri Gram negatif. Contoh bakteri
Gram negative adalah Neisseria, Klebesiella, Vellonella, Shigella, Salmonella,
Hemophillus, dll (Cappuccino & Sherman, 1983).
Proses pewarnaan gram ini memerlukan 4 jenis reagen. Bakteri terbagi
atas dua kelompok berdasarkan pewarnaan ini, yaitu bakteri gram positif dan bakteri
gram negatif. Perbedaan ini berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri.
Reagen pertama disebut warna dasar, berupa pewarna basa, jadi pewarna ini akan
mewarnai dengan jelas. Reagen kedua disebut bahan pencuci warna (decolorizing
agent). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bila
komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci
sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat mengikat warna dasar, maka warna
akan tercuci. Reagen terakhir adalah warna pembanding, bila warna tidak tercuci
maka warna pembanding akan terlihat, yang terlihat pada hasil akhir tetap warna
dasar. Larutan yang biasa dipakai adalah ungu kristal, lartan iodium, alkohol dan
safranin (Tracy, 2005).
Teori Salton menjelaskan bahwa ada konsentrasi lipid yang tinggi pada
dinding sel bakteri Gram negatif. Sehingga jika lipid dilarutkan dalam pemberian
alcohol, maka poripori akan membesar dan tidak mengikat pewarna. Hal ini
menyebabkan bakteri menjadi tidak berwarna. Sedangkan bakteri Gram positif akan
mengalami denaturasi selama pemberian alcohol. Hal ini akan mengecilkan poripori
sehingga menghasilkan kompleks kristal iodium. Bakteri Gram positif memiliki
dinding sel yang kuat dan lapisan peptidoglikan sebanyak 30 lapisan sehingga
permeabilitas dinding selnya menjadi berkurang. Sedangkan bakteri Gram negatif
hanya memiliki 12 lapisan peptidoglikan sehingga memiliki permeabilitas dinding
sel yang lebih besar. Pewarnaan Gram terdiri atas Gram A (violet) (Kristal violet,
Aalkohol, Ammonium oksalat, Aquades), Gram B (cokelat) (Iodium, Kalium iodide,
Aquades), Gram C (Aseton, Alcohol), Gram D (merah) (Safranin, Alcohol, Aquades)
(Madigan, 2003).
,
 III. METODE PRAKTIKUM

A. Alat dan Bahan

1. Alat :

Alat alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah gelas benda, gelas
penutup, pipet tetes, lampu spiritus dan Mikroskop.

2. Bahan :

Bahan bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah Biakan murni
Bacillus Subtillis dan E.coli, Reagen kristal violet, larutan iodin, Etanol 95%,
dan Safranin.

B. Prosedur Kerja

Gelas benda dan gelas penutup dibersihkan dengan

alkohol sampai bebas lemak dan debu. Kultur bakteri
diambil dalam medium cair dengan pipet ditetesi
diatasi gelas benda 3 tetes, dibiarkan agak
mengering.

Dilakukan fiksasi dengan cara melewatkan diatas

nyala api sampai mengering.

Pewarnaan kristal violet diteteskan dan dibiarkan

selama 1 menit. Dicuci dengan air mengalir dan
dikering anginkan
Gelas objek dimiringkan, dicuci dengan etanol selama
20-30 detik atau sampai warna biru tidak luntur lagi.

Cat penutup safranin diteteskan, dibandingkan selama

2 menit. Dicuci dengan air mengalir dan dikering
anginkan.

Bagian yang ada preparatnya ditutup dengan gelas

penutup. Hasil pengecatan diamati dibawah mikroskop
menggunakan lensa objektif minyak imersin. Dicatat
hasil pengecatan gram + atau -, dicatat pula bentuk sel
dan ciri-ciri yang lain (cara pengelompokan) misalnya
setunggal, berpasangan, membentuk rantai atau
bergelombang.
 IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Pengamatan

Data pengamatan

Bakteri Warna Gambar

Koloni Merah
E.Coli

Koloni
Bacilus Biru
Subtilis

B. Pembahasan

Laporan praktikum mikrobiologi kali ini adalah pewarnaan dan

pengamatan morfologi pada bakteri. Pewarnaan Gram merupakan salah satu teknik
pewarnaan yang dikerjakan di laboratorium mikrobiologi untuk kepentingan
identifikasi mikroorganisme. Morfologi mikroskopik mikroorganisme yang
diperiksa dan sifatnya yang khas terhadap pewarnaan tertentu (pewarnaan gram)
dapat digunakan untuk identifikasi awal. Pewarnaan gram dibagi menjadi dua hasil
yaitu gram positif dan gram negative, tergantung dari reaksi dinding sel terhadap
tinta safranin atau Kristal violet.
Proses sterilisasi sangat penting dibutuhkan sebelum memulai maupun
mengakhiri sebuah pekerjaan di laboratorium dengan menggunakan teknik aseptik.
Alkohol 70% yang disemprotkan pada tangan, kaca preparat dan meja, bahkan
tangan pun sebelumnya harus dicuci dengan sabun terlebih dahulu. Hal tersebut
berfungsi untuk membunuh mikroorganisme yang tak diinginkan agar
mendapatkan pengukuran yang akurat.
Pada proses pewarnaan gram, harus gelas obyek yang bersih.
Pembersihan ini dilakukan supaya gelas obyek bebas lemak dan debu.
Pembersihan biasanya menggunakan alkohol. Setelah di cuci kemudian di beri
satu tetes aquades pada permukaan gelas obyek. Kultur bakteri murni diambil dan
diratakan diatas kaca obyek. Pengambilan kultur bakteri tidak diambil terlalu
banyak, karena jika terlalu banyak akan sulit diratakan dan apabila kultur bakteri
tidak dapat diratakan tipis-tipis maka bakteri akan tertimbun hal ini akan
mengakibatkan pemeriksaan bentuknya satu per satu menjadi tidak jelas.
Apabila sudah kering, dilakukan fiksasi dengan cara melewatkan diatas
nyala api. Proses fiksasi dilakukan supaya bakteri benar-benar melekat pada kaca
obyek sehingga olesan bakteri tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian.
Yang perlu diperhatikan dalam proses fiksasi adalah bidang yang mengandung
bakteri dijaga agar tidak terkena nyala api.
Fiksasi adalah suatu metode persiapan untuk menyiapkan suatu sampel
agar tampak realistik dengan menggunakan grutaldehid dengan proses pembakaran.
Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada objek
glass tanpa merusak struktur selnya (Lay, 1994)
Setelah dilakukan fiksasi kemudian ditetesi dengan larutan gram A
(methylene blue) sebanyak 1-2 tetes dan dibiarkan selama 1 menit. Kemudian
dicuci dengan air mengalir dan dibiarkan sampai kering dengan cara dianginkan
dan menggunakan tissue untuk mengeringkan bagian bawah ojek gelas. Pencucian
dengan air bertujuan untuk mengurangi kelebihan zat warna dari methylen blue.
Kemudian ditambahkan larutan gram B yang merupakan iodium. Gram
B merupakan larutan yang berfungsi untuk meningkatkan afinitas pengikatan zat
warna oleh bakteri sehingga pengikatan zat warna oleh bakteri lebih kuat,
memperjelas warna dari zat warna tersebut, mempersulit pelarutan zat warna. Pada
pewarnaan gram, penambahan larutan mordan menyebabkan terbentuknya
persenyawaan kompleks. Tanpa penambahan larutan mordan, zat warna methylene
blueakan larut saat penambahan larutan alkohol. Lalu dibiarkan selama 1 menit
untuk dibilas kembali dengan aquades. Akibat pemberian cat Gram B, maka
pengikatan warna oleh bakteri akan lebih baik (lebih kuat).
Alkohol 95% ditambahkan atau diteteskan pada biakan bakteri untuk
melakukan penetrasi ke dalam dinding sel dan melunturkan pewarnaan biru dari
komplek methylen blue dan KI pada gram negatif, karena mengandung lipid
sedangkan pada gram positif akan tetap mempertahankan warna biru karena
mengandung peptidoglikan. Larutan ini juga berfungsiuntuk melarutkan lipida
pada membrane bakteri gram negatif yang akan menyebabkan pori-pori sel
membesar sehingga meningkatkan daya larut persenyawaan methylene
blue.Perlakuan ini dilakukan tidak membutuhkan waktu yang lama atau secepat
mungkin untuk melakukan pembilasan dengan aquades. Kemudian dilakukan
pengeringan.
Pewarnaan selanjutnya dengan menggunakan safranin (gram D) sebanyak
2 tetes dan diamkan selama 30 detik. Safranin pada gram D tidak akan
menyebabkan perubahan warna pada bakteri positif karena persenyawaan
kompleks methylene blue tetap terikat pada dinding sel. Pada bakteri gram negatif
penambahan safranin akan menyebabkan warna bakteri berubah menjadi merah
karena warna biru yang dihasilkan oleh methylene blue telah luntur dengan
lisisnya membran sel sehingga safranin dapat terikat. Oleh sebab itu, gram D atau
zat pewarna kedua berfungsi sebagai pembeda terhadap zat warna kristal violet
(Lay, 1994). Kemudian cuci dengan air mengalir dan kering dianginkan, Cat ini
berwarna merah. Cat ini merupakan cat sekunder atau kontras. Cat ini berfungsi
untuk memberikan warna mikroorganisme non target. Cat sekunder mempunyai
spektrum warna yang berbeda dari cat primer. Kemudian preparat dikeringkan
dengan cara diangin-anginkan lalu dilakukan pengamatan di bawah mikroskop.
Pemberian methylen blue pada bakteri gram positif akan meninggalkan
warna biru. Perbedaan respon terhadap mekanis pewarnaan gram pada bakteri
adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram
positif mengandung protein dan gram negative mengandung lemak dalam
persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Pemberian alkohol (etanol) pada
praktikum pewarnaan bakteri, menyebabkan terekstraksi lipid sehingga
memperbesar permeabilitas dinding sel. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel
dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif
sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan
alkohol, pori pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun
sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna biru.
Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada
komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel
dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat
lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol
memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal
yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative
lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).
Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi,
peluntur warna , substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna
penutup. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci
dengan asam encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat juga
preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan
bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies
(Dwidjoseputro, 1994).
 Pada pengamatan ini bakteri yang digunakan adalah bakteri E.coli dan
Basillus subtilis. Namun setelah dibekukan pengamatan dibawah mikroskop, tidak
terdapat koloni bakteri didalamnya, baik itu E.Coli maupun Basillus suptilis.
Untuk E.Coli yang terlihat hanya tanda merah. Namun bukan merupkan bakteri.
E.Coli termasuk famili enteraceae yang termasuk gram negatif karena
berwarna merah. Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan
zat bwarna metil ungu pada meode pewarnaan gram. Bakteri gram negatif
berwarna merah muda.
Basillus subtilis termasuk gram positif. Ini diketahui pada saat tahap
dekotonisasi atau pemberian alkohol. Pada tahap tersebut warna yang dihasilkan
sama dengan warna utama, yaitu warna ungu. Ini membuktikan bahwa gram
positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci setelah bakteri yang
mempertahankan zat metil ungu sewaktu proses pewarnaan, gram bakteri jenis ini
akan berwarna biru/ungu dibawah mikroskop.
Penyebab warna ungu saat pewarnaan adalah Basillus suptilis memiliki
dinding sel tebal sehingga bakteri mengalami dehidrasi, pori-porinya menciut
akhirnya meneyabkan warna utama tidak bisa keluar.
 V. PENUTUP

A. Kesimpulan

Dari praktikum yang telah dilakukan, didapatkan hasil pengamatan

mengenai pengecatan gram pada bakteri, sebagai berikut :
1. Pewarnaan gram merupakan pewarnaan difrensial karena dapat digunakan
untuk membedakan antara bakteri gram negatif dan gram positif. Pewarnaan
ini sering digunakan untuk identifikasi dan klasifikasi bakteri. Komposisi
dinding sel bakteri gram positif berbeda dengan bakteri gram negatif sehingga
hasil pewarnaan gram akan berbeda.
2. Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan warna methylene
blue sewaktu proses pewarnaan gram. Bakteri ini mempunyai lapisan
peptidoglikan yang tebal.
3. Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan warna
methylene blue sewaktu prose pewarnaan gram. Bakteri ini mempunyai
lapisan peptidoglikan yang tipis.
4. Berdasarkan hasil pengamatan dapat diidentifikasi bahwa bakteri Bacillus sp.
merupakan golongan bakteri gram positif dan bakteri E.coli merupakan
golongan bakteri gram negatif.

B. Saran

Dalam melaksanakan praktikum mengenai pengecatan/pewarnaan bakteri,

diharapkan ketika dalam pemberian larutan warna dilakukan secara hati-hati dan teliti,
dan harus sesuai dengan prosedur yang telah ditentukan.
DAFTAR PUSTAKA

Cappuccino, J., G., & Natalie., S. 1983. Microbiology A Laboratory Manual.

Addison- Wesley Publishing Company : New York.

Dwidjoseputro. 1994. Mikrobiologi untuk Universitas. Ganesha Expect. Bandung.

Entjang, Indan. 2003. Mikrobiologi Dan Parasitologi Untuk Akademi Perawat

Dan Sekolah Tenaga Kesehatan yang Sederajat. PT. CITRA ADITIA
BAKTI. Bandung.

Lay, B.W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. PT Raja Grafindo Persada :

Jakarta.

Madigan, M.T. 2003. Brock Biology of Microorganism. Pearson Education : inc.

United State of America.

Pelczar, M. J., Chan, E.C.S. 2007. Elements of Microbiology. Mc Graw Hill Book
Company: New York.

Razali, U. 1987. Mikrobiologi Dasar. Jatinangor: FMIPA UNPAD.

Sutedjo, M. 1991. Mikrobiologi Tanah. Rineka Cipta. Jakarta.

Tracy. 2005. GramStaining. www.tracy.k12.ca.us/ thsadvbio/ pdfs/

gram%20stain.pdf, Diakses pada tanggal 7 Juni 2016.

Umsl. 2008. StainingBacteria. www.umsl.edu /~microbes/pdf/ stainingbacteria.pdf,

Diakses pada tanggal 7 Juni 2016.

Volk & Wheeler. 1993. Mikrobiologi Dasar. Penerbit Erlangga : Jakarta

Waluyo. 2004. Mikrobiologi Tanah. Jakarta : CV Rajawali.

LAMPIRAN

Dokumentasi

Bahan yang digunakan Dilakukan fiksasi Kultur bakteri

Untuk pengecatan diatas nyala api diambil

Dilakukan fiksasi kristal violet diteteskan Dibiarkan selama

1 menit

Dicuci dengan air Safranin diteteskan Dicuci dengan air

mengalir mengalir
dikering anginkan Hasil pengecatan diamati
dibawah mikroskop
menggunakan lensa
objektif