Makalah Biokimia

Jurnal Dan Terjemahan Lipid

Kelompok 8 :

Chairini Hayati ( 16330752)

Fitria Helmaa ( 16330756)

Lenda Hulda Numberi ( 16330758)

Elfridus Beleta Lajar ( 16330770)

Nia Rodearni ( 163307)

Nama Dosen :

Rosario Trijuliamos M.M.Si

FAKULTAS FARMASI

INSTITUT SAINS DAN TEKNOLOGI NASIONAL

JAKARTA 2017-2018
 OTAK ALZHEIMER MENUNJUKKAN ADANYA PERUBAHAN YANG
BERHUBUNGAN PADA METABOLISME RNA DAN LIPID

Abstrak

Penyakit Alzheimer (AD) melibatkan perubahan metabolisme lipid dan RNA, namun tetap
tidak diketahui apakah perbedaan ini dikaitkan dengan indeks kognisi AD dan / atau post-
mortem. Di sini, kami melaporkan bukti sekuensing RNA tentang hubungan yang saling
terkait antara pemrosesan lipid, tingkat kognisi, dan neuropatol AD. Dalam dua kohort yang
tidak terkait, kami mengidentifikasi fasilitasi pengolahan lipid dan gen penyambungan
alternatif yang diperkaya dengan jalur, termasuk NOVA1 dan hnRNPA1 yang diperkaya
dengan neuronal. Secara khusus, asosiasi ini muncul dalam sampel jaringan temporal lobus
dari donor dimana bukti postmortem menunjukkan neuropatologi AD, namun yang
menyajikan kognisi normal terjadi pada kematian. Perubahan yang diamati selanjutnya terkait
dengan sintesis ATP yang dimodifikasi dan transkrip mitokondria, yang mengindikasikan
relevansi metabolik; Oleh karena itu, profil lipidomik yang berasal dari spektrometri massa
dibedakan antara individu dengan dan tanpa gangguan kognitif sebelum kematian. Terlepas
dari ukuran kelompok yang terbatas, jaringan dari orang-orang dengan gangguan kognitif dan
patologi AD menunjukkan peningkatan pada beberapa gen yang ditargetkan obat dari
gangguan otak, vaskular dan autoimun lainnya, yang disebabkan oleh peningkatan terkait
patologi dalam transkrip pengolahan lipid yang berbeda, dan dalam gen metabolisme RNA
hnRNPH2, TARDBP, CLP1 dan EWSR1. Untuk mendeteksi varian 3'-polyadenylation, kami
menggunakan beberapa pasangan primer cDNA. Varian yang diidentifikasi ini menunjukkan
perbedaan terbatas dalam cakupan dan panjang antara kelompok tes, namun memungkinkan
pengelompokan superior otak AD yang gila dan tidak gila versus kontrol dibandingkan
dengan nilai ekspresi mRNA total. Temuan kami menunjukkan perbedaan terkait kognisi
terkait dalam pemrosesan lipid AD, splicing alternatif dan polyadenylation 3''memanggil
untuk mengejar implikasi psikologis dan terapeutik yang mendasarinya.

1. Pendahuluan
Beberapa studi terbaru menemukan hubungan penyebab antara penyakit Alzheimer
(AD), demensia dan fungsi metabolik. Kepala sekolah, angka neuron lebih rendah dalam
keadaan gila dibandingkan dengan individu yang tidak memiliki demensia dengan
neuropatologi AD Braak (Andrade-Moraes et al., 2013; Braak dan Braak, 1995), dan individu
dengan metabolisme fosfolipid yang mengalami gangguan inheren sangat rentan terhadap
penurunan kognitif (Lacour et al., 2017). Ini sesuai dengan yang baru-baru ini. melaporkan
global berbagi parameter kesehatan fisik dan mental (Hagenaars et al., 2016). Ini juga
mendukung ko-pengapian penurunan metabolik AD dengan pembentukan fibril -amyloid
dan tau hiper-phos-phorylation (Pascoal et al., 2016), yang mencakup metabolisme fosfatidil-
kolin yang berubah (Whiley et al., 2014). Neuropatologi AD dapat dilemahkan oleh jalur
SIRT1 epigenetik (Shah et al., 2016), dan fosfatidilkolin melindungi neuron dari toksisitas -
amyloid (Ko et al., 2016) lebih lanjut menunjukkan adanya hubungan timbal balik yang
kompleks antara metabolisme lipid, kematian neuron dan kerusakan kognitif pada AD.
Peran dan komposisi lipid otak baru-baru ini muncul sebagai kriteria utama dalam penuaan
dan studi AD, terutama untuk toksik -amiloid. Lipid otak adalah daerah otak - dan spesies-
spesifik, dan tingkat dan komposisi mereka dimodifikasi dengan penuaan dalam karakteristik
manusia (Fu et al., 2011). Lipid neururoid mengatur lokasi dan fungsinya dari protein
membran sinaptik dan sinyal relay dari membran ke lokasi intraseluler atau ke sel lain, serta
gangguan pada gangguan depresi dan kecemasan (Muller et al., 2015). Teknologi baru
memfasilitasi penemuan ini. Dengan demikian, waktu spektrometri massa sekunder
penerbangan terbang (TOF-SIMS) menunjukkan kelebihan kolesterol kortikal pada korteks
AD (Lazar et al., 2013), dan mikroskop nonlinier memungkinkan visualisasi lipida terkait
plak pada jaringan otak AD (Kiskis et al. , 2015), di mana mereka dapat membalikkan fibril
-amyloid inert menjadi neurotoxic (Martins et al., 2008). Namun, tetap tidak diketahui
apakah perbedaan lipid dikaitkan dengan kemunduran kognitif AD. Kerusakan pengolahan
RNA secara kausal terlibat dalam berbagai kejadian neuro-degeneratif (Kim et al., 2013).
Oleh karena itu, kami berhipotesis bahwa mereka mungkin terkait dengan perkembangan dan
perubahan lipid AD. Aktivitas pemrosesan pra-mRNA, termasuk pembatasan, penyambungan
alternatif dan poliesterilasi alternatif 3'AN (APA) terus-menerus terlibat dalam crosstalk
eksensif satu sama lain (Elkon et al., 2013; Proudfoot, 2011). Secara khusus, splicing
alternatif adalah pengatur utama penekanan gen pada kesehatan dan penyakit (Di
Giammartino et al., 2011). Juga, rekan splicing alternatif pengganti dengan kepadatan tulang
belakang dendritik yang menurun, mal fungsional dari sirkuit saraf hibrida-hippocampal
entorhinal dan kemampuan belajar yang ditekan pada tikus (Berson et al., 2012). Sekitar 54%
gen manusia juga memiliki beberapa situs APA (Tian et al., 2005), yang dapat secara selektif
mempengaruhi wilayah yang tidak diterjemahkan (3'-UTR) dan / atau mengubah wilayah
pengkodean. Otak secara khusus menggunakan situs distal poly (A) sites (Di Giammartino et
al., 2011), dan situs pengenalan mikroba (miRNA) fungsional sering berada di dalam, dan di
dekat kedua ujung 3'-UTR (Grimson et al., 2007) . Ini menunjukkan evolusi bersama dari
situs poli (A) (Lee et al., 2008), miRNA yang menargetkan mereka (Barbash et al., 2014) dan
mRNA isoforms dengan repertoire modifikasi elemen cis-regulatory. Dengan mendukung
gagasan ini, gen yang genusnya lebih muda cenderung mengandung sinyal APA. Sebagai
contoh, varian APA yang lebih lama dari faktor neurotropika yang diturunkan dari otak
(BDNF) dan protein kinase 2 yang dapat diaktivasi dengan tenang (aktif Camulin 2)
menunjukkan lokasi dendritik yang tinggi (An et al., 2008; Bulleit et al., 1988; Timmusk et
al. ., 1993). Dengan demikian, kedua splicing alternatif dan APA dapat mempengaruhi sifat
neuronal dengan lebih dari satu cara.
Kami, dan yang lainnya menemukan alternatif penyambungan alternatif (Berson et
al., 2012; Kolisnyk et al., 2013) dan miRNA (Lau et al., 2013) di otak AD dengan demensia.
Perubahan ini dapat memodifikasi terjemahan mRNA, stabilitas dan lokalisasi. Namun, studi
pengolahan RNA yang mendalam pada AD masih terbatas, dan tidak ada sumber genomik,
transkriptomik atau prote-omics dari otak AD yang mencakup APA global atau lipidomic
parame-ters. Oleh karena itu, masih banyak yang tidak jelas apakah atau bagaimana
kerusakan pengolahan RNA terkait dengan histopatologi karakteristik dan / atau penurunan
metabolisme kog nitif dan fosfolipid, yang merupakan tanda utama AD. Untuk
mengidentifikasi perbedaan transkrip yang secara terpisah atau bersama-sama dikaitkan
dengan demensia AD, neuropatologi atau metabolisme fosfolipid, kami memulai sebuah
penelitian berbasis sekuensing RNA jaringan gyrus temporal yang mendalam dari dua
kelompok independen orang dengan atau tanpa bukti adanya gangguan kognitif. Kami
mengelompokkan transkrip RNA polialenilasi ke sekuens RNA menggunakan sekuens
QuantSeq 3'(sekuen pertama), atau perpustakaan cDNA primer 3 yang berasal dari var-iant
(untuk kohort kedua), untuk mengidentifikasi metabolisme RNA dan modifikasi APA; lipid
profil dalam jaringan ini dengan spektrometri massa; dan memeriksa hubungan antara
perubahan beragam ini dan keadaan kognitif dan patologis para donor.

2. Hasil
2.1. RNA-Seq mendiskriminasi antara otak penderita Alzheimer gila dan yang tidak gila.
Untuk mengatasi perubahan transkrip yang dikaitkan dengan patologi dan status
kognitif AD sebelum kematian, kami mempelajari sampel otak dari 3 kelompok yang terdiri
dari 12 peserta laki-laki yang didiagnosis secara klinis masing-masing dari Rush Memory and
Aging Project (MAP; N = 36). Peserta yang tidak menyajikan cognitive impairment (NCI),
gangguan kognitif ringan (MCI) atau AD.
Demensia termasuk dalam masing-masing kelompok ini, yang masing-masing terdiri dari 4
kasus dengan tingkat kejang (Braak 2), moderat (Braak 3-4) dan tinggi (Braak 5-6) AD
(Gambar 1a). Demikian juga, masing-masing kelompok dengan tingkat pementasan Braak
yang diberikan terdiri dari 4 sampel dengan demensia NCI, MCI atau AD. Sampel RNA otak
individu dari kelompok MAP ini dikenai analisis sekuens RNA Illumina dan analisis
bioinformatika (lihat Tabel Supplemen-tary 1 dan 2 untuk data sampel penuh, Gambar 1a, b
untuk deskripsi kelompok dan alur kerja yang dipelajari, dan Metode untuk definisi) .
Kelompok kedua, yang diterima dari Netherland Brain Bank (NBB) terdiri dari 24 sampel
lobus temporal dari orang-orang kurus yang didiagnosis dengan AD, dan orang-orang yang
tidak gila tanpa atau dengan patologis AD (Kontrol; 'tidak gila dengan patologi' , NDWP;
AD). Persiapan RNA dari sampel NBB ditranskripsikan ulang menjadi cDNA berdimensi 3
dengan panjang penuh dan dipisahkan melalui amplifikasi eksponensial selektif SQUARE
dengan menggunakan satu primer 5'-primer universal dan 12 selektif 3'-primer, yang masing-
masing hibridisasi di persimpangan tubuh mRNA dan ekor poli (A). Kelompok tambahan
pasien yang didiagnosis AD dengan neuropatologi Braak 3-4 awal dan penurunan kognitif
ditambahkan ke kelompok NBB. Sequencing file dari kedua kelompok diproses dan
dianalisis untuk ekspresi diferensial dan pengayaan fungsional, dan untuk kelompok NBB
juga untuk deteksi APA (Gambar 1d). Pengamatan divalidasi oleh RT-PCR throughput
throughput tinggi, uji aktivitas en-zyme dan perbandingan dengan database sebelumnya
(Gambar 1e).
Perbedaan transkrip RNA pada kelompok MAP (rincian pada Tabel Tambahan 2)
dianalisis terkait dengan tingkat patologi dan diagnosis klinis AD. Terlepas dari ukuran
kelompok yang sederhana dan heterogenitas in-dividual antara sampel, perbedaan transkrip
global menunjukkan hubungan yang signifikan dengan kognisi atau patologi AD
(Supplementary Fig.1), dan asosiasi modifikasi transkripsi dengan gangguan kognitif lebih
kuat daripada hubungan dengan AD pa-thology. Analisis Ontologi gen dengan memilih
kelompok transkrip dengan nilai ANOVA P b0.05 mengungkapkan jalur yang diperkaya
yang terkait dengan gangguan kognitif atau dengan patologi (tidak dikoreksi untuk
perbandingan multi-ple; DAVID (https://david.ncifcrf.gov/) (Tabel Supplementary 3 dan 4,
Gambar 2a) Pada jaringan MAP AD, jalur otak terkait kognisi meliputi pemrosesan RNA dan
sintesis lipida. Pada 24 sampel kelompok NBB (Gambar 2b), protokol sekuensing yang lebih
dalam menyoroti perbedaan signifikan yang berbeda pada Tambahan, jalur yang
berhubungan dengan AD yang tidak tumpang tindih, termasuk kegiatan splicing dan nuclear
alternatif, yang berbeda dalam jaringan NDWP. Kami menyimpulkan bahwa di kedua
kelompok, kelompok transkrip yang dimodifikasi lebih berbeda secara keseluruhan selama
penurunan kognitif dibandingkan dengan patologi maju dan asosiasi menunjukkan dengan
pemrosesan RNA .
Untuk memvalidasi hasil NBB kami dengan teknologi independen, kami memilih 80
transkrip dengan tingkat ekspresi tinggi dan menengah pada tiga kelompok NBB dan sampel
AD dari pasien dengan gangguan kognitif dan neuropatologi dini yang belum terlihat (Braak
tahap 3 dan 4), serupa dengan itu dari AD patologis tanpa kelompok demensia, untuk
kuantisasi oleh RT-PCR mikrofluida (Fluidigm, AS) (Gambar Tambahan 2; Urutan primer
pada Tabel Tambahan 5). Dari 80 transkrip yang diuji, 65 menunjukkan kurva kalibrasi linier
RT-PCR pada rentang ekspresi yang diperiksa dengan rasio teknis noise yang lebih rendah
dari 1% terhadap sinyal biologis (Gambar Tambahan 3 dan 4). Tingkat transkrip
menunjukkan koefisien korelasi dan nilai P yang signifikan dengan hasil RT-PCR Fluidigm
untuk 85,5% transkrip yang diuji yang menghasilkan kurva linier dari 65 (Gambar
Suplementasi Gambar 5). Perbandingan yang dipilih termasuk ekspresi global CAMK2A (P b
2 * 10-8) dan varian SOD1 APA distal dan proksimal (P b 0,001) (Supplementary Fig.6).
Yang penting, analisis Fluidigm varian SOD1 distal tidak menunjukkan korelasi yang
signifikan dengan varian SOD1 proksimal, dan sebaliknya, menunjukkan kesetiaan tinggi dan
kekuatan resolusi hasilnya. Rangkaian sekuens RNA yang dalam-ke-3 sedemikian sehingga
menunjukkan tingkat perbedaan kedua global yang benar dan varian APA identik dari
transkrip otak.
Gangguan transmisi kolinergik telah lama dilaporkan pada AD (Giacobini dan Gold, 2013),
dan neuron kolinergik adalah produsen utama asetilkolinesterase (AChE) (Soreq dan
Seidman, 2001).
Gambar 1. Garis besar penelitian. (a) kelompok Rush (b) kelompok NBB, dengan tiga set
jaringan otak dari donor pada tiga tingkat demensia dan patologi: kontrol yang tampaknya
sehat (Braak stage = 0), patologi awal yang terdokumentasi (tahap Braak 3-4) namun tidak
dapat dilihat demensia (NDWP) dan patologi lanjut AD dan penurunan kognitif (tahap Braak
5,6). Jumlah sampel yang dianalisis dicatat di atas. (c) Sequencing data dari dua kohort
dihasilkan dengan dua metode konstruksi perpustakaan untuk sekuens RNA: 3'-QuantSeq,
menghasilkan satu balok paling banyak yang diarahkan pada transkrip, dan SQUARE,
mengidentifikasi varian transkrip dengan alternatif 3'-UTR- APA dengan pendekatan 3'-
segregasi (skema), berdasarkan pada 12 rangkaian reverse-transcription yang menggunakan
metode primer (Metode) 3 poli (A) yang berbeda, diikuti oleh barcode dan sequencing. (d)
Skema desain analitik. Sequencing file xsq yang diturunkan dalam kedua metode tersebut
diproses dengan perangkat lunak Lifescope Liftech. File bam tersusun berfungsi untuk
menghitung nilai RPKM dan mendeteksi situs APA, ekspresi diferensial dan hasil pengayaan.
(e) Uji validasi yang terlibat: throughput tinggi Microfluidic RT-PCR, larutan protein spesifik
dan uji aktivitas enzim dan perbandingan dengan database lainnya.
Gambar 2. Mengidentifikasi perbedaan ekspresi kognitif yang kuat. (a) Tampil adalah
histogram nilai P spesifik 2-Way-ANOVA di mana patologi dan kognisi berfungsi sebagai
dua parameter untuk kelompok Rush. Sumbu Y menunjukkan jumlah kumulatif dari semua
transkrip. Lingkaran menunjukkan jumlah gen berubah dengan kognisi (kuning) atau patologi
(merah) pada pasien AD, dan tumpang tindih di antara keduanya. Kolom menunjukkan
kategori GO yang diberi peringkat oleh nilai P dari nilai pengayaan mereka. (b) Diagram
Venn dari gen yang berbeda diekspresikan dalam kelompok AD dan NDWP NBB dan istilah
pengayaan GO yang terkait, dengan skala yang menunjukkan nilai pengayaan. (c) Perubahan
aktivitas cholinesterase pada kelompok NBB dan Rush. (d) Perubahan lipatan volume
transkrip AChE secara ekspresif pada tiga kelompok pasien NBB (Mean SEM). One-way-
ANOVA P b 0,05. (e) Plotter plot dan korelasi antar kelompok pasien NBB tingkat RNA
AChE dengan aktivitas enzimatis AChE.
Oleh karena itu, kami melakukan pengukuran hidrolisis asetilionokolin untuk sampel
kelompok MAP (Gambar 2c), dan menemukan nilai yang lebih rendah pada otak AD yang
gila dibandingkan dengan NDWP (AD patologis tanpa demensia) dan sampel kontrol yang
sehat, yang kompatibel dengan kematian kolinergik AD yang dilaporkan sebelumnya. neuron
(Mesulam et al., 2004).

Selanjutnya, kami menilai ekspresi AChE dan tingkat aktivitas enzimatik di jaringan
otak NBB. Tingkat transkrip mRNA AChE menunjukkan korelasi yang tinggi dengan
aktivitas ACHE hidro-litik di jaringan yang diuji, dengan transkrip dan aktivitas enzim lebih
rendah pada demensia AD dibandingkan dengan NDWP dan sampel kontrol yang sehat
(Gambar 2d, e). Tidak seperti AChE, yang mengukur aktivitas enzimatik enzim
butyrylcholinesterase terkait erat, yang sebagian besar mencapai otak dari sumber periferal
(Darvesh et al., 2003), tidak menunjukkan hubungan dengan jumlah baca otak
(Supplementary Fig.7). Hal ini dapat diprediksi oleh asal non-otak BChE, memvalidasi
pengukuran tingkat protein kita, dan menunjukkan bahwa kedua kelompok terpisah ini
memang sebanding.

2.2. Otak donor AD dan NDWP menunjukkan perbedaan pengolahan lipid yang berlawanan
Yang lain melaporkan perbedaan lipid pada plasma AD awal (Di Paolo dan Kim, 2011) dan
mengidentifikasi perubahan fosfolipase D3 sebagai faktor risiko AD (Cruchaga et al., 2014).
Untuk profil keadaan lipidomik pada jaringan NBB yang dianalisis, kami menggunakan
kromatografi cair kinerja ultra berat yang ditargetkan dan tidak ditargetkan - analisis resolusi
massa spektrometer besar (UPLC-MS) (Fu et al., 2011), (Khrameeva et al., 2014). ). Dengan
menggunakan metodologi ini, kami dapat memisahkan puncak lipofilik 9317 dan relatif
quanti-9317 (3504 dalam mode ion negatif dan 5813 dalam mode ion positif), dimana 144
spesies lipid diberi andil sebagai asam lemak bebas (35), fosfatidilkolin. (6), fosfatidilgliserol
(2), fosfatidylinositol (2), diasilgliserol (3) atau triasilgliserol (50) (Tabel Tambahan 6), (5),
fosfatidiletanaolamina (9) ). Metodologi ini mengidentifikasi lebih dari 100 metabolit lipid
terukur dan memungkinkan perbandingan dengan standar murni sebagai dasar analisis.
Mengeksklusifkan profil lipidomis lengkap (9312 puncak) oleh statistik multivariat yang
diawasi (O2PLS-DS, Gambar 3a) memberikan klasifikasi yang jelas dari 3 kelompok yang
berbeda, yaitu AD awal (AWAD), AD akhir (lAD) dan kontrol yang sehat dan Kelompok
NDWP, yang sebagian hanya dipisahkan, menunjukkan bahwa kedua kelompok ini mungkin
masih terlalu mirip pada tingkat lipidomik untuk dipisahkan. Secara keseluruhan, temuan ini
menunjukkan pola lipida kortikal yang dimodifikasi yang dapat dikaitkan dengan kapasitas
beberapa pasien patologi AD untuk menghindari demensia lebih lama daripada yang
memiliki keadaan neuropatologi yang sama. Selain itu, kami tidak dapat memperoleh
klasifikasi signifikan dengan menggunakan metode O2PLS-DA yang diawasi sama dengan
kumpulan data lipid beranotasi, yang menunjukkan bahwa fosfolipid yang diidentifikasi,
asam lemak bebas dan lipida penyimpanan (TAG) belum tentu puncak lipid tersebut. matriks
lengkap yang berkontribusi pada perbedaan AD dan sampel control, Membandingkan
komposisi lipid beranotasi pada AD dan kelompok NDWP menunjukkan beberapa perbedaan
yang signifikan dan berlawanan, menunjukkan relevansi terhadap perbedaan yang
berhubungan dengan penyakit di antara kelompok-kelompok ini. Dengan demikian, asam
lemak kortikal menurun pada AD dan tidak berubah dalam NDWP, sedangkan varian
Phosphatidylcholine jauh lebih rendah pada AD tetapi lebih tinggi pada NDWP; dan
penyimpanan Triacylglycerol com-pound diturunkan dalam NDWP dan tidak berubah pada
AD (Gambar 3b). Informasi lebih lanjut nampaknya terletak pada puncak lipid yang tidak
diberi label, kompatibel dengan sebagian besar lipida sejauh ini terkait dengan AD yang
sterol, sphingolipid dan PIP (phospho-inositol phosphates) (Balla, 2013; Bandaru et al., 2009)

2.3. Perbedaan transkrip spesifik tipe sel dikaitkan dengan kognisi, patologi dan pemrosesan
RNA.
Lipos dan transkrip yang dimodifikasi dapat mencerminkan kehilangan neu-rons
yang terkait dengan AD (Heinemann et al., 2012; Verkhratsky et al., 2013). Karena itu,
fungsi distribusi kadar subkelompok lipid spesifik untuk kelompok AD dan NDWP, masing-
masing versus kontrol. KS = Kolmogorov Smirnov uji untuk membandingkan distribusi. (c)
Analisis Partial least square dan diskriminan untuk tingkat lipid ditunjukkan sebagai scatter
plot pada komponen analisis pertama dan kedua. Kontrol (hijau) tidak dapat dipisahkan dari
NDWP (kuning) sedangkan kelompok awal (biru) dan akhir AD (merah) dapat dipisahkan
satu sama lain. setiap jenis sel menunjukkan pola ekspresi yang berbeda pada jaringan otak
dari kelompok NBB yang diuji.
Untuk menguji apakah perbedaan ini juga mencerminkan komposisi tipe sel yang
dimodifikasi dari jaringan yang dianalisis, kita menormalisasi nilai transkrip kontrol untuk
setiap jenis sel ke -1 - dan memeriksa ulang transkrip spesifik manusia dan sel (Darmanis et
al., 2015) . Analisis ini juga menunjukkan gen spesifik neuron yang lebih tinggi pada
kelompok NDWP dibandingkan dengan AD dan kontrol (Gambar 4e). Gen spesifik
Oligodendroglia lebih rendah pada NDWP yang dikompres ke kontrol, namun tidak sampai
AD (Gambar 4f). Transkrip spesifik Astroglia lebih tinggi pada kelompok AD dan NDWP
dibandingkan dengan kontrol (Gambar 4g), seperti yang terlihat pada analisis yang tidak
normal; sedangkan gen microglia-re-lated lebih tinggi pada AD, namun tidak di NDWP
dibandingkan dengan tingkat kontrol dalam analisis normalisasi (Gambar 4h). Dengan
demikian, metode analisis yang berbeda mencerminkan hubungan yang jelas antara demensia
dan perubahan dalam pola APA spesifik tipe sel dan mungkin isi jenis sel.
Diinterogasi dalam kohort NBB transkrip yang diketahui yang produk pro-teinnya terbukti
eksklusif untuk neuron, astroglia, mikrog-lia atau oligodendroglia, yang secara metabolik
mendukung akson dan berkontribusi terhadap neurodegenerasi (Zhang et al., 2013) (Lee et al.
, 2012) (Daftar gen lengkap pada Tabel Tambahan 7 dan 8). Analisis ini menunjukkan tingkat
transkrip neuron yang lebih tinggi, pada kelompok NDWP dibandingkan dengan AD dan
mengendalikan orang (Gambar 4a). Juga, gen spesifik oligodendroglia lebih rendah pada
NDWP dibandingkan dengan kontrol dan AD (Gambar 4b); transkrip spesifik astroglia lebih
tinggi pada kelompok AD dan NDWP dibandingkan dengan kontrol (Gambar 4c), dan gen
yang berhubungan dengan mikroglia lebih rendah pada AD dan NDWP dibandingkan dengan
kontrol (Gambar 4d).,

2.4. Identifikasi perbedaan otak terkait penyakit baru Selain perbedaan spesifik tipe sel, kami
mencari perbedaan AD-relat-ed di gen terkait splicing alternatif (Barbash dan Soreq, 2012;
Berson et al., 2012; Kim et al., 2013; Lau et al., 2013). Pada AD dan NDWP dibandingkan
dengan otak kontrol, kami menemukan tingkat EWSR1 yang lebih tinggi, yang terlibat dalam
sklerosis lateral amyotrophic (Couthouis et al 2012), dan HNRNPH2, yang perbedaan
ekspresinya diasosiasikan dengan usia (Mazin et al., 2013) (Gambar 4i). CLP1, yang
menghubungkan metabolisme tRNA dengan kehilangan neuron motorik (Hanada et al., 2013)
dan TARDBP, yang bila dimutasi, dapat menyebabkan sklerosis lateral amyotrophic
(Kabashi et al., 2008) lebih tinggi pada AD dibandingkan dengan kontrol dan NDWP 4j).
Sebagai perbandingan, NOVA1, yang mengatur transkrip ditetapkan penting untuk fungsi
neuron yang tepat (Zhang et al., 2008), dan HNRNPA1 yang diperkaya dengan neuronal,
yang berperan dalam menentukan struktur isoform protein prekursor -amyloid (Donev et al
., 2007) dan sebagian besar terkuras di neuron AD (Berson et al., 2012) keduanya lebih tinggi
pada NDWP dibandingkan dengan kontrol (Gambar 4k). Tidak seperti perbedaan transkrip,
tingkat protein hnRNPA1 lebih rendah pada NDWP dan AD dibandingkan dengan Kontrol
(Gambar 4l), bersama-sama menyarankan tingkat regulasi tambahan mengenai perubahan
histopatologi terkait AD di transkrip pemrosesan RNA otak.

Selanjutnya, kita menghitung kecenderungan masing-masing gen yang dipelajari untuk

membawa sinyal polialegilasi yang tidak jelas dengan membagi jumlah bacaan dalam
dinukleotida yang diekspresikan maksimal dengan jumlah baca total. Mayoritas gen yang
diekspresikan otak menunjukkan beberapa varian APA, dengan pola gen spesifik yang sangat
bervariasi (Gambar 5a). Jarak antara dua varian APA yang utama di semua gen pada
umumnya sangat pendek, namun berkisar antara 1 dan 700 nukleotida (rata-rata: 4,9, standar
deviasi: 2.2; lihat Gambar 5b). Untuk menguji apakah varian APA yang berbeda
mencerminkan kebisingan teknis akibatnya
Gambar 4. Urutan dalam mengidentifikasi sel-spesifik, kognisi dan patologi yang terkait
dengan perbedaan transkrip. (a-h) Otak NDWP NBB menunjukkan transkrip neuronal yang
diatur dan transkrip yang diatur turun pada jenis sel lainnya. (a-d) Tampil adalah fungsi
distribusi kumulatif (CDCHs) untuk perubahan global antara AD atau NDWP dan kontrol
(garis putus-putus, merah dan biru, sesuai) untuk subkelompok gen spesifik jenis sel,
mengikuti Cahoy dkk. (Cahoy et al., 2008) (garis padat, warna yang sama). (a) Gen neuronal
diregulasi dengan tajam dalam nilai NDWP (a; Kolmogorov Smirnov (KS) P b 0.0001).
Kolom: APA varian dari sensor kalsium SYT1 dengan ujung 3'-CA. (b) Gen Oligodendroglia
diturunkan dalam NDWP dan diregulasi pada AD (nilai KS P b 0.001). Kolom: varian 3'-AC-
dihentikan dari gen sistem saraf pusat myelin-associated CLDN11. (c) Gen astroglial cukup
diatur dalam kedua kelompok penyakit (nilai KS P b0.01). Kolom: varian CA dari regulator
metabolik ATP1A2. (d) Gen yang terkait dengan Microglia diatur dalam NDWP dan AD.
Kolom: varian 3'-GA dari penanda diferensiasi CD53 dan mengikuti Zhang (Zhang et al.,
2013). (e-h) Gambaran plot kotak paralel dari nilai normal untuk daftar gen karakteristik tipe
sel yang berbeda, mengikuti Darmanis (Darmanis et al., 2015) dengan tingkat kontrol yang
sehat yang disebut 1. Perhatikan perbedaan paralel dalam analisis ini sebagai baik. (i)
Perbedaan AD yang terkait dengan gen metabolisme RNA: nilai RPKM yang dinormalisasi
di tiga kelompok pasien (rata-rata SEM) untuk EWSR1 dan HNRNPH2 (nilai satu arah-
ANOVA P = 0,02 dan 0,04, dengan demikian), CLP1 dan TARDBP (satu Nilai P-ANOVA P
= 0,005 dan 0,02, Sejalan), dan NOVA1 dan HNRNPA1 (nilai One-way-ANOVA P = 0,005
dan 0,02, Sejalan).
ketidaksesuaian primer, kami menghitung korelasi antara bidang primer dinukleotida yang
berbeda di semua gen untuk setiap sampel secara terpisah. Tingkat kesalahpahaman yang
tinggi akan tercermin dalam korelasi yang tinggi dan positif, karena lebih banyak salinan dari
produk 'benar prima' dan 'salah-prima' juga akan meningkat di bidang masing-masing.
Namun, semua perbandingan lapangan menunjukkan korelasi yang sangat rendah (Gambar
6).
Selanjutnya kami mempertimbangkan bahwa ekspresi diferensial yang diamati adalah ukuran
kelompok yang relatif kecil (8 otak per kelompok) dapat mencerminkan stratifikasi fenotip
yang tidak tercatat yang mungkin tidak terkait dengan kondisi yang diperiksa (misalnya
warna mata). Neverthe-less, membandingkan nilai P yang dihitung dari 500 permutasi di
seluruh gen dan bidang ke nilai t-test P sederhana untuk setiap gen dan lapangan
mengecualikan kemungkinan ini. Sebagai contoh, nilai permutasi P untuk membandingkan
AD untuk mengendalikan sampel di bidang 'AC' adalah 0,03, yang mencerminkan
signifikansi pengaruh penyakit terhadap perbedaan global antara 186 gen yang secara
eksplisit diekspresikan dalam bidang ini. Perbandingan permutasi P nilai kontrol terhadap
NDWP adalah 0,03 juga, yang mendukung efek phe-notypic yang dominan dari patologi -
amiloid pada pola ekspresi APA yang berbeda, sedangkan nilai perbandingan permutasi
NDWP terhadap AD adalah 0,18, yang merupakan jumlah yang jauh lebih rendah dari gen
yang diekspresikan secara berbeda (78) di dalam bidang 'AC' pada kedua kelompok ini
(Gambar 6). Yang penting, analisis permutasi untuk semua bidang dinukleotida menunjukkan
nilai signifikan antara 12 AD untuk mengendalikan sampel (0,041 0,030), dan kontrol
terhadap perbandingan NDWP (0,042 0,030), namun tidak NDWP sampai AD (0.151
0.120) (Supplementary Table 9) . Nilai permutasi yang ditentukan P adalah ukuran
kemungkinan untuk kelompok spesifik sebagai fungsi dari ukuran kelompok dan jumlah
perbedaan yang ditemukan. Oleh karena itu, analisis ini secara langsung mengkuantifikasi
kemungkinan gen yang berbeda ini untuk dikelompokkan secara spesifik menurut fenotip
yang dijelaskan, dengan risiko menindaklanjuti prospek yang salah dalam penelitian
selanjutnya masing-masing adalah b4.1%, 4,2% atau 15,1% untuk masing-masing kelompok.
perbandingan di atas. Kami menyimpulkan bahwa variasi APA yang diamati adalah asli dan
membedakan antara kognisi yang berbeda, namun tidak untuk negara-negara pa-thology.

Variasi 3'-UTR APA melibatkan sekuens poli (A) konsensus (misalnya 'AAUAAA' dan 10
rangkaian konsensus yang kurang menonjol) yang terletak 10-30 nukleotida di hulu situs poli
(A) (Beaudoing et al., 2000). Di antara 64.107 transkrip kita, 46.078 (72%) akhir terbaca
dengan jumlah terbacaan N1 memiliki setidaknya satu urutan konsensus poli (A). Untuk
memeriksa apakah kita menangkap situs poli (A) asli yang kita telusuri untuk kesepakatan
konsensus semacam itu 1-50 nukleotida di bagian hulu dari akhir transkrip yang
teridentifikasi, pada bacaan-bacaan yang menyertakan tautan universal 3 yang dapat kita
gunakan secara empiris untuk menentukan poli (A ) pada resapan nukleotida tunggal. Kami
mengidentifikasi urutan konsensus yang paling menonjol, 'AAUAAA', pada 16 nukleotida di
hulu dari lokasi transkrip akhir, rata-rata, (Gambar 5c), yang sesuai dengan posisi urutan
konsensus yang dilaporkan.
Selanjutnya, kami mengukur jarak antara situs APA proksimal dan distal di 43 gen dengan
setidaknya satu varian alternatif yang diketahui di database UCSC (http://genome.ucsc.edu/)
dan untuk itu kami dapat mendeteksi transkrip akhir yang membacanya termasuk linker
universal 3 di setidaknya 80% dari kelompok yang diuji dan menentukan lokasi poli (A)
dengan kepercayaan tinggi. Mayoritas fragmen yang diidentifikasi menunjukkan perbedaan
panjang n20 nukleotida antara var APA proksimal dan distal APA. Secara khusus, 42 dari
situs APA tersebut berada di dalam area 3-UTR annotat-ed (UTR-APA) sedangkan hanya
satu situs APA yang baru saja menonjol ke wilayah pengkodean (TFIP11; CR-APA; Gambar
5d). Kami kemudian menguji opsi bahwa perubahan ekspresi antara varian APA yang distal
dan proksimal dapat mengubah peraturan oleh miRNA (Lee et al., 2008).

Gambar 5. Karakteristik variasi APA dalam kelompok NBB. (a) Kebanyakan transkrip
menunjukkan variasi APA yang beragam. Histogram menunjukkan% kontribusi bidang
maksimal terhadap bacaan yang diamati untuk setiap transkrip. Insets menunjukkan distribusi
ekspresi di ladang selama tiga contoh. (b) Jarak nukleotida dari RefSeq TES untuk bidang
pertama (lapangan
A) dan kedua (lapangan B) produk utama, untuk satu pasien. Grafik kanan adalah zoom-in
dari grafik kiri seperti yang ditunjukkan pada sumbu X dan Y. (c) Jumlah rangkaian
konsensus situs poli (A) 'AAUAAA' karena jarak dari situs poli (A) yang diuruti dibaca. (d)
daerah 3'-UTR untuk gen representatif dengan setidaknya 2 poli (A) situs yang diidentifikasi,
selaras menurut situs akhir transkripsi mereka (Gaugler et al., 2014). Varian APA proksimal
dan distal ditandai sebagai segitiga merah. Bagian sisi kanan: zoom-in untuk daerah
nukleotida 20 TES yang berdekatan untuk masing-masing gen yang ditunjukkan. Perhatikan
bahwa jarak APA lebih pendek dari 20 nukleotida untuk lebih dari 80% transkrip ini.

Dengan menggunakan algoritma prediksi microT (Maragkakis et al., 2009), kami mengukur
jumlah unsur pengenalan miRNA (MREs) di seluruh genom manusia yang terletak 5
nukleotida di hulu dari lokasi poliester distal (A), dan karenanya dipengaruhi oleh mayoritas
variasi APA yang teridentifikasi. Kami menemukan bahwa hanya 2,9% gen manusia yang
memiliki satu atau lebih MRE di lokasi genom ini (Histogram untuk MRE dihitung di seluruh
gen manusia ditunjukkan pada Gambar Tambahan 10). Al-bersama-sama, tes ini
menunjukkan variasi APA dari batasan panjang, cakupan dan dampaknya terhadap peraturan
miRNA yang tampaknya tidak terkait dengan perubahan splicing AD.
2.5. Analisis kelompok mendukung relevansi penyakit pengolahan RNA dan perbedaan APA
Untuk membandingkan varian APA untuk setiap gen yang tercermin dalam jumlah baca
primer dinukleotida spesifik, kami memperkirakan redundansi antara ladang dinu-cleotide.
Ada redundansi b1%, menunjukkan pemisahan yang efektif. Gambar 6a dan b menunjukkan
analisis semacam itu untuk subunit gamma penangkapan pertumbuhan dan protein pengurang
DNA GADD45G yang dapat diinduksi. Jumlah penjumlahan GADD45G total tidak
menunjukkan perbedaan global, namun varian APA-nya berbeda secara signifikan antara AD
dan sampel kontrol. Produk GADD45G 'AC' dan 'GA' lebih tinggi pada kontrol dibandingkan
sampel AD dan AD dibandingkan dengan kontrol; dan variabilitas global pada tingkat
GADD45G jauh lebih besar pada otak kontrol. Gambar Tambahan 11 menunjukkan matriks
korelasi untuk pola APA GADD45G APA yang ada di antara semua sampel, menunjukkan
bahwa otak AD mengubah varian 3'-APA yang diinginkan dari gen penangkapan
pertumbuhan ini dan juga memperketat cakupan variabilitas di tingkatnya. Matriks paralel
memungkinkan rata-rata matriks korelasi ini di semua gen, dengan hasil yang sama.
Perbedaan kognisi terkait pada varian APA karenanya kecil, namun dapat direproduksi.
Secara khusus, protein prekursor -amyloid (Stein et al., 2010; Stein et al., 2012) diproduksi
dari varian APA yang pendek dan panjang (APP-S, APP-L) (Mbella et al., 2000). APP-L,
tapi bukan APP-S (yang diperluas oleh nira nukleotida 258''-UTR) berinteraksi dengan
ekstrak protein otak yang mempromosikan terjemahannya. Ini memperparah terjemahan
APP-L, yang menunjukkan adanya pengaruh potensial pada patogenesis AD melalui
modulasi APA ekspresi APP. Kami mendeteksi situs endapan transkrip distal dan proksimal
pada tingkat resolusi nukleotida tunggal di bidang 'nukleotida' dan 'AT', secara spektroskopi
(Gambar 6c). Juga, wilayah pengkodean APP yang teridentifikasi sesuai dengan struktur gen
APP yang diketahui di masing-masing dari dua bidang ini, dan AD tetapi bukan otak NDWP
yang diperkaya dengan varian APP-S (Gambar 6d), (satu arah-ANOVA P b 0,05). Dua varian
APA yang sebelumnya teridentifikasi dan divalidasi juga dikenal sebagai gen CAMK2A
calmodulin kinase, yang menampilkan ekspresi tinggi pada AD (Wang et al., 2005). Kedua
var-iants menunjukkan tingkat ekspresi yang lebih tinggi pada sampel AD dan NDWP
dibandingkan dengan kontrol yang sehat. Situs APA yang telah divalidasi dari gen SPP1,
TCEB2 dan SOD1 berhubungan dengan struktur mRNA otak manusia yang terbentuk dari
klon cDNA (http: //genome.ucsc edu /). Situs transkrip akhir yang diekstraksi dibaca
menunjukkan masing-masing skrip tran ini sebagai varian situs APA yang diketahui pada
posisi yang dilaporkan (Gambar Lampiran 12).
2.6. Gen penyakit otak, gen vaskular dan autoimun menunjukkan perbedaan APA yang
terkait dengan kognisi

Untuk mengaitkan pola polialilasi diferensial dengan partikel Proses AD yang terkait dengan
ular, kita cocok dengan perbedaan ekspresi NBB dari masing-masing varian APA ke salah
satu dari 6 profil ekspresi hipotetis: Pathol-ogy-associated meningkat atau menurun pada AD
dan NDWP dibandingkan dengan kontrol (1,2); Kognisi terkait meningkat atau menurun
dalam kontrol dan NDWP dibandingkan dengan AD (3,4), dan potensi kenaikan peraturan
atau penurunan NDWP dibandingkan dengan AD dan kontrol (5,6; Gambar 6e). Tran-skrip
didefinisikan sebagai pencocokan profil jika menunjukkan nilai P b 0,05 dan perubahan lipat
N 2, dan tidak berubah jika mereka memiliki nilai P N 0,5 dan lipat perubahan b10%.
Gambar 6f menyajikan kotak petak untuk dicatat Varian APA dari gen terkait apoptosis
LIG4, gen NP mitokondria, gen tanggapan kekebalan SLC6A9, gen transmis sinapsis AVPI1
dan gen pengatur tumbuh dan diferensiasi sel TBC1D7. Profil kelima NDWP yang
meningkat, namun bukan yang kedua, juga menunjukkan pengayaan protein pengikat
sintaksis 1 (n-Sec1), penting untuk fungsi sinaps (Arancillo et al., 2013). Lihat daftar gen
yang menjadi rindu pada masing-masing profil di Tabel Tambahan 10. Sebanyak 416 gen
berhubungan dengan profil khusus ini: 98 gen menunjukkan peningkatan ekspresi pada AD
dan NDWP dibandingkan dengan kontrol, 140 gen menunjukkan peningkatan ekspresi pada
NDWP dibandingkan dengan AD dan kontrol dan 45, 43, 48 dan 42 gen berhubungan dengan
2, 3, 4 dan 6, masing-masing (Gambar 6g). Untuk mengeksplorasi efisiensi diferensial antara
transkrip APA tersebut, kami memilih tiga gen yang menunjukkan APA yang berubah secara
signifikan dan dimana segmen distal dari 3'-UTR setidaknya 60 nt long; APP, ACAT2 dan
GIMAP5. Uji Luciferase memungkinkan pengukuran efisiensi terjemahan secara terpisah
untuk transkrip APA yang pendek dan panjang. Aktivitas luciferase yang dinormalisasi untuk
transkrip yang menyimpan panjang (bar L - biru) atau bar pendek (S - red bars) 3'UTR APP,
ACAT2 dan GIMAP5 menunjukkan ekspresi varian APP yang lebih tinggi, sedangkan
ACAT2 dan GIMAP5 menunjukkan aktivitas yang jauh lebih rendah. untuk varian pendek
mereka (Gambar 6h; lihat Metode untuk lebih banyak de-ekor). Manipulasi eksperimental
dengan demikian mendukung relevansi penyakit untuk perbedaan yang diamati, setidaknya
untuk beberapa transkrip.
Kami melakukan analisis Ontologi Gene untuk masing-masing profil secara
terpisah, dengan menggunakan alat bioinformatika DAVID (https://david.ncifcrf.gov/),
dengan seluruh transkopi yang dinyatakan sebagai latar belakang (Tabel 1). Ini menguraikan
beberapa transkrip profil 3 yang terlalu banyak diekspresikan pada AD dibandingkan dengan
kontrol dan NDWP dan dikenal karena hubungan kausal dengan beragam penyakit manusia.
Contohnya termasuk gen LCAT, MT1F, MY1G, CLINT1 dan SPP1, semuanya terlibat pada
AD, penyakit Parkinson dan penyakit autoimun. Selain itu, gen lain dalam kelompok ini,
seperti HLA-DRA, P2RY12, S100A4, TBXAS1 dan SLC6A9 muncul karena telah menjadi
target obat yang disetujui FDA untuk mengobati multiple sclerosis, ce-rebrovascular disease
dan schizophrenia, masing-masing (lihat Tabel Supplemen-tary 11 untuk keterangan
lengkap). Sepengetahuan kami, ini menunjukkan untuk pertama kalinya keberadaan gen yang
ekspresinya teregulasi di otak pasien AD yang mengalami kambuhan secara kognitif namun
tidak pada otak pasien AD yang tanpa histopatologi tanpa de-mentia sebelumnya; dan bagian
dari itu tampaknya terlibat dalam patologi otak atau tubuh lainnya.

2.7. Pola APA memungkinkan pengelompokan pasien superior dibandingkan dengan total
transkrip Plot Dendrogram berdasarkan jarak Euclidean antara APA-semut semua gen
(Gambar 7a-c) menunjukkan bahwa rasio APA benar mengelompokkan AD dari kontrol dan
AD dari NDWP (dengan satu pasien yang salah klasifikasi dalam setiap perbandingan),
namun gagal untuk membedakan antara kontrol dan kelompok NDWP, dengan hati-hati
menyarankan relevansi variasi APA kumulatif terhadap keadaan kognitif pasien yang diuji.
Sebagai perbandingan, tingkat ekspresi total dijumlahkan untuk mengkelompokkan berbagai
kelompok pasien ke dalam semua dari tiga kemungkinan perbandingan (kontrol AD, kontrol
NDWP dan AD-NDWP, Gambar 7d-f), baik di NBB atau di Kelompok terburu-buru Analisis
parsial least square (PLS) berdasarkan variasi APA, namun tidak pada urutan ringkas juga
menghasilkan klasifikasi yang jelas, sehingga distribusi pasien di bidang komponen PCA
pertama dan kedua menunjukkan pengelompokan yang jelas (Gambar 7g ). Dengan
demikian, kelompok AD berhasil diklasifikasikan oleh analisis dendrogram dan PLS, yang
menunjukkan keterlibatan perbedaan APA dalam asimetris kognitif proses penyakit. 3.
Diskusi Menggabungkan RNA-Seq dengan tes LC-MS lipidomik, kami menemukan
metabolisme RNA yang saling terkait dan perbedaan lipidomi pada jaringan lobus temporal
AD, yang juga mengumpulkan beberapa penyakit yang berhubungan dengan penyakit.

S. Barbash dkk. / Neurobiologi Penyakit 106 (2017) 1-13

Gambar 6. varian APA mengklasifikasikan kelompok pasien lebih baik daripada transkrip
kumulatif dari semua bidang. (a) Tingkat ekspresi GADD45G pada pasien dan kontrol AD.
(b) Pola APA GADD45G di AD (merah) dan kontrol (biru). Tampil adalah rata-rata SEM
ekspresi di setiap bidang SQUARE pada kelompok pasien, peralihan nada antara produk
proksimal dan distal dari kontrol ke AD. Fields 'CA' dan 'GA', namun tidak satu pun yang
lain, tidak ada jumlah transkrip global yang menunjukkan perubahan yang signifikan. (c)
Struktur gen APP dengan dua varian APA; satu dengan panjang (APP-L) dan satu dengan 3'-
UTR pendek (APP-S). Jumlah sekuensing membaca keseluruhan APP di bidang SQUARE
'GC' dan 'AT'. Wilayah 3'-UTR unik dari APP-L ditandai dalam persegi panjang yang putus-
putus. (d) Jumlah pembacaan di bidang SQUARE tertentu dibagi dengan jumlah total
transkrip yang dibaca di setiap sampel untuk APP-L dan APP-S. Dalam kedua kasus Nilai
One-way-Anova-P telah menjadi b0.05. (e) Prediksi profil perbedaan ekspresi antara
kelompok mungkin mencerminkan hubungan dengan patologi, penurunan kognitif atau fitur
spesifik NDWP. (f) Tingkat kepercayaan 95% untuk gen teladan LIG4, NPY, SLC6A9,
AVPI1, TBC1D7, dan NDUFA3, masing-masing menyajikan profil yang berbeda (warna
seperti pada a). (g) Grafik batang untuk transkrip APA diperhitungkan dalam setiap profil
(warna seperti pada e). (h): Aktivitas luciferase yang dinormalisasi untuk transkrip yang
menyimpan panjang (bar L - biru) atau bar pendek (S - red bars) 3'UTR dari APP, ACAT2
dan GIMAP5. Secara singkat, lengkap 3'-UTR APP manusia, ACAT2 dan GIMAP5
diperkuat dari DNA genomik, dan kloning hilir gen luciferase Renilla di psiCHECK2
(Clonetech) menggunakan XhoI dan NotI. Untuk membuat vektor yang mengekspresikan 3'-
UTR pendek saja, wilayah 3'-UTR dari masing-masing transkrip kloning juga dikelompokkan
menjadi psiCHECK2. Untuk mendapatkan ekspresi isoform 3 UTR yang panjang saja, situs
polyadenylation proksimal bermutasi dari AAUAAA menjadi ACUCAA (APP, ACAT2) dan
AAUAGA menjadi AAUCGA (GImAP5) menggunakan QuickChange Site Directed
Mutagenesis (Agilent). HEK-293 sel dikultur dalam DMEM ditambah dengan serum janin
bovine 10% dan diteruskan dengan TransIT-X2 (Mirus) sesuai instruksi pabrik pembuatnya.
Sel kemudian diinkubasi semalaman sebelum melakukan tes luciferase. Aktivitas Luciferase
dinilai menggunakan sistem Dual-Glo (Promega) yang dilakukan sesuai instruksi pabrikan.
Fluoresensi Renilla dinormalisasi menjadi sinyal kunang-kunang, dan hasilnya disajikan
sebagai rasio ini.

transkrip otak, sifat vaskular dan autoimun dibandingkan dengan otak kontrol. Sebaliknya,
jaringan pasien non-keledai dengan patologi menunjukkan neuronal RNA dan pemrosesan
lipid yang difasilitasi, dan kedua lipid otak dan varian poliegetilasi 3'''fikasi klasifikasi pasien
superior melalui transkrip global, menunjukkan peran terkait kognisi untuk pemrosesan RNA
dan lipid otak. . Penelitian sebelumnya juga mengidentifikasi perubahan ex-pression yang
terkait dengan metabolisme lipid serta proses inflamasi (Blalock et al., 2004; Haroutunian et
al., 2009) dan keterlibatan genotipe ApoE dalam proses ini. Juga, sebuah port re-port baru-
baru ini berpendapat bahwa peran imun bawaan yang mungkin relevan untuk alternative
polyadenylation (Jia et al., 2017). Namun, karena variasi yang diketahui antara pasien AD
dan ukuran kecil kelompok dianalisis, yang terdiri dari laki-laki saja, reproduktifitas hasil ini
di seluruh penelitian masih menunggu penilaian yang lebih menyeluruh. Temuan kami
menunjukkan bahwa titik waktu di mana sebagian besar perubahan seluler meningkat
mendekati inisiasi kerusakan kognitif daripada awal fenotip neuropatologi; yang kompatibel
dengan laporan hubungan antara penurunan kognitif dan gangguan neuron, tapi bukan
patologi AD (Andrade-Moraes et al., 2013). Dalam dua kelompok berbeda dan strategi
sekuensing, gangguan kognitif terkait.
S. Barbash dkk. / Neurobiologi Penyakit 106 (2017) 1-13 9
Tabel 1
Analisis pengayaan jalur untuk Gambar 6.

Klaster Penyuburan skor

Profil

1 Kematian sel 1.74

terprogram, apoptosis

RNA splicing, RNA 1.7

binding,RNA
processing,spliceosome,
ribonucleoprotein
complex.
Aktivitas hidrolase, 1.31
protease, exopeptidase
dan endopeptidase.
2 Mitokondria, membran 2.91
dalam mitokondria,
amplop mitokondria,
rantai pernafasan,
penyakit Huntington,
penyakit Parkinson,
Alzheimer penyakit,
pengurangan oksidasi.
Protein ribosom, 1,72
ribosom, translasi,
ribonukleoprotein.
MHC kelas II, respon 2,31
imun, molekul adhesi
 sel (CAMs), pemrosesan
antigen dan penyajian,
Asma, penyakit tiroid
autoimun.
Respon pertahanan, 2,14
respon terhadap luka,
respon inflamasi.
Peptida mengikat, 1,65
regulasi positif terhadap
sistem kekebalan tubuh.
3 Glikoprotein, ikatan 1.43
disulfida.
Sekresi, transportasi 2.36
eksposisi vesikula
dimediasi.
Transmisi sinaptik, 1.86
transport
neurotransmitter, proses
sistem saraf.
Aparat Golgi 1,3

4 Generasi metabolit dan 1.65

energi prekursor, proses
biosintesis ATP,
aktivitas ATPase,
pengangkutan ion.
Nukleotida mengikat, 1.63
mengikat ATP.

Pengikatan protein yang 1.62

dilipat, pendamping,
protein terlipat.
Melanosome, butiran 1.48
 pigmen, vesikel
sitoplasma
5 Mitokondria, membran 1.36
mitokondria.

Dengan perbedaan transkrip yang lebih signifikan daripada patologi. Ini mungkin
menunjukkan mekanisme kematian transkripsi dan / atau sel otak yang berbeda pada pasien
dengan penurunan kognitif tertunda. Secara khusus, perbedaan AD dan NDWP yang
teridentifikasi terkait dalam pemrosesan RNA dan posisi koma lipida dapat mengindikasikan
periode interim yang sebelumnya tidak diramalkan. Ini Periode melibatkan ekspresi gen
neuron yang dipercepat dan peningkatan kadar pro-duksi lipid kortikal. Ini terjadi sebelum
inisiasi kematian neuro-nal di otak yang sakit, dan diikuti oleh aktivasi hipo-neuronal dan
neurodegenerasi. Pekerjaan di masa depan harus memeriksa kemungkinan kejang-kejang
untuk memperpanjang keadaan aktivasi hiperaktif neuronal ini dan

Gambar 7. Polarenilasi alternatif memisahkan AD dari NDWP dan kontrol lebih baik
daripada nilai total persamaan penjumlahan. (a-c) Dendrogram berdasarkan rasio APA untuk
kontrol AD vs. (a), NDWP vs. kontrol (b) dan AD vs. NDWP (c) berdasarkan semua bidang
SQUARE dan dalam transkrip terpisah. (d-f) Dendrogram berdasarkan nilai ekspresi total
yang diperoleh dengan menggabungkan semua bidang SQUARE untuk AD vs. kontrol (d),
NDWP vs. kontrol (e) dan AD vs. NDWP (f). (g) PLS pasien membedakan AD dari NDWP
dan kontrol berdasarkan nilai poladebuasi alternatif.
Dengan itu terjadi penurunan kognitif (lihat juga pembahasan tambahan).
Analisis pengayaan gen menunjukkan peningkatan apoptosis dan berkurangnya
fungsi mitokondria untuk otak AD dan NDWP, yang menunjukkan relevansi spesifik dari
jalur ini dalam pengembangan neuropatologi. Otak AD dan NDWP juga berbeda dari kontrol
pada beberapa gen terkait spon terkait neuronal yang ditunjukkan oleh orang lain dan oleh
kita menjadi kausal-terlibat dalam sindrom neurodegeneratif non-familial dan familial
(Berson et al., 2012; Hanada dkk. ., 2013), sedangkan otak NDWP menunjukkan sintesis
APA ATP dan halide mitokondria berbeda, sesuai dengan hipotesis penundaan demensia AD-
karakteristik yang difasilitasi secara metabolisme.

Kami mengidentifikasi perbedaan APA dengan RNA-se-quencing berbasis primer ganda,

dengan rasio signal to noise yang tinggi dan klasifikasi pasien superior atas hasil sekuensing
total. Ini memberikan sebuah survei yang belum pernah terjadi sebelumnya mengenai
transkrip panjang yang diekspresikan dengan otak yang membedakan pasien stadium lanjut
dan tahap awal AD dari donor non-gila dengan atau tanpa histopatologi, membuktikan
relevansi penyakit terkait kekebalan bawaan dari status ekspresi APA, dan memungkinkan
klasifikasi dari sel tipe-, kognisi-, lipidomik dan neuropatologi - perbedaan transkrip terkait.
Data kami dengan setia direkapitulasi dan secara signifikan melampaui informasi APA
sebelumnya mengenai transkrip penyakit otak dan neurode generatif, sementara menemukan
proses APA yang harus dipelihara dengan ketat pada tahap histopatologi dan penurunan
kognitif AD. Kami menyimpulkan bahwa otak AD menyajikan profil APA yang berbeda dan
perbedaan splicing al-ternatif. Salah satu contoh minat yang unik adalah bahwa otak AD
mengekspresikan varian APP-S yang lebih efisien, sedangkan varian APP-L yang kurang
efisien diterjemahkan sebagai yang utama dalam otak NDWP, yang memperpanjang prediksi
in vitro sebelumnya tentang risiko AD yang dimodulasi oleh APA ini. varian.

Pada tingkat penelitian translasi, profil transkrip AD kami mencakup peningkatan yang jelas
pada gen respon kekebalan dan penurunan gen transmisi sinaptot dibandingkan dengan
kelompok lainnya, yang menunjukkan keterkaitan dari perbedaan ini dengan karakteristik
kerusakan neuro-inflammation dan cog-nitive dari AD (Heneka et al., 2015). Selain itu, kami
menemukan beberapa perbedaan pada gen target otak terapeutik yang diketahui, kelainan
vaskular dan autoimun, yang memprediksi keterlibatan transkrip yang sesuai dalam
penurunan kognitif AD. Sebagai contoh, protein reseptor gen G-CAP digabungkan P2RY12
meningkat pada AD dan yang menarik terlibat dalam penyakit perifer dan serebrovaskular
(Culebras et al., 2014), yang mengingatkan pada apolipoprotein E yang mengendalikan
integritas ce-rebrovascular pada individu sehat dan gagal. untuk melakukannya di AD pa-
tients (Bell et al., 2012). Obat Clopidogrel penargetan P2RY12 (Pfizer) diberikan secara
kronis pada pasien sindrom koroner akut. Ekspresi S100A4 yang kurang bijak, yang dapat
mengurangi fosforilasi yang dimediasi oleh mikrotubulus as-sembeng dan protein kinase
telah dikaitkan dengan kardiomiopati (Cmoch et al., 2012), yang dapat diobati oleh fenotiazin
psikoaktif. Temuan kami menyerukan inves-tigating potensi efek menguntungkan dari obat-
obatan ini dan terkait untuk menunda atau membatasi risiko penurunan kognitif terkait AD.
Keuntungan potensial lain dari penelitian kami melibatkan temuan target pengkhianatan
kognisi baru untuk intervensi terapeutik. Kami menemukan jarak yang lebih jauh dan
perbedaan transkrip yang berbeda antara pasien dan kontrol AD dibandingkan dengan NDWP
dan kontrol, dengan hati-hati menyarankan keterlibatan yang lebih jelas dari metabolisme
RNA pada kemerosotan kognitif AD daripada neuropatologinya. Contoh spesifik termasuk
SLC6A9, yang berkontribusi terhadap potensiasi NMDA (Pich et al., 2012), dan GRIN2B,
yang mengkodekan subunit reseptor NR2B NMDA yang mengandung polimorfisme
nukleotida yang berhubungan dengan AD otot (SNP rs10845840) (Stein et al., 2010 Stein et
al., 2012). Juga, pemrosesan kolesterol yang menyimpang pada AD (Pooler et al., 2006)
berimplikasi pada gen pemrosesan kolesterol LCAT dalam profil penyakit (Demeester et al.,
2000); dan sebuah studi profil lipid baru-baru ini mengidentifikasi gangguan memori AD-
anteseden, yang mendukung relevansi gen terkait pengolahan lipid TBXAS1 (Mapstone et
al., 2014). Demikian juga fungsi MT1F dan MT1G dalam penyimpanan logam yang
terganggu baik pada penyakit Parkinson dan AD (Barnham dan Bush, 2008). Gen-gen ini
teregulasi pada AD tetapi tidak dalam kontrol sehat atau NDWP menyarankan keterlibatan
mereka dalam kemunduran kognitif AD dan menjadikannya sasaran terapi yang berpotensi
berguna untuk menunda kemunduran, baik sendiri atau kombinasi multi-obat, dan berbeda
dari pendekatan saat ini. pengobatan paliatif Singkatnya, terlepas dari keterbatasan yang
terlibat dalam kelompok ukuran kecil yang dianalisis, temuan kami menawarkan temuan
yang dapat diprediksi dan tak terduga mengenai signifikansi dasar dan translasi yang
mendasar.
4. Metode
4.1. Sampel dan diagnosis jaringan
Dua set jaringan otak manusia laki-laki, dari berbagai jenis gyri dari lobus temporal,
diterima dari Universitas Rush (N = 36) dan dari Neth-erland Brain Bank (NBB; N = 24).
Kelompok Rush terdiri dari jaringan otak lobus temporal dari peserta Proyek Memori dan
Penuaan. Semua peserta mendaftar tanpa mengetahui demensia dan menyetujui evaluasi
klinis perincian tahunan dan sumbangan otak. Rincian evaluasi klinis dan patologi logika
telah dijelaskan (Bennett et al., 2012). Peserta menandatangani sebuah informed consent,
anatomical gift act, dan sebuah persetujuan untuk menempatkan data dan bio-spesimen dalam
repositori untuk penggunaan masa depan. Prosedur tersebut disetujui oleh dewan peninjau
institusional Pusat Medis Rush Uni-versity. Bahan beku disimpan dalam lembaran 1 cm di a

-80 freezer sampai ditarik dan dibedah untuk penelitian ini. Data pasien lengkap ada dalam
Tabel Tambahan 1 dan 2. Ekspresi diferensial pertarungan potensial antara kelompok
ditunjukkan pada Gambar Tambahan.

Sebelum sampel homogenisasi dipindahkan ke es, beratnya dengan cepat, dan buffer lisis esol
10 kali lipat (10 mM Tris-Cl pH 7,4, 1 M NaCl, 1 mM EGTA, 1% Triton-X100) ditambahkan
yang mengandung penghambat fosfatase ( 20 mM NaF, 1 mM -gliserofosfat, 1 mM
ortovanadat) dan protease inhibitor (1: 200 dari resep koktail Calbiochem III) untuk sampel
protein Western Blot. Sampel dilisis dengan alu pellet Kontes selama 10-15 s, diinkubasi
selama 30 menit pada es dan centri-diambil selama 30 menit, 4 C, pada 17,900 rcf.
Supernatan dipindahkan ke tabung reaksi bersih dan disimpan pada suhu -20 C sampai
digunakan. Untuk Western Blotting,

sampel dipisahkan oleh SDS-PAGE (10 g total protein per lane) dan dipindahkan ke
nitroselulosa. hnRNPA1 dan selenium beta protein spesifik neuron terdeteksi dengan antibodi
primer (Santa Cruz sc-56.700 pada 1: 200 dan Abcam ab-78.078 pada 1: 500), antibodi
sekunder HRP-con-jugated (Jackson 115-035-062 , 1: 20: 000) dan ECL (SuperSignal West
Femto, Thermo 34,094), menggunakan Imager myECL

dan software myImage (Thermo Scientific) untuk deteksi, analisis dan kuantifikasi. Aktivitas
hidrolisis kolinesterase diukur dengan menggunakan uji Ellman seperti yang telah dijelaskan
sebelumnya (Berson et al., 2012).
4.2. QuantSeq
4.2.1. Persiapan dan penyiapan perpustakaan
Per sampel, 20 ng RNA total full-total yang telah dimurnikan digunakan untuk
melakukan kit QuantSeq Reverse 3 (Lexogen GmbH, Wina, Aus-tria) yang menghasilkan
perpustakaan NGS yang berasal dari akhir 3 'dari RNA polialenilasi. Generasi perpustakaan
diawali dengan oligo (dT) primata dengan primer yang sudah mengandung linker yang
berhubungan dengan Illumina untuk Read 1. Setelah sintesis strand pertama, RNA
dikeluarkan sebelum sintesis untai kedua dimulai oleh primer acak yang berisi sesuai linker
yang berhubungan dengan Illumina. 3 'QuantSeq menghasilkan satu fragmen per transkrip
pada akhir yang sangat 3'. Perpustakaan diperkuat PCR dan diberi kode barcode dalam 18
siklus. Jumlah yang sama dari 72 perpustakaan digabungkan menjadi satu campuran jalur.

Illumina HiSeq 2500 (Illumina, Inc.) digunakan dalam mode lari cepat untuk mengurutkan
campuran 'QuantSeq 3 perpustakaan di dua jalur dalam mode baca bp 150 bp. Karena Read 1
dimulai langsung dari poli (A) ekor Multiplex Read 1 Sequencing Primer perlu diganti
dengan Custom Sequencing Primer untuk menutupi peregangan oligo (T) di awal untuk
mencapai panggilan cluster dan mencegah dephasing.

4.2.2. Baca keselarasan

TopHat 2.0.11 dan Manset 2.1.1 dengan urutan genome GRQ37 ENSEMBL hg19
dan anotasi transkripsi ENSEMBL yang terkait dalam format gtf digunakan untuk pemetaan
dan penyejajaran baca. Tabel jumlah baca per gen dihasilkan dari keberpihakan
menggunakan paket HTSEQ. Urutan minimum nilai kualitas dasar yang dipilih untuk
diproses lebih lanjut adalah 20 (skor Phred). Basa dengan nilai kualitas di bawah parameter
ini diganti dengan 'N'. Metode pelurusan progresif dipilih. Hanya keselarasan primer yang
dipertimbangkan untuk menghitung gen dan kuantifikasi. Benih identitas minimal untuk
perpanjangan alignment adalah 25 nukleotida.

4.3. Kotak
4.3.1. Ekstraksi RNA dan penghapusan RNA 5'P
RNA diekstraksi dengan kit ekstraksi SPLIT RNA (Lexogen GmbH, Wina, Austria)
yang menghasilkan fraksi RNA besar dengan ukuran cut-off lebih rendah 150 nt. Evaluasi
pada chip RNA Nano Bioanalyzer (Agilent Technologies) menunjukkan kualitas RNA
menengah sampai tinggi (RIN 6.2-8.3), dan sampel dengan nilai RIN berbeda menunjukkan
kualitas RNA-seq yang serupa. RNA 4 g diinkubasi dengan eksonuclease Terminator 5'-
phosphate-dependent (Epicenter, Madison, WI, AS) untuk menghilangkan RNA yang
terdegradasi sambil membiarkan mRNA full-length tertutup utuh.

4.3.2. Transkripsi terbalik dan amplifikasi 3'-selektif

Prosedur lengkap ditawarkan sebagai layanan SQUARE (Selective Quantitative
Amplification of RNA) oleh Lexogen (Wina, Austria; alur kerja yang tersedia di
www.lexogen.com.) Secara singkat, 4 g Terminator-treated RNA adalah full-length reverse-
transcribed , dan 1/40 dari cDNA puri kemudian diamplifikasi dalam salah satu dari 12 reaksi
PCR paralel. Setiap reaksi PCR dibentuk dengan selektif primer 5 primer dan 3 primer primer
untuk salah satu dari 12 kemungkinan kombinasi nukleotida terminal dua dari badan mRNA,
tepat di bagian hulu dari ekor poli (A). Ini menghasilkan matriks SQUARE yang disebut
dengan 12 bidang. Masing-masing bidang matriks ini berisi produk amplifikasi sub-populasi
mRNA dengan dinukleotida 3'-terminal yang diberikan, dan semua bidang matriks
digabungkan sesuai dengan keseluruhan transkopiome (mRNA).

4.3.3. Penyiapan perpustakaan & pencampuran jalur

200 ng dari 288 produk PCR (24 sampel RNA diperkuat terpisah -12 di 12 bidang
matriks) terfragmentasi panas dan kemudian diligasi ke adaptor yang kompatibel dengan
SOLiD. Perpustakaan diberi PCR-diperkuat dalam 17 siklus, dengan primer PCR mengindeks
setiap sampel dengan satu dari 96 kode bar. Tiga jalur campuran diciptakan, masing-masing
dari 96 perpustakaan sesuai dengan 24 sampel yang diperkuat di 4 bidang matriks,
mendedikasikan molaritas yang sama ke masing-masing perpustakaan. Campuran tiga jalur
adalah 1) untuk nukleotida primer primer selektif AC, AG, CA, GT, 2) AA, AT, CC, CG dan
3) CT, GA, GC, GG; dan kemudian dipilih lebih lanjut pada sistem elusi gel Pippin Prep
(Sage Biosciences, Beverly, MA, AS) di kisaran 170 sampai 400 bp.

4.3.4. RNA Sequencing

Sistem SoliD EZ Bead otomatis dan SOLID EZ Bead E80 Sys-tem Consumables
(Life Technologies Corp.) diterapkan untuk persiapan tem-plate. The SOLiD 5500xl System
dan single-end chemistry untuk sequencing RNA diaplikasikan (Life Technologies Corp.).
Data sekuens tersedia dari omnibus ekspresi gen NCBI (GEO), kabel senar seri GSE57152.
Perpustakaan sekuensing generasi berikutnya (NGS) yang dibuat dari sampel gyrus temporal
NBB menghasilkan rata-rata 6,0 * 106 (STD = 2.0 * 106) blok berpasangan unik 75 basa (bp)
tunggal akhir, atau sekitar 7.0 * 107 (STD = 1.8 * 107) jumlah baca total saat
menggabungkan semua 12 bidang SQUARE. Bacaan ini dipetakan melawan Versi
GRGCh37 / hg19 dari genom Homo sapiens (http: // genome. Ucsc.edu/). Transkrip dengan
N1 baca per kilobase per juta (RPKM) per bidang SQUARE didefinisikan sebagai terdeteksi,
sedangkan RPKM di bawah 1 dianggap mencerminkan kebocoran transkripsi (Hebenstreit et
al., 2011). Rata-rata 6610 1367 gen per bidang terdeteksi di 12 bidang (rincian pada Tabel
Tambahan 10). Kriteria ekspresif ditetapkan ke RPKM N 1 di setidaknya satu dari bidang
SQUARE, paling sedikit 80% dari kelompok donor yang diuji (Supplementa-ry Tabel 12).
Berdasarkan kriteria ini, 10.885 gen diekspresikan, 2365 dengan satu situs poli (A) dan 8520
sisanya dengan dua atau lebih poli (A). Perbandingan dengan basis data urutan terekspresikan
(EST); PolyA_DB (Zhang et al., 2005), http://exon.umdnj.edu/polya_db/), menghasilkan
5373 gen yang diekspresikan dalam lobus temporal manusia yang memiliki dua lokasi poli
(A) atau lebih sesuai dengan database berbasis EST . SQUARE mendeteksi lebih dari satu
situs poli (A) di 4353 dari 5373 gen ini (81% tumpang tindih antara dua sumber ini, yang
mungkin juga berbeda karena jaringan dipilih) sambil mengidentifikasi 4167 transkrip APA
yang baru, menunjukkan tumpang tindih yang tinggi dengan APA sebelumnya. data. Data
sequence tersedia dari NCO's GEO, Series record GSE70424.

4.3.5. Baca keselarasan

Sequence dan file berkualitas, di Lifetech milik Color Space for-mat, dipetakan
melawan versi GRGCh37 / hg19 dari genome Homo sa-piens menggunakan Lifetech
Lifescope 2.5.1 keseluruhan transkrip analisis Transkripsional secara terpisah untuk bidang
matriks SQUARE tunggal dan gabungan. File-file yang dihasilkan oleh jalur analisis ini
adalah cakupan; alignment (berkas .bam); persimpangan ekson; ekspresi ekson di RPKM;
ekspresi gen di RPKM dengan mengacu pada struktur gen RefSeq; baca hitungan dengan
mengacu pada masing-masing gen. Metrik kontrol pemetaan dan urutan / kualitas dihasilkan
baik dengan suite Lifetech dan suite analisis Integromics SeqSolve pada semua sampel.
Panjang bacaan adalah fragmen nukleotida 75, dengan persentase kelurusan genom melebihi
keseluruhan panjang urut di atas 80%. Urutan minimum nilai kualitas dasar yang dipilih
untuk diproses lebih lanjut adalah 20 (skor Phred). Basa dengan nilai kualitas di bawah
parameter ini diganti dengan 'N'. Metode pelurusan progresif dipilih. Nilai kualitas
kesejajaran genom minimum untuk keselarasan yang akan diproses lagi 10 (nilai Phred).
Hanya keselarasan primer yang dipertimbangkan untuk menghitung gen dan kuantifikasi.
Benih identitas minimal untuk keselarasan ex-tension adalah 25 nukleotida. Untuk
perbandingan antara QuantSeq dan SQUARE lihat Diskusi Tambahan.

4.3.6. Fluidigm RT-PCR

Sampel dianalisis dengan RT-PCR kuantitatif (qPCR) menggunakan Sirkuit Cairan
Terintegrasi Dinamis Fluidigm 96.96 (IFC) dan Sistem Biomark
(www.fluidigm.com/biomark-system.html). Semua sampel cDNA diamplifikasi terlebih
dahulu dengan menggabungkan masing-masing sampel dengan kolam primer dan TaqMan
Pre-Amp Mastermix Kit (PN 4384266, Biosystem Terapan), total 6,25 ng dalam reaksi 5ul,
mengikuti protokol Solid Target Target Amplified (STA) Fluidigm siklus amplifikasi)
memperkaya sampel untuk lokus yang diminati. Sampel kemudian diobati dengan
exonuclease 1 untuk menghilangkan bahan untai tunggal. Akhirnya, sampel diencerkan 1: 5
di Tris-EDTA. A Fluidigm 96.96 Dynamic Array IFC disiapkan sesuai dengan petunjuk dari
pabrik pembuatnya. Kuantitatif PCR dilakukan dengan menggunakan pewarna pewarna
EvaGreen (SsoFast EvaGreen Supermix dengan ROX Rendah, Bio-Rad) sesuai dengan
protokol Sistem Biomark.

4.3.7. Standar RT-PCR

Duplikat real-time reverse transcriptase (RT) -PCR tes melibatkan campuran master
CyberGreen (Quante). PCR dilakukan dengan menggunakan Taq DNA polymerase (Sigma).
Urutan primer tercantum dalam Tabel Supplementary 4. Suhu anil adalah 60 C untuk semua
primer. Pengenceran serial sampel berfungsi untuk mengevaluasi efisiensi primer dan
konsentrasi cDNA yang menghasilkan perbedaan linier. Tidak adanya DNA genom
diverifikasi menggunakan kontrol NRT.

4.3.8. Tes Luciferase

UTR lengkap 3'-UTR dari APP manusia, ACAT2 dan GIMAP5 disterilkan dari
DNA genomik, dan mengkloning hilir gen Renda lucif-erase di psiCHECK2 (Clonetech)
menggunakan XhoI dan NotI. Untuk membuat vektor yang mengekspresikan 3'-UTR pendek
saja, wilayah 3'-UTR dari masing-masing transkrip kloning juga dikelompokkan menjadi
psiCHECK2. Untuk mendapatkan ekspresi isoform 3 UTR yang panjang saja, situs
polyadenylation proksimal bermutasi dari AAUAAA menjadi ACUCAA (APP, ACAT2) dan
AAUAGA menjadi AAUCGA (GImAP5) menggunakan QuickChange Site Directed
Mutagenesis (Agilent). HEK-293 sel dikultur dalam DMEM ditambah dengan serum janin
bovine 10% dan diteruskan dengan TransIT-X2 (Mirus) sesuai instruksi pabrik pembuatnya.
Sel kemudian diinkubasi semalaman sebelum melakukan tes luciferase. Aktivitas Luciferase
dinilai menggunakan sistem Dual-Glo (Promega) yang dilakukan sesuai instruksi pabrikan.
Fluoresensi Renilla dinormalisasi menjadi sinyal kunang-kunang, dan hasilnya disajikan
sebagai rasio ini.

4.3.9. Analisis statistik

Untuk memeriksa signifikansi ekspresi total dan ekspresi di bidang tertentu, di tiga
kelompok pasien (AD, Con, NDWP), One-Way-ANOVA dilakukan diikuti dengan tes Tukey
post-hoc. Untuk menentukan perubahan yang signifikan antara distribusi, uji Kolmogorov-
Smirnov dilakukan. Dalam kelompok gen analisis pengayaan Gen Ontologi Gene diunduh
dari Konsorsium Ontologi Gen (http: // www. Geneontology.org/) dan uji statistik (seperti
yang dijelaskan di setiap bagian) untuk menilai pengaruhnya pada kelompok gen ini
dilakukan (lihat Penyediaan diskusi persidangan).

4.3.10. Percobaan GC-MS

Metabolit diekstraksi dari bubuk jaringan otak beku dengan ekstraksi metanol:
metil-tert-butil-eter (1: 3 (v / v)) (Khrameeva et al., 2014). Singkatnya, kira-kira 25 mg bubuk
beku tersubstitusi kembali dalam larutan ekstraksi 1 ml yang mengandung dua standar
internal (1 mg 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (PC 34: 0)). Sampel
diinkubasi selama 10 menit pada suhu 4 C pada pengocok orbital, sebelum menularkannya
ke ultra sonikasi selama 10 menit dalam sonikator pemanggang dingin. Bahan jaringan yang
tidak larut (termasuk protein) dilumasi dengan langkah sentrifugasi (5 menit; 14.000 g) dan
supernatan dipindahkan ke tabung Eppendorf 2 ml segar. Untuk memisahkan zat organik dari
fasa berair, 650 ml campuran H2O: metanol (3: 1 (v / v)) ditambahkan ke supernatan,
dicampur dengan vorteks dan disentrifugasi (5 menit; 14.000 g). Lima ratus mikroliter fase
lipid- (metil-tert-butil-eter) atas dipindahkan ke tabung Eppendorf 1,5 ml segar,
terkonsentrasi dalam vakum kecepatan dan pelet diganti kembali dalam 100 l campuran
asetonitril: isopropanol -tahan (7: 3 (v / v)) sebelum analisis kromatografi spektrometri massa
cair. Untuk analisis LC-MS dua kali 5 l lipid, ekstrak lipid yang disuspensi kembali
disuntikkan ke kolom fase terbalik kroma-toksin C8-Waters yang berkinerja ultra cepat (BEH
C8, Waters), yang terhubung ke spektrometer massa Eksperimen Orbitrap dan dianalisis.
sekali secara positif dan sekali dalam mode ion negatif (Giavalisco et al., 2011; Hummel et
al., 2011; Khrameeva et al., 2014). Data dianotasi, diproses dan tidak dikomunikasikan
seperti yang telah dijelaskan sebelumnya (Giavalisco et al., 2011; Khrameeva et al., 2014).

Data tambahan untuk artikel ini dapat ditemukan secara online di http: //
dx.doi.org/10.1016/j.nbd.2017.06.008.Kontribusi penulis
S.B. percobaan yang dirancang dan dilakukan, menganalisis data dan menulis makalah; H.S.
memprakarsai dan membimbing penelitian ini, merancang eksperimen, menganalisis data dan
menulis makalah. E.R.B., B.N., C.N., dan L.P. melakukan eksperimen. A.S., A.T., T.R.,
Y.B.P. dan A.G. menganalisis data. D.G. tulis koran. Ucapan Terima Kasih Karya ini
didukung oleh European Research Council Ad-vanced Award [hibah nomor 321501], the
Legacy Heritage Science Ini-tiative (LHSI) dari Israel Science Foundation [hibah nomor
378/11], program Nofar dari Otoritas Inovasi Israel dari Kementerian Ekonomi dan Industri
[hibah nomor 56802], Kementerian Ilmu Pengetahuan, Teknologi dan Antariksa [hibah no.
53140] dan Badan Penelitian Pro-gerak Austria (proyek Jembatan FFG1) [hibah nomor
853294 dan 6104542]. S.B. adalah seorang incumbent dari Jaringan Nasional TEVA dari Ex-
cellence dalam persekutuan Neuroscience-NNE. B.G. dan R.M. memenangkan beasiswa
pasca-dok-toral dan pra-doktoral oleh Edmond dan Lily Safra Center for Brain Sciences
 REFERENSI

1. An, J. J., et al., 2008. Peran berbeda mRNA UTR BDNF panjang 3 dalam morfologi tulang
belakang dan plastisitas syn-aptic pada neuron hippocampal. Sel 134, 175-187.

2. Andrade-Moraes, C.H., dkk, 2013. Jumlah sel perubahan pada penyakit Alzheimer
berhubungan dengan demensia, bukan pada plak dan kusut. Otak 136, 3738-3752.
3. Arancillo, M., et al., 2013. Titrasi Syntaxin1 dalam sinapsis mamalia mengungkapkan
banyak peran dalam vesikel docking, priming, dan probabilitas pelepasan. J. Neurosci. 33,
16698-16714.
4. Balla, T., 2013. Fosfoinositida: lipida kecil dengan dampak raksasa pada regulasi sel.
Fisiol Pendeta 93, 1019-1137.
5. Bandaru, V.V., dkk., 2009. ApoE4 mengganggu metabolisme sterol dan sphingolipid pada
otak Alzheimer tapi tidak normal. Neurobiol. Penuaan 30, 591-599.
6. Barbash, S., Soreq, H., 2012. Analisis meta-analisis transkrip penyakit Alzheimer
menunjukkan perubahan progresif dalam fungsi hippocampal, epigenetik dan regulasi
microRNA. Curr. Alzheimer Res. 9, 425-435.
7. Barbash, S., dkk, 2014. Koevolusi global microRNA manusia dan gen targetnya. Mol.
Biol. Evol. 31, 1237-1247.
8. Barnham, K.J., Bush, A.I., 2008. Logam pada penyakit Alzheimer dan Parkinson. Curr.
Opini Chem. Biol. 12, 222-228.
9. Beaudoing, E., et al., 2000. Pola penggunaan sinyal polyadenylation varian pada gen
manusia. Resin Genom 10, 1001-1010.
10. Bell, R.D., dkk., 2012. Apolipoprotein E mengendalikan integritas serebrovaskular
melalui siklopilin A. Alam 485, 512-516.
11. Bennett, D.A., dkk., 2012. Ikhtisar dan temuan dari studi ordo religius. Curr. Alzheimer
Res. 9, 628-645.
12. Berson, A., dkk., 2012. Hilangnya kolorergik hnRNP-A / B pada penyakit Alzheimer
mengganggu fungsi kortikal dan kognitif pada tikus. EMBO Mol. Med. 4, 730-742.
13. Blalock, E.M., dkk., 2004. Penyakit Alzheimer yang baru lahir: analisis korelasi
microarray menunjukkan respons transkripsi dan tumor supresor utama. Proc. Natl. Acad.
Sci. U. S. A. 101, 2173-2178.
14. Braak, H., Braak, E., 1995. Stadium penyakit Alzheimer berhubungan dengan perubahan
neurofibrillary. Neurobiol. Penuaan 16, 271-278 (diskusi 278-84).

15. Bulleit, R.F., et al., 1988. Wilayah yang dilestarikan dan bervariasi di subunit protein tipe
II Ca2 + / protein kinase yang bergantung pada calmodulin. Neuron 1, 63-72.
16. Cahoy, J.D., dkk., 2008. Database transkriptom untuk astrosit, neuron, dan oligoden-
drocytes: sumber baru untuk memahami perkembangan dan fungsi otak. J. Neurosci. 28, 264-
278.
17. Cmoch, A., dkk., 2012. Protein S100A dalam propagasi sinyal kalsium dalam norma dan
pa-thology. Postepy Biochem. 58, 429-436.
18. Couthouis, J., dkk., 2012. Mengevaluasi peran gen terkait FUS / TLS EWSR1 pada
sklerosis lateral amyo-trofik. Bersenandung. Mol. Genet. 21, 2899-2911.
19. Cruchaga, C., dkk., 2014. Variabel pengkodean langka pada gen D3 fosfolipase
memberikan risiko penyakit Alzheimer. Alam 505, 550-554.
20. Culebras, A., dkk., 2014. Ringkasan pembaruan pedoman berbasis bukti: pencegahan
stroke pada atrial fibrillation nonvalvular: laporan Sub-komite Pengembangan Panduan dari
American Academy of Neurology. Neurologi 82, 716-724.
21. Darmanis, S., dkk, 2015. Sebuah survei tentang keragaman transkriptom otak manusia
pada tingkat sel tunggal. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7285-7290.
22. Darvesh, S., dkk., 2003. Neurobiologi butyrylcholinesterase. Nat. Pendeta neurosci 4,
131-138.
23. Demeester, N., et al., 2000. Karakterisasi dan studi fungsional lipoprotein, protein transfer
lipid, dan lesitin: asiltransferase kolesterol pada CSF pada individu normal dan pasien dengan
penyakit Alzheimer. J. Lipid Res. 41, 963-974.
24. Di Giammartino, D.C., et al., 2011. Mekanisme dan konsekuensi poliamenilasi alternatif.
Mol. Sel 43, 853-866.
25. Di Paolo, G., Kim, T.W., 2011. Menghubungkan lipid dengan penyakit Alzheimer:
kolesterol dan baik-baik saja. Nat. Pendeta neurosci 12, 284-296.
26. Donev, R., dkk., 2007. Peran untuk SC35 dan hnRNPA1 dalam penentuan isoform
protein pre-cursor amiloid. Mol. Psikiatri 12, 681-690.
27. Elkon, R., et al., 2013. Alternatif pembelahan dan polialisasi: luas, regulasi dan fungsi.
Nat. Pendeta Genet. 14, 496-506.
28. Fu, X., dkk, 2011. Evolusi metabolik yang cepat pada korteks prefrontal manusia. Proc.
Natl. Acad.Sci. U. S. A. 108, 6181-6186.
29. Gaugler, T., dkk, 2014. Sebagian besar risiko genetik untuk autisme berada pada variasi
umum. Nat. Genet. 46, 881-885.

30. Giacobini, E., Gold, G., 2013. Alzheimer disease therapy-bergerak dari amyloid-beta ke
tau. Nat. Pendeta Neurol. 9, 677-686.
31. Giavalisco, P., dkk., 2011. Anotasi formula elementer metabo-lites polar dan lipofilik
menggunakan pelabel isotop isotop C, (15) N dan (34) S, dikombinasikan dengan massa
resapan tinggi spektrometri. Tanaman J. 68, 364-376.
32. Grimson, A., dkk., 2007. MicroRNA menargetkan spesifisitas pada mamalia: determinan
benih induk. Mol. Sel 27, 91-105.
33. Hagenaars, S.P., et al., 2016. Etiologi genetik bersama antara fungsi kognitif dan
kesehatan fisik dan mental di Biobank Inggris (N = 112 151) dan konsorsium 24 GWAS.
Mol. Psikiatri.
34. Hanada, T., et al., 2013. CLP1 menghubungkan metabolisme tRNA dengan kehilangan
motor-neuron progresif. Alam 495, 474-480.
35. Haroutunian, V., dkk., 2009. Transkripsi kerentanan daerah otak pada penyakit Alzheimer
dan demensia. Neurobiol. Penuaan 30, 561-573.
36. Hebenstreit, D., dkk., 2011. Urutan RNA mengungkapkan dua kelas utama tingkat
ekspresi gen pada sel metazoan. Mol. Syst. Biol. 7, 497.
37. Heinemann, U., dkk., 2012. Disfungsi penghalang otak-darah, pensinyalan TGFbeta, dan
disfungsi astro-cyte pada epilepsi. Glia 60, 1251-1257.
38. Heneka, M.T., dkk, 2015. Peremajaan saraf pada penyakit Alzheimer. Lancet Neurol. 14,
388-405.
39. Hummel, J., et al., 2011. Kromatografi cair performa ultra dan spektrometri massa
resolusi tinggi untuk analisis lipida tanaman. Depan. Tanaman sci 2, 54.
40. Jia, X., et al., 2017. Peran poliegenerilasi alternatif dalam respon imun bawaan antiviral.
Nat. Komunal 8, 14605.
41. Kabashi, E., et al., 2008. Mutasi TARDBP pada individu dengan sklerosis lateral
amyotrophic lateral dan sporadis. Nat. Genet. 40, 572-574.
42. Khrameeva, E.E., dkk., 2014. Nenek moyang Neanderthal mendorong evolusi
katabolisme lipid di Eropa kontemporer. Nat. Komunal 5, 3584.
43. Kim, H.J., dkk., 2013. Mutasi pada domain seperti prion di hnRNPA2B1 dan hnRNPA1
menyebabkan protein dan protein multisistem dan ALS. Alam 495, 467-473.
44. Kiskis, J., dkk., 2015. Plak-lipid terkait pada jaringan otak Alzheimer yang disadari oleh
mikroskop nonlinier. Sci Rep 5, 13489.

45. Ko, M., et al., 2016. Fosfatidilkolin melindungi neuron dari efek toksik beta-protein
amiloid dalam kultur. Resisi Otak 1642, 376-383.
46. Kolisnyk, B., et al., 2013. Penghapusan forebrain pengangkut asetilkolin vesikuler
kembali menghasilkan defisit fungsi eksekutif, metabolik, dan kelainan splicing RNA di
korteks prefrontal. J. Neurosci. 33, 14908-14920.
47. Lacour, A., et al., 2017. Faktor risiko signifikan genome untuk penyakit Alzheimer:
berperan dalam perkembangan demensia akibat penyakit Alzheimer di antara subyek dengan
gangguan cog-nitive ringan. Mol. Psikiatri 22, 153-160.

48. Lau, P., et al., 2013. Perubahan jaringan microRNA selama perkembangan penyakit
Alzheimer. EMBO Mol. Med. 5, 1613-1634.
49. Lazar, A.N., dkk., 2013. Spektrometri massa ion sekunder time-of-flight (TOF-SIMS) im-
penuaan menunjukkan kelebihan kolesterol pada korteks serebral penderita penyakit
Alzheimer. Acta Neuropathol. 125, 133-144.
50. Lee, J.Y., dkk., 2008. Analisis filogenetik situs polialegilasi mRNA menunjukkan peran
elemen transposable dalam evolusi akhir gen 3'. Asam Nukleat Res. 36, 5581-5590.
51. Lee, Y., dkk., 2012. Oligodendroglia secara metabolik mendukung akson dan
berkontribusi pada degenerasi neuro. Alam 487, 443-448.
52. Mapstone, M., dkk., 2014. Fosfolipid plasma mengidentifikasi gangguan ingatan
anteseden pada orang dewasa yang lebih tua. Nat. Med. 20, 415-418.
53. Maragkakis, M., dkk., 2009. Prediksi target microRNA yang akurat berkorelasi dengan
tingkat represi protein. BMC Bioinforma. 10, 295.
54. Martins, I.C., dkk., 2008. Lipid mengembalikan infrafibril amfloil Abeta ametoid ke
neurotoxic protofibril yang mempengaruhi pembelajaran pada tikus. EMBO J. 27, 224-233.
55. Mazin, P., et al., 2013. Perubahan splicing yang meluas dalam perkembangan otak
manusia dan penuaan. Mol. Syst. Biol. 9, 633.
56. Mbella, E.G., et al., 2000. Urutan nukleotida GG dari 3 mRNA protein prekursor protein
amy-loid yang tidak ditranslasi memainkan peran kunci dalam regulasi penerjemahan dan
pengikatan protein. Mol. Cell Biol. 20, 4572-4579.
57. Mesulam, M., et al., 2004. Cholinergic
nucleus basalis tauopathy muncul pada awal penuaan-MCI-AD continuum. Ann. Neurol. 55,
815-828.
58. Muller, C.P., dkk., 2015. Selaput lemak otak pada depresi mayor dan kecemasan.
Biochim. Biofis. Acta 1851, 1052-1065.
59. Pascoal, T.A., et al., 2016. Amyloid-beta dan hyperfosforforated tau sinergi mendorong
kemunduran metolik pada penyakit praklinis Alzheimer. Mol. Psikiatri.
60. Pich, E.M., dkk., 2012. Biomarker untuk terapi antipsikotik. Handb. Exp. Pharmacol.
339-360.
61. Pooler, A.M., dkk., 2006. Co-enzyme 3-hydroxy-3-methylglutaryl co-enzyme A
reduktase inhibitor-pravastatin meningkatkan pertumbuhan neurologis pada neuron
hippocampal. J. Neurochem. 97, 716-723.
62. Proudfoot, N.J., 2011. Mengakhiri pesan: poli (A) memberi sinyal saat itu dan sekarang.
Gen Dev. 25, 1770-1782.
63. Shah, S.A., et al., 2016. Novel osmotin menghambat SREBP2 melalui jalur jalan
AdipoR1 / AMPK / SIRT1 untuk memperbaiki defisit neuropatologis penyakit Alzheimer.
Mol. Psikiatri.
64. Soreq, H., Seidman, S., 2001. Peran baru Acetylcholinesterase untuk aktor lama. Nat.
Putaran. Neurosci. 2, 294-302

65. Stein, J.L., dkk., 2010. Analisis genom-lebar menunjukkan gen baru yang mempengaruhi
struktur lobus temporal yang memiliki relevansi dengan neurodegenerasi pada penyakit
Alzheimer. NeuroImage 51, 542-554.
66. Stein, J.L., dkk., 2012. Identifikasi varian umum yang terkait dengan volume hippo-
campana dan intrakranial manusia. Nat. Genet. 44, 552-561.
67. Tian, B., et al., 2005. Analisis besar-besaran terhadap mRNA polyadenylation gen
manusia dan tikus. Asam Nukleat Res. 33, 201-212.
68. Timmusk, T., et al., 1993. Beberapa promotor mengarahkan ekspresi spesifik jaringan
gen BDNF tikus. Neuron 10, 475-489.
69. Verkhratsky, A., et al., 2013. Astroglia dalam penyakit neurologis. Neurol masa depan 8,
149-158.
70. Wang, Y.J., et al., 2005. Ekspresi protein / protein dependent protein kinase II-alpha di
hippocampus pasien dengan penyakit Alzheimer dan kaitannya dengan AD terkait patologi.
Resisi Otak 1031, 101-108.
71. Whiley, L., dkk, 2014. Bukti metabolisme fosfatidilkolin diubah pada penyakit
Alzheimer. Neurobiol. Penuaan 35, 271-278.
72. Zhang, H., et al., 2005. PolyA_DB: database untuk mialina mRNA polyadenylation.
Asam Nukleat Res. 33, D116-D120. 73. Zhang, Z., dkk., 2008. Kekurangan SMN
menyebabkan gangguan pada jaringan khusus pada reper-toire snRNA dan cacat yang meluas
pada splicing. Sel 133, 585-600
. 74. Zhang, B., dkk., 2013. Pendekatan sistem terpadu mengidentifikasi simpul dan jaringan
genetik pada penyakit Alzheimer yang awet. Sel 153, 707-720.