ACARA V

PEMBUATAN LARUTAN PENGENCER DAN MEDIA AGAR

A. Tujuan
Tujuan dari praktikum acara V pembuatan larutan pengencer dan media agar
adalah:
1. Mengetahui dan mampu membuat larutan pengencer.
2. Mengetahui dan mampu membuat media agar.

B. Tinjauan Pustaka
1. Teori: Pengujian-pengujian
Pada perbandingan agar MacConkey (S1) tampak bahwa bakteri uji
peragi laktosa (E. coli dan K. pneumoniae) membentuk koloni berwarna
merah. Gambaran mukoid juga tampak pada koloni K. pneumoniae. S.
typhi, S. paratyphi, dan P. mirabilis membentuk koloni tidak berwarna,
sedangkan S. dysenteriae membentuk koloni berwarna oranye muda.
Gambaran swarming P. mirabilis tampak jelas. Pemeriksaan secara
mikroskopis menunjukkan gram negatif pada semua bakteri uji
Enterobacteriaceae dan kapsul pada K. pneumoniae.
Pada modifikasi agar MacConkey (M1) tampak E. coli dan K.
pneumoniae membentuk koloni yang sama dengan gambaran koloni pada
S1, yaitu berwarna merah dengan gambaran mukoid K. pneumoniae yang
tampak jelas. Salmonella typhi dan S. paratyphi membentuk koloni tidak
berwarna. Shigella dysenteriae membentuk koloni berwarna merah.
Proteus mirabilis membentuk koloni berwarna merah muda dengan
swarming yang tampak jelas. Pemeriksaan secara mikroskopis
menunjukkan hasil yang sama dengan S1, yaitu gram negatif pada semua
bakteri uji Enterobacteriaceae dan kapsul pada K. Pneumoniae
(Yolanda dan Mulyana, 2011)
Pembuatan media. Nutrient agar seabanyak 23 g dimasukkan ke
dalam erlenmeyer, lalu dilarutkan dalam 1000 ml akuades. Kemudian
dipanaskan diatas hot plate dan diaduk menggunakan spatula hingga
mendidih. Dengan cara yang sama, Nutrient Broth sebanyak 8 g
dimasukkan ke dalam erlenmeyer, lalu dilarutkan dalam 1000 ml akuades.
Kemudian dipanaskan diatas hot plate dan dihomogenkan menggunakan
spatula (magnetic stirer ) hingga mendidih. Semua media yang telah
dibuat kemudian disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121_C,
selama 15 menit.
Pembuatan Agar Miring. Kedalam tabung reaksi dimasukkan 7 ml
media nutrient agar, didiamkan pada suhu kamar sampai sediaan
membeku pada posisi miring, kemudian disimpan dalam lemari pendingin
(Miksusanti, dkk, 2011)
Pembuatan media Mueller-Hinton agar (MHA): media MHA yang
telah disiapkan langsung dicampurkan dengan bakteri uji dengan tahapan
: dilarutkan 40 gr bahan media Mha dalam air suling sampai 1000 ml,
kemudian disterilkan dalam autoklaf pada temperatur 121o C, dan
dituangkan ke dalam beberapa cawan petri masing-masing sebanyak 15
ml yang telah diisi dengan 1ml suspensi bakteri uji dengan kekeruhan
280nm, lalu dihomogenkan dan didinginkan sambil diputar
(Fatimah, dkk, 2006).
Sterilisasi basaah dengan sterilisatoruap portable, bahan: bahan
peralatan yang akan diterilkan dan sterilisator uap poertable. Prosedur:
pelajarilah sterilisator uap yang diseediakan; tuangkan air suling ke dalam
tubuh sterilisator; tatlah labu atau tabung-tabung berisi media didalm
wadah aluminium bagian dalam sedemikian sehingga tersedianya ruangan
untuk bergeraknya uap air; bukalah pengatur klep pengaman, dalam
keaadaan terbuka penahan tersebut lurus letaknya; pasang
pemanasnya;bila uap air mulai keluar dengan deras(menimbulkan bunyi
mendesis) tutup klep pengaman; bila alat tolok tekanan menunjukkan
pada 15 psi atau 1 atm, kurangi pemanasan seperlunya cuku untuk
mempertahankan tekanan tersebut namun sumbat pengaman tidak
terlempar;sterilkan media dengan cara mempertahankan tekanan 1 atm
 selama 15-20 menit. Untuk memeriksa aapakah bagian terdalam benda
yang disterilkan betul-betul menjadi steril pada akhir proses, dapat
disertakan produk komersial yang dapat berubah warna bila persyaratan
suhu dan lamanya waktu terpenuhi sebagaimana mestinya; pada akhir
proses, matikan pemanasan, dan tunggu sampai tekanan kembali nol; bila
alat tolok tekanan telah menunjuk pada angka nol dan suhu telh turun
sampai jauh dibawah 100oC , buka pengatur kleep pengaman; dan bila
selesai menggunakan sterilisator, buang air yang tersisa dan keringkan
baik-baik (Hadioetomo, 1985).
2. Bahan: Sifat dan Karakteristik Bahan
Yang dimaksud dengan sterilisasi dalam mikrobiologi adalah suatu
proses unuk mematikan semua organisme yang terdapat pada atau
didaalam suatu benda. Sterilisasi basah biasanya dilakukan didalam
auoklaf (pada hakikatnya autoklaf adalah presure cooker berukuran
besar) atau sterilisator uap yang mudah diangkat (portable) dengan
menggunakan uap air jenuh bertekanan pada suhu 121oC selama 15
menit. Sterilisasi basah dapat digunakan untuk mensterilkan bahan apa
saja yang dapat ditembus uap air) dan tidak rusak bila dipanaskan dengan
suhu yang berkisar antara 110oC dan 121oC (Hadioetomo, 1985).
Metode-metode untuk mengisolasi biakan murni mikroorganisme
antara lain teknik cawan gores, teknik cawan tebar, teknik cawan tuang,
teknik biakan penyuburan, dan teknik isolasi sel tunggal (Hadioetomo,
1986).

C. Metodologi
1. Alat :
a. Tabung reaksi
b. Autoclave
c. Rak
d. Erlenmeyer
e. Cawan petri
2. Bahan
a. Larutan garam
b. Media agar
c. Kapas
3. Cara Kerja
a. Larutan pengencer
Membuat larutan garam fisiologis 0,85% sebanyak 100ml
dengan cara menimbang 0,85ml garam, kemudian
ditambahkan akuades sampai 100ml.
Memasukkan @ 9ml larutan ke tabung reaksi dan menutupnya
dengan kapas.
Sterilisasi dengan autoclave pada 121C selama 15 menit.

b. Media agar
1. Agar miring
Membuat media agar sebanyak 100 ml
Memasukkan @5ml larutan ke tabung reaksi dan
menutupnya dengan kapas
Sterilisasi dengan autoclave pada 121C selama 15 menit
Memposisikannya miring dalam rak, membiarkan sampai
miring.
2. Media agar dalam cawan petri
Membuat media agar sebanyak 100 ml dalam erlenmeyer
dan menutup erlenmeyer dengan kapas
Sterilisasi dengan autoclave pada 121C selama 15 menit.
Menegluarkan erlenmeyer dari autoclave dan mencampur
isinya dengan cara menggoyang erlenmeyer secara
perlahan
Menuang media yang masih panas (>45C) ke cawan petri
secara aseptis
Membiarkan agar tersebut sampai membeku.
D. Hasil dan Pembahasan
Larutan pengencer/ larutan fisiologis adalah larutan yang digunakan
untuk mengencerkan contoh pada analisis mikrobiologi. Pengenceran
dilakukan untuk memperoleh contoh dengan jumlah mikroba terbaik untuk
dapat dihitung yaitu antara 30 sampai 300 sel mikroba per ml.
Pengenceran biasanya dilakukan 1:10, 1:100, 1:1000, dan seterusnya.
Larutan pengencer dapat dibuat dengan cara tentukan terlebih dahulu
larutan apa yang akan di buat. Pada praktikum kali ini misalnya, membuat
larutan garam fisiologis 0,85%. Itu artinya dalm 100 ml larutan terdapat
0,85 gr garam. Jadi, larutan tersebut dilakukan degan cara menimbang
0,85 gr garam, kemudian di tambahkan akuades sampai 100ml. Kemudian
dimasukkan kedalam tabung reaksi massing-masing 9 ml. Lalu ditutup
dengan kapas. Langkah selanjutnya adalah sterilisasi dengan autoclave
pada suhu 121C selama 15 menit. Dalam pembuatan larutan pengencer
dilakukan sterilisasi dengan autoclave. Hal ini dilakukan dengan tujuan
untuk mensterilkan larutan dari mikroorgarnisme yang ada dalam larutan
tersebut.
Media agar merupakan bahan yang digunakan sebagai alat
perkembangan mikroorganisme dalam laboratorium secara invitro. media
agar memiliki berbagai macam jenis. Pada praktikum V kali ini media agar
yang digunakan adalah media agar miring dan media agar cawan petri.
Media agar miring yaitu media agar padat dalam tabung reaksi yang
diletakkan miring sehingga mempunyai permukaan media yang lebih luas
daripada permukaan agar tegak, digunakan untuk menumbuhkan dan
menyimpan biakan murni sebagai stock biakan murni (stock pure culture).
Sedangkan media agar dalam cawan petri adalah media agar padat dalam
cawan petri sehingga mempunyai permukaan yang lebih luas dari pada
media agar dalam tabung reaksi.
Media agar dapat dibuat dengan cara bahan masing-masing media
dimasukkan kedalam erlenmeyer, dilarutkan dengan aquadest lalu ditutup
 dengan aluminium foil. Kemudian masukkan kedalam wadah yang berisi
air kemudian dimasak hingga mendidih/ bening. Bila sudah larut dan
bening kemudian dimasukkan dalam autoklaf namun ada juga media yang
tidak perlu di autoklaf. Setelah steril, didapatkan berbagai media dengan
berbagai warna, kemudian media didinginkan hingga suhu 50o C lalu
dimasukkan kedalam cawan petri dan ditutup.
Media agar miring dapat dibuat dengan cara, pertama membuat
media agar sebanyak 100 ml. Kemudian memasukkan masing-masing 5 ml
kedalam tabung reaksi dan menutupnya dengan kapas. Lalu mensterilisasi
dengan atoclave pada suhu 121oC selama 15 menit, tabung reaksi
diposisika miring dalm rak, dan biarkan sampai dingin. Sedangkan cara
membuat media agar dalam cawan petri yaitu dengan membuat 100 ml
media agar alamerlenmeyer dan tutup erlenmeyer dengan kapas. Alu
sterilisasi dengn autoclave pada suhu 121oC selama 15 menit. Kemudian
keluarkan erlenmeyer dari autoclave dan mencampur isinya dengan cara
menggoyang erlenmeyer secara perlahan. Selanjutnya tuang media yang
masih panas (>45oC) ke cawan petri secaara aseptis, dan biarka agar
sampai membeku.

E. Kesimpulan
Dari percobaan praktikum acara V pembuatan larutan pengencer dan
media agar, maka didapat kesimpulan:
1. Larutan pengencer dapat dibuat dengan cara menentukan larutan apa ynga
akan dibuat, kemudian menimbang zat yang akan dibuat larutan sesuai
persen konsentrasinya. Lalu menambahkan zat pelarut sampai 100ml.
Kemudian masukkan kedalam tabung reaksi dan ditutup dengan kapas.
Lalu disterilkan dengan autoclave pada suhu 121C selama 15 menit.
2. Media agar miring dapat dibuat dengan cara bahan masing-masing media
dimasukkan kedalam erlenmeyer, dilarutkan dengan aquadest lalu ditutup
dengan aluminium foil. Kemudian masukkan kedalam wadah yang berisi
air kemudian dimasak hingga mendidih/ bening. Bila sudah larut dan
bening kemudian dimasukkan dalam autoklaf namun ada juga media
yang tidak perlu di autoklaf. Setelah steril, didapatkan berbagai media
dengan berbagai warna, kemudian media didinginkan hingga suhu 50o
C lalu dimasukkan kedalam cawan petri dan ditutup.
 DAFTAR PUSTAKA

Yolanda, Hanna dan Yanti Mulyana.2011.Uji Coba Penggunaan Limbah Air

Kelapa Tua sebagai Bahan Dasar Media Isolasi.Volume 43 No. 3
Miksusanti, dkk.2011. Aktivitas Campuran Ekstrak Kulit Manggis (Garcinia
mangostana L.) dan Kayu Secang (Caesalpina sappan L.) terhadap Bacillus
cereus. Volume 14 Nomer 3
Fatimah,Cut, dkk.2006.Uji aktivitas Antuibakteri Ekstrak daun Angsana
(Pterocarpus Indicus Willd) Secara Invitro.Volume1.No.1.
Haadioetomo, Ratna Siri.1985.Mikrobiologi Dasar dalam
Praktek.Jakarta.Gramedia
Hadioetomo,Ratna Siri.1986.Dasar-Dasar Mikrobiologi.Jakarta.UI-Fress
Schlegel, Hans G.1994.Mikrobiologi Umum Edisi Keenam.Jogjakarta.Gadjah
Mada University Press