AGE (2014) 36: 733 - 748 DOI 10,1007 /

s11357-014-9617-4

Konsekuensi dari usia pada penyembuhan luka iskemik pada tikus: aktivitas
antioksidan diubah dan tertunda penutupan luka

Andrea N. Moor & Evan Tummel & Jamie L. Prather & Michelle Jung & Jonathan J.
Lopez & Sarah Connors & Lisa J. Gould

Diterima: 22 Agustus 2013 / diterima: 7 Januari 2014 / Diterbitkan online: 21 Januari 2014
# Springer Science + Business Media Dordrecht (di luar AS) 2014

Abstrak Iklan ditargetkan pada populasi lanjut usia menunjukkan bahwa terapi Defisit karena usia saja. luka iskemik dari tikus berusia memiliki lebih rendah

antioksidan akan mengurangi radikal bebas dan mempromosikan penyembuhan superoxide dismutase 2 protein dan aktivitas awalnya, ditambah dengan rasio

luka, namun beberapa studi ilmiah membuktikan klaim ini. Untuk lebih memahami penurunan berkurang / teroksidasi glutathione dan aktivitas glutathione

kegunaan potensial dari terapi antioksidan tambahan untuk penyembuhan luka, peroxidase rendah. De novo sintesis glutathione, untuk mengembalikan

kami menguji hipotesis bahwa usia dan iskemia jaringan mengubah keseimbangan keseimbangan redoks pada luka iskemik berusia, diprakarsai terbukti dengan

meningkatnya ligase glutamat sistein. Hasil menunjukkan kekurangan dalam dua

enzim antioksidan endogen. Menggunakan model penutup kulit bipedicled, luka
jalur antioksidan pada tikus berusia yang menjadi berlebihan dalam jaringan
iskemik dan non-iskemik diciptakan pada tikus muda dan tua. Penutupan luka dan
iskemik, yang berpuncak pada mendalam gangguan penyembuhan luka dan
keseimbangan kritis dismutase antioksidan superoksida dan glutathione di tempat
peradangan berkepanjangan.
tidur luka ditentukan. Iskemia tertunda penutupan luka secara signifikan lebih

pada tikus tua. Lebih rendah superoxide dismutase 2 dan glutathione di luka non-

iskemik tikus berusia menunjukkan basal sebuah

Kata kunci Penuaan. Iskemia. Glutathione. Tikus.

superoksida dismutase. luka

bahan tambahan elektronik Versi online dari artikel ini (doi: 10,1007 / pengantar
s11357-014-9617-4) mengandung bahan tambahan, yang tersedia untuk
pengguna yang berwenang.
Luka perbaikan pada orang tua sebelumnya telah ditandai sebagai “ terganggu,

AN Moor (*): LJ Gould ” tetapi tidak jelas bagaimana, atau jika, usia kronologis dampak saja
Departemen Farmakologi Molekuler dan Fisiologi, University
proses penyembuhan luka. Peningkatan proteolisis dan degradasi matriks
of South Florida,
12901 Bruce B. Downs Blvd, MDC 8, Tampa, FL 33612, USA
ekstraselular, peradangan berkepanjangan (dengan rasio yang berubah
matang untuk populasi makrofag belum matang), tertunda re-epitelisasi
e-mail: amoor@health.usf.edu dan neovaskularisasi dari dasar luka, gangguan angiogenesis bawah
tempat tidur luka, dan migrasi fibroblast gangguan semuanya telah
AN Moor: E. Tummel: JL Prather: M. Jung: LJ Gould Departemen Bedah
terbukti batas tertentu pada tikus tua, tikus, dan manusia (Ashcroft et al.
Plastik, James A. Rumah Sakit Haley Veteran,
1997a . b . 1998 ; Swift et al. 2001 ; Soybir et al. 2012 ). Semua luka, tetapi
Tampa, FL 33612, USA terutama chronicwounds, pameran lokal hipoksia jaringan. Seiring
bertambahnya usia, jumlah penyakit penyerta yang menghasilkan
E. Tummel: JL Prather: M. Jung: JJ Lopez:
S. Connors: LJ Gould
Departemen Bedah, University of South Florida, Tampa, FL
33612, USA
734
di iskemia jaringan meningkat, lebih rumit penyembuhan luka pada
individu-individu. Kedua data klinis dan laboratorium mendukung
hipotesis bahwa hasil penuaan dalam respon menyimpang stres
iskemik, dengan ekspresi diubah gen, respon gangguan faktor
pertumbuhan eksogen, dan perubahan luas dalam jalur transduksi
sinyal (Mogford et al. 2004 ; Mustoe et al. 2006 ; Wu et al. 1999 ). Hal ini
juga ditetapkan bahwa konsentrasi rendah spesies oksigen reaktif
(ROS) mengaktifkan jalur sinyal sel diperlukan untuk penyembuhan
luka dan matriks ekstraselular renovasi tergantung pada
keseimbangan antara superoksida dismutase (SOD), glutation (GSH),
dan oksida nitrat (NO) (Sen 2003 ). SOD adalah baris pertama dan
paling penting dari pertahanan terhadap anion superoksida (O 2 · -).
ini isozim cepat mengkonversi O 2 · - hidrogen peroksida dalam sistem
yang sangat terkotak (Zelko et al. 2002 ). SOD2 adalah pertahanan
utama terhadap ROS dihasilkan selama respirasi aerobik. Meskipun
transkripsi SOD2 meningkat dengan sitokin inflamasi, enzim tidak
aktif oleh nitrasi tirosin spesifik dan karena itu rentan terhadap stres
oksidatif berkepanjangan (MacMillan-Gagak et al. 1998 ).
Hidrogen peroksida yang dihasilkan dari pengurangan O 2·-
SOD diubah menjadi air dan oksigen oleh oksidasi sulfhidril GSH
dikatalisasi oleh glutation peroksidase (GPx) dan oleh daur ulang
glutathione disulfida (GS-SG) ke GSH oleh glutation reduktase (GSR).
Dalam reaksi ini, setara mengurangi disediakan oleh GSH, sebuah thiol
nonprotein kunci yang mempertahankan integritas redoks selular.
Selain daur ulang, GSH homeostasis dikelola oleh de novo sintesis GSH
(Chen et al. 2010 ; Franklin et al. 2009 ; Seelig et al. 1984 ; Tu dan
Anders 1998 ). penurunan terkait usia di tingkat GSH telah dilaporkan di
otak dan hati (Liu et al.
2004 ; Liu dan Choi 2000 ) Dan ekspresi dari subunit katalitik glutamat sistein
ligase (Franklin et al berkurang. 2009 ) Tercatat pada otot soleus tikus berusia di
bawah tekanan (Chen et al. 2010 ). Dengan demikian, pengurangan ditandai
sintesis GSH, baik dari daur ulang disfungsional atau sintesis de novo tidak
memadai, bisa menyebabkan terganggunya keseimbangan antara SOD dan GSH
di penuaan kulit. Bahkan, stres panas telah terbukti menyebabkan kerusakan
oksidatif pada tikus berusia karena fluktuasi luas dalam aktivitas SOD ditambah
dengan tingkat GSH berkurang (Morrison et al. 2005 ).
Proses penghapusan ROS dalam tidur luka tidak dipahami dengan baik juga
tidak diketahui bagaimana pergeseran yang berkaitan dengan usia dalam status
redoks seluler ke profil oksidatif mempengaruhi kemampuan mamalia untuk
menanggapi tekanan
AGE (2014) 36: 733 - 748
seperti luka atau iskemia jaringan. Kami telah menemukan bahwa suplemen
antioksidan tunggal tidak efektif (data awal). Oleh karena itu, kita hipotesis
bahwa stres iskemik pada hewan berusia menyebabkan defisit gabungan
dari antioksidan endogen yang berpuncak pada cedera oksidatif dan
inflamasi yang berlebihan. Dalam penelitian ini kami menggunakan model
yang luka iskemik divalidasi tikus kami untuk mengisolasi kondisi hipoksia
jaringan dari co-morbiditas lain yang dapat berkontribusi untuk
penyembuhan tertunda pada orang tua. Berdasarkan data sementara, kami
fokus khusus pada defisit enzim antioksidan endogen sebagai mekanisme
yang bertanggung jawab untuk respon yang menyimpang terhadap stres
iskemik.
Keluarga
metode
prosedur hewan
Semua prosedur hewan telah disetujui oleh Komite Perawatan dan
Penggunaan Hewan di University of South Florida dan mematuhi semua
oleh persyaratan Undang-Undang Kesejahteraan Hewan dan Panduan untuk
Perawatan dan Penggunaan Laboratorium Hewan. 6 sehat (muda) dan
23 - 24 bulan (usia) laki-laki Fisher 344 tikus (National Institute onAging,
Bethesda, MD) yang digunakan untuk membuat model luka iskemik.
Model, diadaptasi dari pekerjaan kami dengan Sprague - Dawley tikus
(Gould et al. 2005 ), Memperhitungkan sensitivitas meningkat dari usia
Fisher 344 tikus untuk iskemia kulit dan umur panjang rata-rata sekitar
31 bulan (jantan) vs 24 -
25 bulan untuk Sprague - tikus Dawley. luka eksisi ketebalan penuh
diciptakan di tengah 10,5 ×
3,5-cm penutup (luka iskemik) dengan pukulan biopsi 6-mm dan
penyembuhan luka diikuti selama 2, 5, 7, 10, 14, dan 21 hari. Control
(non-iskemik) luka ketebalan penuh diciptakan di kedua sisi flap
iskemik untuk perbandingan. Pada saat melukai (Hari 0) dan setelah
panen, enam tikus dari masing-masing kelompok (muda dan usia)
dibius, luka iskemik dan non-iskemik secara digital difoto, dan ukuran
luka ditentukan. Dua non-iskemik dan dua luka iskemik dari setiap
hewan dibagi dua, dengan satu bagian dari luka diawetkan di 10%
buffered formalin untuk histologi dan imunohistokimia dan tiga
bagian lain jepret dibekukan dalam nitrogen cair, disimpan secara
terpisah di - 80 ° C, dan kemudian digunakan untuk analisis kadar
protein antioksidan dan aktivitas,
AGE (2014) 36: 733 - 748
mRNA dan GSH / GS-SG (dikurangi sulfhidril GSH untuk teroksidasi
disulfida GSH) rasio.
histopatologi
Luka tetap dengan 10% buffered formalin selama 24 jam yang tertanam
dalam parafin dan dipotong di 4 μ m. Serial bagian yang deparaffinized,
rehydrated, dan dicuci dalam air suling dalam persiapan untuk hematoxylin
dan eosin (H & E) pewarnaan. gambar brightfield digital dari tempat tidur
luka pada 4 × dan 40 × diperoleh dengan menggunakan Nikon (TE2000)
mikroskop terbalik ditambah dengan kamera QImaging Retiga 2000R dan
Nis Elements (versi 3.20.01 Advanced Research) perangkat lunak.
Array PCR
jaringan luka yang homogen dan jumlah ekstraksi RNA yang dilakukan
menggunakan FastRNA sistem pro (MP Biomedicals, Solon, OH).
RNAwas DNase-diperlakukan untuk menghilangkan mencemari cDNA
genom dan selanjutnya dimurnikan menggunakan RNeasy bersih-bersih
kolom (Qiagen, Valencia, CA). Untuk PCR percobaan array, RNA dari
empat tikus per kelompok (muda non-iskemik, iskemik muda, berusia
non-iskemik, dan berusia iskemik) dari hari 7 dikumpulkan memberikan
empat sampel tes, yang menjalankan 2 × untuk menghasilkan statistik
yang sesuai. Tikus oksidatif stres dan pertahanan antioksidan RT 2 profiler ™
PCR array (SABiosciences-Qiagen) digunakan untuk mengukur ekspresi
antioksidan, metabolisme ROS, dan gen oksigen transporter. Salah satu
mikrogram RNA dari masing-masing kelompok terbalik ditranskripsi
menjadi cDNA menggunakan RT 2
Pertama Strand kit (SABiosciences-Qiagen). SYBR Hijau ROX ™ qPCRmaster divisualisasikan dengan Pierce® ECLWestern Blotting Substrat (Pierce,
campuran (SABiosciences-Qiagen) digunakan bersama-sama dengan
cDNA reverse-ditranskripsi untuk QT-PCR dan aliquoted ke dalam array
PCR dan dijalankan pada mesin 7900HT QT-PCR (Terapan
Biosystems-Life Technologies). Disosiasi (lebur) kurva diperoleh pada
akhir setiap PCR dijalankan. Data dikumpulkan dengan menggunakan
SDS 2.1 ABI Prism software (Terapan Biosystems; Life Technologies).
siklus Threshold ( C t)
nilai diekspor ke berbasis Web PCR analys array spr eadshee t: http: / /
sab i osc saya ences. com / pcrarraydataanalysis.php (SABiosciences-Qiagen)
yang memanfaatkan C t metode untuk menghitung perubahan kali lipat untuk
setiap gen. The Rplp1 gen rumah tangga digunakan untuk normalisasi sebagai
yang C t nilai konsisten di empat sampel kami selama berjalan replikasi. Sebuah
peraturan empat kali lipat (naik atau turun) dalam ekspresi gen digunakan
sebagai
735
ambang batas dan gen hanya bunga yang cocok dengan kriteria tersebut
dipilih untuk validasi lebih lanjut.
lysates jaringan luka untuk elektroforesis protein, Western
blot, ELISA, dan aktivitas GPx
jaringan luka yang disimpan di - 80 ° C dipangkas untuk menghapus eschar
dangkal dan otot panniculus carnosus yang mendasarinya. Kulit yang tersisa
ditimbang, cincang dengan pisau cukur dan homogen menggunakan
FastPrep®-24 (MP Biomedicals, Solon, OH) jaringan homogenizer dalam
jaringan lisis buffer yang mengandung 10 mM Tris - HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl,
1% Triton X-100, 2 mM PMSF, dan protease inhibitor cocktail (Pierce, Rockford,
IL). Berikut sentrifugasi pada 14.000 × g selama 15 menit, supernatan dibuang,
disonikasi sebentar, disentrifugasi, dan diuji untuk kandungan protein
menggunakan Pierce BSA ™ uji protein kit (Pierce, Rockford, IL). lysates jaringan
disimpan pada
- 80 ° C sampai analisis. Lysates yang dicairkan, dicampur 1: 4 dengan 5 ×
buffer sampel (0,3 M Tris - HCl, 5% ( w / v) SDS, 50% ( v / v) gliserol, 100 mM
DTT, dan pelacakan pewarna merah muda; ThermoScientific, Pierce
Bioteknologi, Rockford, IL) direbus selama 3 menit, dimuat (5 μ g / lane) ke 4
- 20% gel pracetak gradien dan ditransfer ke Protran BA 83 membran
nitroselulosa (Whatman®, Dassel, Jerman). Membran diblokir selama 1 jam
dalam 5% skimmilk bubuk dalam 1 × TBS-T, pH 7,5 (TBS dengan
0,1% Tween 20), dibilas di TBS-T, dan diinkubasi semalam pada 4 ° C
dengan mouse anti-glutamat sistein ligase- pengubah subunit (GCLM)
antibodi (ab55436; Abcam, Cambridge, MA) pada pengenceran 1: 1.000
atau dengan kelinci anti-GSR (ab16801) pada 1: 1.000. Membran kemudian
dicuci dalam TBS-T dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu kamar dengan
baik sebagai HRPconjugated kambing anti-rabbit IgG (H + L) atau
HRPconjugated anti-IgG pada pengenceran 1: 3.000. Band
Rockford, IL) dan film Kodak BioMax Cahaya (Carestream Kesehatan,
Inc, Rochester, NY). jumlah relatif (volume (intensitas * mm 2)) protein
ditentukan dengan menggunakan imager BioRad (BioRad, Hercules, CA)
dan perangkat lunak densitometri (QuantityOne, versi 4.6.3, BioRad,
Hercules, CA). Data dinyatakan sebagai persen (rata-rata ± SD; n = 5 - 6 /
group).
ELISA untuk SOD dan GPx1
SOD1 (sitosol), SOD2 (mitokondria), dan tingkat protein GPx1
diukur dengan menggunakan tikus-spesifik ELISA kit (USCN Life
Sciences, Inc dan Cedarlane
736
Laboratories USA, Inc, Burlington, NC). Secara singkat, standar dimurnikan,
kosong, dan sampel (100 μ l dari lisat jaringan luka; n = 6 - 8
/ kelompok) diinkubasi di sumur microplate precoated dengan
monoklonal anti-SOD1, SOD2, atau antibodi GPx1 selama 2 jam pada
37 ° C. Wells yang dikosongkan (tidak dicuci) dan biotin-terkonjugasi
poliklonal antibodi spesifik untuk SOD1, SOD2, atau GPx1 ditambahkan
selama 1 jam pada 37 ° C. Berikut pencucian sumur (3 ×) sebuah avidin
konjugasi solusi lobak kuda peroksidase ditambahkan ke sumur dan
diinkubasi selama 30 menit pada 37 ° C. Berikut pencucian sumur (5
×), solusi substrat TMB ditambahkan ke sumur dan piring diinkubasi
selama 15 - 25 menit pada 37 ° C. Reaksi dihentikan dengan
penambahan asam sulfat (stop solution) dan absorbansi dibacakan
secara spektrofotometri pada panjang gelombang 450 nm. kurva
standar yang dihasilkan dengan memplot log dari nilai-nilai densitas
optik standar ( x- axis) terhadap konsentrasi diketahui standar ( y
sumbu). Nilai-nilai yang dinormalisasi dengan konsentrasi protein dari
masing-masing sampel. Data dinyatakan sebagai mean ± SD ( n = 6 -
8).
aktivitas SOD - persiapan sampel
jaringan luka yang disimpan di - 80 ° C dibuat seperti dijelaskan di
atas cincang di atas es di 300 μ l SOD buffer yang mengandung 20
mM HEPES, pH 7,2, 1 mM EGTA, 210 mM mannitol, dan 70 mM
sukrosa. jaringan dihomogenisasi dalam matriks Sebuah tabung
menggunakan FastPrep®-24 (MP Biomedicals, Solon, OH) dalam
volume akhir 500 μ l. Sampel disentrifugasi pada 1.500 × g
selama 20 menit pada 4 ° C. Supernatan dipindahkan untuk
membersihkan tabung eppendorf dan disonikasi sebentar (2 s) pada
setting terendah untuk mematahkan tersisa sel utuh. konsentrasi total
protein ditentukan sebelum sentrifugasi pada 15.000 × g selama 40 menit
pada 4 ° C. Supernatan (fraksi sitosol) telah dihapus untuk
membersihkan tabung eppendorf. Pelet mitokondria disuspensi dalam 60 μ
l SOD penyangga dan disonikasi selama 2 s. The sitosol (SOD1) dan
mitokondria sampel (SOD2) diuji untuk konsentrasi protein seperti yang
dijelaskan sebelumnya.
aktivitas SOD
SOD 1 dan SOD kegiatan 2 diukur dengan menggunakan kit yang
menggunakan garam tetrazolium untuk mendeteksi radikal superoksida
yang dihasilkan oleh xantin oksidase dan hipoksantin (Cayman Chemical Co
Ann Arbor, MI). Satu unit SOD didefinisikan sebagai jumlah enzim yang
dibutuhkan untuk
AGE (2014) 36: 733 - 748
menunjukkan 50% dismutasi dari radikal superoksida. Secara singkat,
standar SOD (0 - 0,25 U / kegiatan ml) dan sampel ditambahkan ke
sumur dan masing-masing menerima 200 μ l dari diencerkan detektor
radikal. Reaksi dimulai dengan penambahan xanthine oxidase ke
sumur dan inkubasi selama 20 menit pada suhu kamar. Absorbansi
dibaca pada 460 nm. Rata-rata absorbansi dihitung dan kemudian
tingkat linier (LR) untuk setiap standar berasal. SOD tingkat standar
linierisasi dihitung sebagai fungsi dari aktivitas SOD akhir (unit per
mililiter) untuk kurva standar yang khas. aktivitas SOD sampel (sitosol
= SOD1 dan mitokondria = SOD2) diperoleh dengan menggunakan
persamaan yang diperoleh dari regresi linier dari kurva standar
dengan menggantikan LR untuk setiap sampel. Hasilnya dinormalisasi
dengan berat (mg) dari mulai jaringan luka. Data direpresentasikan
sebagai mean ± SD ( n = 4 - 6.)
Jumlah GSH dan rasio GSH-GS-SG
Sebuah deteksi kit GSH (Cayman Chemical Co, Ann Arbor, MI) digunakan untuk
mengukur jumlah mikromolar dari GS-SG (setara dengan jumlah GSH) di lysates
jaringan luka. jaringan luka ditimbang, cincang di 1XPBS, dan ditambahkan ke
MPLysing Matrix Sebuah tabung (MP Biomedicals, Solon, OH) yang mengandung
1XPBS di atas es. Jaringan yang homogen menggunakan FastPrep®-24, disonikasi
selama 5 s pada es dan disentrifugasi selama 20 menit pada 10.000 × g pada 4 ° C.
Supernatan dipindahkan ke 0,5 ml Amicon® yang ultra filter sentrifugal (30 K;
Millipore Corp., Billerica, MA) dan disentrifugasi selama 10 menit pada 14.000 × g
pada 4 ° C, dan aliran melalui itu dibekukan pada - 80 ° C untuk analisis nanti.
Sampel tidak membutuhkan deproteinasi. Untuk penentuan jumlah GSH, kurva
standar dibuat dengan menggunakan GS-SG. Di bawah kondisi assay, GS-SG
segera dikurangi menjadi GSH sehingga memberikan standar yang diperlukan.
Penentuan GS-SG, eksklusif GSH, dilakukan oleh derivatizing GSH dengan 2-
Vinylpyridine (Sigma, St Louis, MO) selama 1 jam pada suhu kamar. Kurva standar
yang terpisah disusun dengan menggunakan 2-Vinylpyridine diinkubasi untuk
jumlah waktu yang sama sebagai sampel (1 jam). Absorbansi diukur pada 405 nm
dan pembacaan endpoint diperoleh setelah inkubasi 25 menit pada suhu kamar
dalam larutan kit substrat. Rata-rata dari pembacaan absorbansi duplikat dicatat
untuk standar dan sampel ( n =
6 - 8) dan latar belakang dikurangkan. Dikoreksi absorbansi untuk
setiap standar diplot sebagai fungsi dari konsentrasi GS-SG atau
total GSH dan linier
AGE (2014) 36: 733 - 748
kurva regresi yang dihasilkan. Absorbansi sampel kemudian digunakan
dalam kurva analisis fit untuk mendapatkan micromolars rata-rata per
sumur GS-SG atau total GSH dan akhirnya dinormalisasi untuk luka
berat jaringan (dalam gram). Data disajikan sebagai mean ± SD; n = 5 -
8 sampel / kelompok dan titik waktu.
aktivitas GPx
Kegiatan GPx diukur secara tidak langsung dengan reaksi
ditambah dengan GR (Cayman Chemical Co Ann Arbor,
MI). Secara singkat, GS-SG, diproduksi pada pengurangan hidroperoksida
oleh GPx didaur ulang ke keadaan dikurangi dengan GR dan NADPH.
Oksidasi NADPH untuk NADP + disertai dengan penurunan absorbansi
pada 340 nm. Dalam kondisi di mana aktivitas GPx adalah tingkat
membatasi, laju penurunan A 340 berbanding lurus dengan aktivitas GPx
dalam sampel (Paglia dan Valentine 1967 ). Latar Belakang (non-enzimatik),
kontrol positif (bovine eritrosit GPx), dan sampel (20 μ l dari lisat jaringan
luka) ditambahkan ke lempeng bersama dengan 120 μ l dari assay
penyangga (50 mM Tris - HCl, pH 7,6, dan 5 mM EDTA) dan 50 μ l co-
substrat (NADPH, GSH, dan GR). Reaksi dimulai dengan penambahan
kumena hidroperoksida untuk semua sumur dan absorbansi dibaca sekali
setiap menit di 340 nm selama 8 menit. nilai absorbansi yang diplot
sebagai fungsi waktu untuk mendapatkan kemiringan (tingkat) dari bagian
linier dari kurva. Kegiatan GPx kemudian dihitung dengan menentukan
tingkat
SEBUAH 340 / min (kemiringan) untuk latar belakang dan mengurangi tingkat ini
dari yang dari sampel. Rumus berikut kemudian digunakan untuk menghitung
aktivitas GPx: SEBUAH 340 / min ÷
0,00373 μ M - 1 ( 0,19 ml ÷ 0,02 ml) = nmol min -1 ml - 1,
di mana 0,00373 adalah koefisien NADPH kepunahan (disesuaikan dengan
panjang jalur dari solusi di dalam sumur yang 0,6 cm) digunakan untuk
menentukan laju reaksi pada 340 nm. Akhirnya, GPx nilai aktivitas
dinormalisasi dengan konsentrasi protein (mikrogram per mikroliter). Data
disajikan sebagai mean ± SD ( n = 6 - 8).
Analisis statistik
Data disajikan sebagai mean ± SD. Mahasiswa ' s tidak berpasangan t
tes, Mann - Whitney rank sum test, atau satu arah analisis varians dengan hoc
perbandingan pasca dilakukan dengan menggunakan Mahasiswa - Orang baru
- Cara Keuls (data normal) digunakan untuk menentukan signifikansi statistik
antara kelompok yang menggunakan SigmaStat® versi 3.5 (Systat Software,
Inc., Point Richmond, CA). P nilai-nilai kurang
737
dari 0,05 dianggap signifikan. PCR array dan Data qPCR
direpresentasikan sebagai perubahan kali lipat dengan P nilai kurang
dari 0,05 dianggap signifikan.
hasil
Penutupan luka tertunda dengan penuaan dan iskemia pada tikus Fisher
daerah luka dikuantifikasi gambar fromdigital (Gambar. 1a ) Dari luka
di hari (D) 2, 5, 7, 10, 14, dan 21 di kelompok non iskemik dan iskemik
(muda dan umur). Data disajikan sebagai persentase dari area luka
awal (6 mm daerah biopsi punch = ( Π) r 2= 3.14 × 9 =
28,26 mm 2) di D0 (Gambar. 1b ). Diharapkan, penyembuhan luka iskemik
pada kedua kelompok tertunda secara signifikan dibandingkan dengan
luka non-iskemik (muda D2, P =
0,039; D5 - D10, P = < 0,001; D14, P ( sebenarnya) = 0,004; D2 berusia: P = 0.013; D5 -
10, P = < 0,001; D14 P ( sebenarnya) = 0,002; dan D21, P (tepat) = <0,001). Pada
sekitar titik tengah dari penyembuhan, perbedaan usia
menjadi jelas dan dari D10-D21 luka iskemik pada tikus berusia secara
signifikan lebih besar daripada luka iskemik pada tikus muda ( P = 0,002; P
= 0,008; dan P = 0,006, masing-masing). Tidak ada perbedaan di daerah
luka yang diamati antara luka muda dan berusia non-iskemik pada setiap
titik waktu.
Histopatologi: luka iskemik dari tikus Fisher berusia ditandai dengan
peradangan berkepanjangan
luka non-iskemik dari tikus muda dan tua tidak hadir dengan perbedaan
morfologi kotor yang signifikan selama waktu (Gambar. 1a ). Secara
histologis, luka non-iskemik fromyoung (lihat Sumberdaya online
1a - c ) Dan berusia (Sumber online 1d - f ) Tikus yang serupa dalam hal
jumlah pembentukan jaringan granulasi, infiltrat inflamasi (neutrofil dan
makrofag) clearance, re-epitelisasi, dan epitel ketebalan pada hari-hari
10 melalui 21. Satu-satunya perbedaan jelas adalah pada hari ke
21when non-iskemik luka fromyoung tikus ( melihat tambahan Gambar.
1c dibandingkan f) menunjukkan renovasi sedikit lebih baik dari dermis
dengan perkembangan folikel rambut baru. fibroblas dermal di kedua
muda dan berusia yang berorientasi sejajar dengan epidermis (lihat
Sumberdaya online 1 , Insets c dan f). luka iskemik keseluruhan
(Gambar. 2a - c (Muda), d - f (umur)) yang ditandai dengan jaringan
granulasi kurang, kepadatan tinggi neutrofil dan makrofag (terutama
 AGE (2014) 36: 733 - 748

Gambar. 1 Penutupan luka tertunda oleh

iskemia dan usia dalam model tikus Fisher
yang sama 738
344. daerah luka dikuantifikasi dari gambar
non iskemik (muda dan usia) pada titik waktu
digital ( Sebuah)

darisecaralukasignifikan-luka dilebihharibesar(D)daripada2,5,7,kelompok
10, 14, dan 21 di kelompok-kelompok titik waktu
yang sama; pisau belati mewakili
non-iskemik dan iskemik (muda dan umur). lebih
besar daripada kelompok non iskemik pada
Data disajikan sebagai persentase dari area
= 6 - 8 / kelompok. Asterisk mewakili signifikan
luka awal (6 mm daerah biopsi punch = ( Π)
direpresentasikan sebagai persen (mean ± SD), n r
2= 3.14 × 9 = 28,26 mm 2) di D0 ( b). Data
AGE (2014) 36: 733 - 748
Gambar. 2 Histopatologi: luka iskemik dari tikus Fisher berusia ditandai oleh
peradangan berkepanjangan. Perwakilan pewarnaan H & E hari 10, 14, dan 21
iskemik ( Sebuah - c muda; d - f
umur) luka pada 4 × kekuasaan dan 40 × insets ( n = 3 - 4 bagian / kelompok /
dalam luka iskemik dari tikus berusia (membandingkan dan
d) dan mengurangi clearance sel-sel inflamasi. Meskipun kelompok
kecil neutrofil (*) dapat dideteksi pada luka iskemik dari tikus muda di
hari 10 dan 14 (a - b), makrofag adalah jenis sel dominan hadir di
bidang dasar luka tidak tercakup oleh epitel. fibroblas dermal yang
diamati dari hari 10 dan seterusnya (Insets a - c) sebagai dermis mulai
menata kembali. Fibroblas di luka iskemik tikus muda awalnya tidak
teratur dan tidak menjadi berorientasi sejajar dengan epidermis
sampai hari 21, lebih lambat dari luka non-iskemik dari tikus muda
atau usia. Dalam luka iskemik dari tikus berusia, neutrofil (*) terdeteksi
di kepadatan tinggi di seluruh
739
titik waktu). Asterisk menunjukkan infiltrasi inflamasi (neutrofil); SAYA bermigrasi
lidah epitel, TE epidermis menebal.
Skala bar = 500 μ m dan 50 μ M ( insets)
tidur luka (inset di d) bersama dengan makrofag melalui hari 14.
kantong Kecil neutrofil tetap melalui hari 21. Makrofag juga bisa dilihat
di seluruh jaringan granulasi dan di bawah epidermis migrasi di hari 14
- 21 (e - insets f). fibroblas dermal masih teratur di hari 21 (inset di f).
Dibandingkan dengan luka non-iskemik, lidah epitel (ME) migrasi
adalah nyata lebih lambat pada luka iskemik (hari 10 - 14, sebuah - b).
Hal ini terutama terlihat pada luka iskemik tikus berusia (d - f), yang
masih belum kembali epithelialized hari 21 (f). Epitel pada luka iskemik
tetap menebal melalui hari 21 dibandingkan dengan luka non-iskemik
(lihat Sumberdaya online 1 ).
 AGE (2014) 36: 733 - 748

Tabel 1 Stres oksidatif Data PCR array yang direpresentasikan sebagai regulasi kali lipat (naik atau turun) gen antioksidan pilih dari terisolasi hari 7 jaringan luka

Abbrev. nama nama gen Berumur iskemik Berumur iskemik dibandingkan iskemik muda dibandingkan Berumur non-iskemik
gen dibandingkan iskemik berusia non-iskemik muda non-iskemik dibandingkan muda
muda non-iskemik

SOD1 Superoxide dismutase 1 NC NC NC NC

SOD2 Superoxide dismutase 2 NC NC NC ↓ - 5.02

Gpx1 Glutation peroksidase 1 ↓ - 5.17 NC NC NC

Gpx3 Glutation peroksidase 3 ↓ - 16,47 NC NC ↓ - 4.38

Gpx6 Glutation peroksidase 6 ↑ + 4.88 NC NC NC

Gpx7 Glutation peroksidase 7 ↓ -28,98 NC NC ↓ -5,82

Gpx8 Glutation peroksidase 8 ↓ -15.21 NC NC ↓ -5.22

GSR glutathione reduktase NC NC NC NC

Sebuah NC menandakan tidak ada perubahan

b↓ Menandakan bawah regulasi sementara ↑ menandakan up regulasi gen spesifik 740

Beberapa gen antioksidan yang menurunkan regulasi oleh usia saja hidroperoksida lipid) semua berubah seperti yang diharapkan. GSR
juga tidak berubah.

The ledakan oksidatif yang dihasilkan oleh infiltrasi neutrofil selama

fase inflamasi awal hasil penyembuhan luka dalam produksi ROS dan protein SOD1 adalah diferensial meningkat pada luka iskemik dari tikus muda

melepaskan ke tempat tidur luka. Berdasarkan temuan histologis dan tua tanpa peningkatan paralel dalam aktivitas SOD1

bahwa peradangan yang berkepanjangan di luka iskemik, kami

menguji array gen spesifik terhadap stres oksidatif dan pertahanan
antioksidan pada saat kita harapkan respon antioksidan berada di
puncaknya. Meja 1 merangkum data array yang PCR gen antioksidan
pilih dari terisolasi hari 7 jaringan luka. Tidak ada yang signifikan
perubahan (lebih empat kali lipat) dalam gen yang dipilih diamati
dengan iskemia dibandingkan dengan nonischemia untuk kedua
SOD1 (sitosol) tingkat protein antioksidan dan aktivitas diukur dalam jaringan
luka lysates Total sel dan pecahan sitosol jaringan luka sebagai ukuran tidak
langsung dari ROS, khususnya anion superoksida, di tempat tidur luka. SOD1
protein (diukur dengan ELISA) secara signifikan meningkat pada luka iskemik
dari muda (Gambar. 3a ,

kelompok muda dan usia. Namun, SOD2 (mitokondria), GPx3 Inset atas; hari 5 ( P = 0,009), 7 ( P = 0,002), 10 ( P = 0,002) dan 14 ( P = 0,015)) dan
(ekstraseluler), GPx7 (prekursor GPx), dan GPx8 (diduga) secara berusia (Gambar. 3a , Inset bawah; hari 2 ( P = 0,035), 5 ( P = 0,008), 7 ( P = 0,004), 10 (
signifikan menurunkan regulasi dengan usia di luka non iskemik P = 0,010), 14 ( P = 0,004), dan 21 ( P = 0,003)) tikus

dibandingkan dengan luka muda non iskemik. Membandingkan luka
iskemik muda dan tua, GPx1 (sitosol dan paling berlimpah dengan
substrat disukai hidrogen peroksida), GPx3, GPx7, dan GPx8 semua
secara signifikan menurunkan regulasi oleh usia. Dalam GPx6 kontras
(ditemukan dalam epitel penciuman dan jaringan embrio) adalah
diregulasi. GPx2 (ditemukan dalam jaringan pencernaan), GPx5
(epididimis terkait androgen protein), dan GPx4 (sitosol dengan
substrat yang disukai
pada hampir semua titik waktu dibandingkan dengan luka non-iskemik.
luka iskemik dari tikus berusia juga menunjukkan tingkat protein SOD1
signifikan lebih tinggi sepanjang perjalanan waktu dibandingkan
dengan luka iskemik dari tikus muda (Gambar. 3a ; hari ke-2 ( P = 0,003),
7 ( P = 0,032), 10 ( P = < 0,001), 14 ( P = < 0,001), dan 21 ( P = 0,017)).
Meskipun meningkat protein SOD1 karena iskemia kami tidak dapat
mendeteksi perbedaan dalam kegiatan SOD1 (U / mg) pada luka
iskemik dibandingkan dengan luka non-iskemik tikus muda dan tua
(data tidak ditampilkan). Kegiatan SOD1 tidak berbeda pada luka
iskemik dari muda dibandingkan dengan tikus berusia (Gambar. 3b ).
AGE (2014) 36: 733 - 748
Gambar. 3 protein SOD1 adalah diferensial meningkat pada luka iskemik dari tikus muda
dan tua tanpa peningkatan paralel dalam aktivitas SOD1. Sebuah ( insets) SOD1 (larut)
tingkat protein diukur dalam homogenat luka menggunakan ELISA kit tikus-spesifik,
antibodi monoklonal untuk SOD1, dan absorbansi dibaca pada 450 nm. Nilai-nilai yang
dinormalisasi dengan konsentrasi protein dari masing-masing sampel. Data dinyatakan
sebagai mean ± SD; n = 6 - 8. Asterisk, secara signifikan lebih tinggi ( P < 0,05)
dibandingkan iskemik muda ( Sebuah) atau non-iskemik ( insets). b SOD1 aktivitas
enzimatik (unit per miligram jaringan luka) pada jaringan luka iskemik dari
tikus muda dan tua. Data dinyatakan sebagai mean ± SD; n = 4 - 8. c ( insets)
protein SOD2 menurun pada luka iskemik dari tikus berusia selama fase awal
penyembuhan dengan sesuai aktivitas SOD2 lebih rendah. SOD2 (mitokondria)
tingkat protein pada luka diukur
protein SOD2 menurun pada luka iskemik dari tikus
berusia selama fase awal penyembuhan dengan sesuai
aktivitas SOD2 lebih rendah
Antioksidan SOD2 (mitokondria) tingkat dan aktivitas protein diukur
dalam jaringan luka lysates Total sel dan pecahan mitokondria
sebagai ukuran tidak langsung dari mitokondria ROS, khususnya
anion superoksida, di tempat tidur luka. SOD2 protein (yang diukur
dengan ELISA)
741
menggunakan tikus-spesifik ELISA kit seperti dijelaskan di atas, tetapi menggunakan SOD2
antibodi monoklonal. Data dinyatakan sebagai mean ± SD;
n = 6 - 8. Asterisk, secara signifikan lebih tinggi ( P < 0,05) dibandingkan non-iskemik; ( Pisau
belati) secara signifikan lebih rendah dari iskemik non berusia ( c, inset bawah) dan iskemik
muda ( c). d aktivitas enzim SOD2 (unit per miligram jaringan luka) pada luka non-iskemik muda
dan berusia terhadap luka iskemik pada hari 14 dan 21. Data dinyatakan sebagai mean ± SD, n =
4 - 8. Asterisk, secara signifikan lebih tinggi ( P < 0,05) dibandingkan muda non-iskemik; tanda
Nomor, secara signifikan lebih tinggi dari usia non-iskemik. e tingkat aktivitas SOD2 selama
waktu di luka iskemik dari tikus muda dan tua. Pisau belati, signifikan lebih rendah daripada
muda non-iskemik; tanda Nomor,
secara signifikan lebih tinggi dari iskemik berusia di hari 2 dan 5; asterisk,
secara signifikan lebih tinggi dari iskemik muda
secara signifikan meningkat pada luka iskemik dari tikus muda
(Gambar. 3c , Inset atas; hari 2 ( P = 0,026), 5 ( P = 0,006), 7 ( P = 0,028), 10 (
P = 0,001), dan 21 ( P =
0.036)) paling titik waktu dibandingkan dengan luka non iskemik. Selain dari
ketinggian yang signifikan pada hari ke 7 ( P = 0,041), iskemia tidak mengubah
tingkat protein SOD2 pada tikus berusia dibandingkan dengan non-iskemik
(Gambar. 3c , Inset bawah). Dalam luka iskemik SOD2 protein secara signifikan
lebih rendah pada tikus berusia dibandingkan dengan
742 AGE (2014) 36: 733 - 748

Gambar. 4 Total yang lebih rendah glutathione (GSH + GS-SG) tingkat untuk perpanjangan waktu secara signifikan lebih rendah ( P < 0,05) dibandingkan muda non-iskemik; pisau belati,

dan penurunan rasio GSH / GS-SG membedakan usia dari luka muda iskemik. Total tingkat secara signifikan lebih rendah dari usia non-iskemik. c ( tingkat dan rasio (GSH / GS-SG GSH + GS-SG)) ( d) di
glutathione (GSH + GSSG, micromolars per miligram jaringan luka) ( Sebuah) dan rasio (GSH / GS- iskemik lysates jaringan luka dari tikus muda dan tua. Asterisk, secara signifikan lebih rendah dari iskemik

SG) ( b) di non-iskemik dan iskemik lysates jaringan luka dari tikus muda dan tua. Kombinasi dari muda; tanda bintang ganda, secara signifikan lebih tinggi dari hari iskemik muda 2 dan 5; Pisau belati di ( c),

kelompok sulfhidril dari GSH dan 5,5 '- dithio-bis-2- (asam nitrobenzoat) menghasilkan asam secara signifikan lebih tinggi daripada berusia hari iskemik 10; pisau belati di ( d), secara signifikan lebih tinggi

5-tio-2-nitrobenzoic, dan absorbansi yang dibacakan pada 405 - 414 nm. dari iskemik muda

Data disajikan sebagai mean ± SD; n = 5-8. Asterisk,

tikus muda (Gambar. 3c ) Pada hari-hari 2 ( P = 0,037), 5 ( P =

<0,001), dan 10 ( P = 0,003). Kegiatan SOD2 pada luka iskemik dari tikus Total yang lebih rendah glutathione (GSH + GS-SG) tingkat untuk

berusia awalnya rendah (Gambar. 3e hari ke-2; perpanjangan waktu dan penurunan rasio GSH / GS-SG membedakan
usia dari luka muda iskemik
P = 0,017) dibandingkan dengan luka iskemik dari tikus muda tapi meningkat
secara signifikan oleh hari 7 (dibandingkan dengan hari 2 ( P

= < 0,001) dan 5 ( P = 0,003) luka iskemik umur). Kegiatan SOD2 pada luka Untuk menyelidiki sistem antioksidan GSH ' kapasitas untuk menetralisir hidrogen

iskemik (umur) disejajarkan tingkat protein SOD2 rendah pada hari peroksida yang dihasilkan oleh aktivitas antioksidan SOD, tingkat total glutathione
(GSH + GS-SG) dan rasio dikurangi menjadi glutation teroksidasi (GSH / GS-SG)
2 dan 5 dibandingkan dengan luka iskemik dari tikus muda (Gambar. 3c ) Dan
yang diukur dalam lysates jaringan luka. Selama fase awal penyembuhan luka
peningkatan SOD2 protein pada hari ke 7 (Gambar. 3c , Inset bawah). Pada siang
(hari 2 dan 5), jumlah tingkat GSH secara signifikan menurun pada luka iskemik
hari 14, aktivitas SOD2 pada luka non-iskemik dari tikus muda dan berusia turun
dibandingkan
secara signifikan, sedangkan aktivitas di luka iskemik dipertahankan (Gambar. 3d ).

Terakhir, aktivitas SOD2 pada luka iskemik dari tikus berusia meningkat secara dengan luka non-iskemik (Gambar. 4a ) Di kedua muda (hari 2; P =

signifikan pada hari 21 (Gbr. 3e ; P = 0,004) dibandingkan dengan luka iskemik dari
0,0034) dan berusia (hari 2; P =

tikus muda.
0.004 hari 5; P = < 0,001) tikus. Namun, rasio yang lebih rendah dari GSH /
GS-SGwere hanya diamati pada luka iskemik dari tikus berusia (Gambar. 4b
hari 2 hari 5; P = 0.004 dan
P = 0,052. Perbedaan usia ini jelas diamati

( Pisau belati) secara signifikan lebih rendah dari USIA iskemik muda (2014) 36: 733 - 748
iskemik hari 2; ( Ganda Asterisk) secara signifikan lebih tinggi dari usia iskemik hari 2 hari 5;
jaringan luka dari tikus muda dan tua. ( Asterisk) secara signifikan lebih tinggi daripada muda
pada luka iskemik dari tikus berusia. c Kegiatan GPx (nmols / min / ml) di iskemik lysates
signifikan lebih tinggi ( P < 0,05) dibandingkan iskemik muda. Kegiatan GPx lebih rendah
disajikan sebagai mean ± SD; n = 6 - 8 (ELISA) dan n = 5 - 6 (analisis Western blot). Asterisk, secaradan
tikus muda dan berusia dianalisis dengan ELISA andWestern, blot masing-masing. Data
iskemik. GPx1 ( Sebuah) dan GSR ( b) tingkat protein dalam iskemik lysates jaringan luka dari
Gambar. 5 Umur berbeda-beda mempengaruhi GPx1 dan tingkat protein GSR pada luka
dimana total tingkat GSH antara luka iskemik dari tikus tua dan
muda dibandingkan (Gambar. 4c ) di atas
743
kursus penuh waktu. Total GSH secara signifikan lebih rendah pada luka
iskemik dari tikus berusia (hari 2, P = 0,008; hari
5, P = 0,003; hari 7, P = 0,007 hari 10, P = 0,008) dibandingkan dengan tikus
muda dan tetap rendah untuk waktu yang lebih lama (melalui hari 10) tidak
menunjukkan pemulihan sampai hari 14 dengan peningkatan yang
signifikan dicapai dengan hari 21 (hari 21 vs hari 10, P = 0,008).
Sebaliknya, luka iskemik dari tikus muda menunjukkan peningkatan yang
signifikan dalam jumlah tingkat GSH hari 7 (hari 7 vs hari
5, P = 0,010; hari 7 vs hari 2, P = 0,017). The GSH rasio / GS-SG secara
signifikan lebih rendah pada luka iskemik dari tikus berusia (Gambar. 4d hari
ke-2, P = 0,008) dibandingkan dengan tikus muda tapi melakukan mencapai
tingkat dekat dengan orang-orang dari tikus muda dengan hari 7. Rasio
tetap stabil pada luka iskemik dari tikus muda meskipun terjadi peningkatan
kadar total GSH. Juga catatan adalah peningkatan yang signifikan dalam
rasio GSH / GS-SG di usia di hari 21 ( P = 0,043).
Umur berbeda-beda mempengaruhi GPx1 dan GSR tingkat protein pada luka
iskemik
Tingkat GPx1 dan GSR, bertanggung jawab untuk konversi dari GSH
(substrat) untuk GS-SG dan daur ulang GS-SG kembali ke GSH, yang
diukur dalam lysates luka. tingkat protein GPx1 (ELISA) secara signifikan
meningkat pada luka iskemik dari tikus berusia dibandingkan dengan tikus
muda (Gambar. 5a hari ke-2, P = 0,016; hari 5, P = < 0.001, dan hari 10, P = 0.001
melalui hari 14-data tidak ditampilkan). Tidak seperti tingkat protein
GPx1, GSR protein (oleh Western Blot) hampir tidak terdeteksi sampai
hari ke-7 pada luka iskemik (dan non-iskemik luka-data tidak ditampilkan)
dari tikus muda dan berusia (Gambar. 5b ). Pada siang hari
7, GSRwas meningkat pada luka iskemik dari tikus berusia dibandingkan dengan
tikus muda (Gambar. 5b hari 7, P = 0.038 dan
10, P = < 0,001). GSR menurun sama di luka iskemik dari tikus
muda dan berusia sesudahnya (data tidak ditampilkan).
Kegiatan GPx lebih rendah pada luka iskemik dari tikus berusia
Meskipun tidak ada perbedaan usia yang signifikan dalam aktivitas GPx
(nanomoles per menit per mililiter) dari luka non iskemik, aktivitas GPx
melakukan tren lebih rendah pada luka ini dari tikus berusia dari hari 5
sampai 21 (data tidak ditampilkan). luka iskemik dan non-iskemik sejajar
satu sama lain dengan aktivitas GPx terus meningkat secara maksimal
dengan hari 7 (data non-iskemik tidak ditampilkan) (Gambar. 5c ; (Muda)
hari 7 vs hari 2, P = 0,020; (berumur)
744 AGE (2014) 36: 733 - 748

Gambar. 6 Glutamat sistein ligasemodifier

subunit (GCLM) tingkat protein yang meningkat
dengan usia dan iskemia. Kuantifikasi subunit
modifikator GCL (GCLM) di Sebuah non-iskemik
dan b

luka iskemik dari tikus muda dan tua. density

Band dikuantifikasi setelah Western blotting
dan data direpresentasikan sebagai persen
mean ± SD; n = 5 - 6.

Asterisk secara signifikan lebih tinggi daripada

muda non-iskemik di ( Sebuah) dan iskemik muda
di ( b)

hari 7 vs hari 2 dan 5, P = < 0,001 dan P = 0,005). Penurunan aktivitas tikus berusia GCLM meningkat secara signifikan dari hari 7 sampai hari ke-21
GPx ditandai kursus sisa waktu (hari 10 sampai 21) dengan aktivitas dibandingkan dengan tikus muda (Gambar. 6b ; hari

GPx signifikan lebih rendah pada luka iskemik dari umur 7, P = 0,004; hari 10, P = 0.024; hari 14, P = 0,028; dan hari 21, P = 0,002).

dibandingkan dengan tikus muda (Gambar. 5c ; hari 10, P = 0,032; hari

14, P =
0,002; dan hari 21, P = < 0,001)

Glutamat sistein tingkat protein ligase-pengubah subunit Diskusi

meningkat dengan usia dan iskemia

Salah satu mekanisme yang bertanggung jawab untuk meningkatkan
rasio GSH untuk GS-SG adalah sintesis de novo dari GSH. Kami diperiksa
kadar protein GCLM, di lysates luka dari luka non-iskemik dan iskemik.
tingkat GCLM hampir tidak terdeteksi dalam luka non-iskemik dari tikus
muda dan berusia sampai hari 10 ketika peningkatan yang signifikan
diamati dalam luka non-iskemik dari usia (Gambar. 6a ; hari 10, P = 0,003;
hari 21, P = 0,015) dibandingkan dengan tikus muda. Dalam luka iskemik
dari
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengidentifikasi target untuk studi
intervensi masa depan dan terapi luka pada pasien usia lanjut dengan luka
iskemik. Untuk mencapai tujuan ini, kami mempelajari proses penghapusan
ROS (melalui SOD dan sistem pertahanan antioksidan GSH) yang terjadi
saat usia lanjut adalah dikombinasi iskemia jaringan. Ia telah
mengemukakan bahwa penurunan terkait usia dalam fungsi selular ini
disebabkan oleh efek kumulatif dari tingkat rendah stres oksidatif kronis
yang dihasilkan oleh endogen diproduksi ROS (Sohal et al. 1994 ). Meskipun
ROS yang
AGE (2014) 36: 733 - 748
diperlukan untuk banyak aspek penyembuhan luka, dengan
penuaan ada peningkatan mitokondria dan retikulum endoplasma
(ER) yang dihasilkan ROS, mengakibatkan kerusakan oksidatif protein
nuklir dan mitokondria, DNA dan lipid. Protein dari rantai transpor
elektron dan (ER) pendamping mempertahankan kerusakan yang
paling, sehingga nitrasi dan karbonilasi (Choksi et al. 2004 ).
kerusakan oksidatif genom mitokondria mempercepat produksi ROS,
yang mengarah ke siklus abadi meningkat kerusakan makromolekul,
lebih ROS dan disfungsi mitokondria konsekuen (Szczesny et al.
2004 ). Hal ini menyebabkan keadaan stres oksidatif kronis
berdasarkan usia lanjut saja, tanpa adanya faktor eksternal. Baru-baru
ini, Soybir et al., Menggunakan model luka insisi pada tikus,
menunjukkan bahwa ROS (terdeteksi oleh kedua luminol dan
lucigenin) pada luka non-iskemik dari tikus berusia meningkat
signifikan hingga 14 hari setelah melukai (Soybir et al. 2012 ). Penelitian
sebelumnya menggunakan model telinga iskemik kelinci telah
menunjukkan bahwa usia dan iskemia bersifat aditif, sehingga
mendalam gangguan penyembuhan luka dan kurangnya respon
terhadap faktor pertumbuhan eksogen (Bonomo et al. 2000 ; Wu et al.
1997 . 1999 ). Baru-baru ini, menggunakan model telinga iskemik tikus,
Mogford et al. dikonfirmasi penundaan yang signifikan dalam
penyembuhan luka ketika usia lanjut dikombinasikan dengan iskemia
dan menunjukkan bahwa iskemia mengubah ekspresi gen yang lebih
(baik atas dan menurunkan regulasi) pada tikus berusia daripada di
muda (Mogford et al. 2004 ). Dalam studi ini, kami menunjukkan
bahwa keterlambatan dalam penyembuhan eksisi, luka iskemik pada
tikus berusia disertai dengan pergeseran, di awal proses
penyembuhan, status redoks selular terhadap profil oksidatif dengan
rasio rendah GSH / GS-SG. Berdasarkan hasil tersebut kami
mengusulkan bahwa disfungsi dari antioksidan hasil enzim pertahanan
menyimpang (ROS) sinyal dengan usia. Sebagai sistem redoks
endogen dari hewan yang lebih tua menjadi kewalahan, kemampuan
untuk merespon stres tambahan, yaitu, iskemia, terhambat. Sementara
tingkat ROS tidak diukur secara langsung dalam penelitian ini,
gangguan penyembuhan luka ditunjukkan terlalu dan histologis,
dengan perbedaan dalam penutupan luka antara muda dan tua
menjadi jelas pada hari ke 10,
Berbeda dengan penelitian sebelumnya beberapa yang diperiksa baik
ROS produksi atau ekspresi gen selama luka non iskemik dan / atau iskemik
penyembuhan penelitian kami menunjukkan beberapa kekurangan utama
dalam antioksidan
745
sistem respon karena usia saja. Pertama dan terpenting adalah
kekurangan SOD2. enzim antioksidan mitokondria ini telah terbukti
menjadi penting untuk kelangsungan hidup sel dan mengatur
pertumbuhan sel. Meskipun SOD2 bertindak baik sebagai antioksidan
(pengangkatan O 2 · -) dan pro-oksidan (penciptaan hidrogen
peroksida), enzim ini mengatur negara redoks mitokondria.
Perubahan ROS dihasilkan dari SOD2 telah terbukti untuk
memperoleh respon seluler adaptif dari kompartemen selular lainnya,
termasuk regulasi siklus sel dan regulasi transkripsi gen nuklir
pengkodean protein mitokondria (Kim et al. 2005 ). Kami
menunjukkan bahwa transkripsi gen SOD2 berkurang pada luka non-
iskemik dari umur dibandingkan dengan tikus muda, menunjukkan
defisit basal di negara stres rendah. Di bawah tekanan iskemik,
ekspresi protein SOD2 diinduksi dalam muda tapi tidak dalam luka
tikus tua. Kurangnya induksi terbesar awal, ketika kontrol dari respon
inflamasi akan sangat penting. Kami percaya bahwa kurangnya respon
menetapkan sebuah siklus peningkatan neutrofil generasi
infiltrationwith tambahan ROS, mengakibatkan kematian sel sehingga
menarik lebih neutrofil. Akhirnya, data kami menunjukkan bahwa
aktivitas SOD2 diinduksi awal luka tikus muda, tetapi tidak meningkat
secara substansial dalam luka iskemik berusia sampai hari 21. Kami
percaya bahwa temuan ini, meskipun merugikan bagi penyembuhan
luka, 2004 ). Secara khusus, seperti yang dibahas kemudian, luka
iskemik berusia berada parah kekurangan GSH sampai hari 14. Setelah
hidrogen ini peroxideremoving kapasitas dikembalikan aktivitas SOD2
meningkat.
Meskipun isoenzim SOD semua mengkatalisis reaksi yang sama,
lokasi subselular mereka adalah penting untuk fungsi fisiologis.
Misalnya, overekspresi SOD1 tidak menyelamatkan fenotipe
mematikan tikus SOD2 knockout (Copin et al. 2000 ). Dalam studi ini
kami menunjukkan bahwa ekspresi protein SOD1 diinduksi oleh
iskemia pada tikus muda dan tua, tapi jauh lebih besar dalam luka
iskemik berusia sepanjang perjalanan waktu. Namun, karena terletak di
sitosol, SOD1 bisa tidak membuat untuk defisit SOD2. Kami
menemukan itu membingungkan bahwa ekspresi gen SOD1 tidak
sejajar induksi dalam ekspresi protein berikut iskemia pada kedua
kelompok usia hewan dibandingkan dengan kelompok usia yang sama
tanpa cedera iskemik. Namun, hal ini tidak terpikirkan bahwa berbagai
sitokin inflamasi dan / atau mekanisme umpan balik lainnya di iskemik
yang
746
tidur luka dapat mengaktifkan mesin SOD translasi tanpa perubahan
nyata dalam tingkat SOD mRNA. Stabilitas mRNA, meskipun tidak diuji
dalam penelitian ini, juga bisa memberikan penjelasan dan
menganalisis aspek ini selama jangka waktu 5 - 10 hari dapat memberi
kita wawasan yang lebih. Selain itu, kami menunjukkan kejanggalan
antara aktivitas SOD1 dan tingkat protein, yang menunjukkan bahwa
baru diterjemahkan protein SOD1 mungkin telah menjadi
disfungsional, mungkin karena nitrasi. Meskipun ni t dinilai protein
yang biasa ly ditargetkan untuk ubiquitination dengan degradasi
berikutnya, protein dengan modifikasi ganda, yaitu, nitrasi dan metilasi
lisin dapat menjadi tidak dapat diakses untuk bentuk lain dari
modifikasi pasca-translasi seperti ubiquitination (Krueger dan
Srivastava
2006 ), Sehingga menunda atau mencegah degradasi mereka.
Pengukuran ini berada di luar ruang lingkup penelitian ini tetapi dapat
menjelaskan kejanggalan antara tingkat protein dan aktivitas.
Kedua SOD1 dan SOD2 rentan terhadap inaktivasi oleh nitrasi ketika
ada kenaikan simultan di O 2 · - dan NO mengakibatkan pembentukan
peroxynitrite (ONOO -) ( Demicheli et al. 2007 ). Indikasi pembentukan
peroxynitrite, kami telah mendeteksi tingkat maksimal
3-nitrotirosin pada luka iskemik tidur antara hari 7 dan 10 (data tidak
ditunjukkan), ketika kejanggalan antara aktivitas enzim dan kadar
protein adalah yang terbesar. Tanpa aktivitas SOD cukup untuk
menetralisir O 2 · -, peroxynitrite, pendek hidup, tapi sangat spesies
reaktif akan memulai peroksidasi lipid (Radi et al. 1991 ), Istirahat untai
DNA (Salgo et al. 1995a . b ) Dan modifikasi protein (s) termasuk
oksidasi dan nitrasi (Beckman dan Koppenol 1996 ). Selain isozim SOD,
protein nitrasi telah dibuktikan dalam peradangan kulit (Greenacre et
al.
2002 ) Dan terlibat dalam regulasi matriks metaloproteinase (MMP)
selama penyembuhan luka (Lizarbe et al. 2008 ).
Sebagaimana dibahas di atas, SOD tidak dapat berfungsi secara
independen. Tingkat yang sesuai hidrogen peroksida diperlukan untuk
mempertahankan intraseluler redoks homeostasis dan
mempromosikan pertumbuhan sel. Bila terkena kelebihan hidrogen
peroksida fibroblast dermal manusia (HDFS) diisolasi dari usia pasien
menunjukkan penurunan kelangsungan hidup, penurunan fosforilasi
kinase pro-kelangsungan hidup dan peningkatan masuk ke penuaan
dibandingkan dengan HDFS muda (Gurjala et al. 2005 ). Glutathione
homeostasis,
AGE (2014) 36: 733 - 748
mekanisme utama untuk pengurangan hidrogen peroksida,
dipertahankan melalui kombinasi de novo GSH sintesis, GSH oksidasi
(dan autooxidation) dan daur ulang redoks. Dalam studi ini, kami
menunjukkan bahwa luka non iskemik berusia kurang jumlah
glutathione (GSH + GS-SG) dari luka muda non iskemik, menunjukkan
lebih sedikit setara mengurangi di negara stres rendah. Perbedaan
basal ini diperbesar dalam luka iskemik berusia, mungkin karena
konsumsi GSH, tapi “ menangkap ” hari 14 sebagai de novo sintesis
diinduksi. Kami juga menunjukkan nyata mengurangi GPx1 transkripsi
karena usia saja yang menjadi diperbesar di bawah stres iskemik (Tabel
1 ). Meskipun protein GPx1 diekspresikan pada tingkat signifikan lebih
tinggi pada usia iskemik dibandingkan dengan luka muda iskemik,
enzim tidak dapat berfungsi tanpa adanya GSH. Secara bersama-sama,
data kami menunjukkan bahwa penyembuhan luka iskemik pada tikus
berusia tergantung pada induksi de novo GSH sintesis. Unik untuk
hewan tua, induksi GCLM mulai hari 7 pasca-melukai mengembalikan
jalur GSH ' s hidrogen peroksida-mengurangi kapasitas, dengan
peningkatan berikutnya dalam SOD2 dan aktivitas daur ulang GSH.
Singkatnya, kami telah menunjukkan kekurangan dikombinasikan
dalam pertahanan antioksidan karena penuaan yang diperbesar ketika
mengalami stres iskemik. hasil eksperimen kami menunjukkan
penundaan ditandai penyembuhan luka iskemik pada tikus berusia
dengan respon inflamasi yang berkepanjangan dan disregulasi SOD
dan antioksidan GSH pertahanan tidak diidentifikasi sebelumnya
menggunakan model luka iskemik lainnya. Penelitian ini menjelaskan
mengapa satu terapi antioksidan gagal dan meletakkan dasar untuk
studi intervensi yang secara bersamaan menangani gabungan
mitokondria defisit enzim antioksidan, semakin kita lebih dekat dengan
tujuan kami untuk terapi molekul yang sangat bertarget yang akan
membaik penyembuhan luka pada populasi lanjut usia berkembang
pesat.
Ucapan Terima Kasih Karya ini didukung oleh Veteran ' Urusan Merit Award (BX09-002)
ke L. Gould. Para penulis ingin mengucapkan terima kasih Fasilitas University of South
Florida Patologi Inti untuk persiapan spesimen histologi. Para penulis menyatakan tidak
ada konflik kepentingan untuk pekerjaan ini.
Penolakan Isi naskah ini tidak mewakili pandangan dari Departemen Urusan
Veteran atau Pemerintah AS.
AGE (2014) 36: 733 - 748
Referensi
Ashcroft GS, Horan MA, Ferguson MW (1997a) Aging adalah associ-
ated dengan deposisi berkurang dari komponen matriks tertentu ekstraseluler,
sebuah peningkatan regulasi angiogenesis, dan respon inflamasi yang berubah
dalam murine luka insisi penyembuhan Model. J Invest Dermatol 108 (4): 430 - 437
Ashcroft GS, Horan MA, Herrick SE, Tarnuzzer RW, Schultz GS,
Ferguson MW (1997b) yang berhubungan dengan perbedaan usia dalam
regulasi temporal dan spasial matriks metaloproteinase (MMP) pada kulit
normal dan luka kulit akut manusia yang sehat. Sel Tissue Res 290 (3): 581 - 591
Ashcroft GS, Horan MA, Ferguson MW (1998) Aging alter yang
profil molekul adhesi sel inflamasi dan endotel selama
penyembuhan luka kulit manusia. Lab Invest 78 (1): 47 - 58
Beckman JS, Koppenol WH (1996) nitrat oksida, superoksida, dan
peroxynitrite: baik, yang buruk, dan jelek. Am J Physiol 271 (5 Pt 1):
C1424 - C1437
Bonomo SR, Davidson JD, Tyrone JW, Lin X, Mustoe TA (2000)
Peningkatan penyembuhan luka dengan oksigen hiperbarik dan
mengubah faktor pertumbuhan Beta3 dalam model luka kronis baru pada
kelinci berusia. Arch Surg 135 (10): 1148 - 1153 Chen CN, Brown-Borg HM,
Rakoczy SG, Ferrington DA,
Thompson LV (2010) Aging merusak ekspresi dari subunit katalitik
glutamat sistein ligase pada otot soleus di bawah tekanan. J
Gerontol Sebuah Biol Sci Med Sci 65 (2): 129 - 137 Choksi KB,
Boylston WH, Rabek JP, Widger WR,
Papaconstantinou J (2004) oksidatif rusak protein hati mitokondria
kompleks transpor elektron. Biochim Biophys Acta 1688 (2): 95 - 101
Copin JC, Leila Belle Y, Chan PH (2000) Ekspresi dari tembaga /
seng superoxide dismutase tidak mencegah mematikan neonatal pada tikus
mutan yang kekurangan mangan superoksida dismutase. Gratis Radic Biol Med 28
(10): 1571 - 1576
Davis CA, Hearn AS, Fletcher B, Bickford J, Garcia JE, Leveque
V, Melendez JA, Silverman DN, Zucali J, Agarwal A, Nick HS (2004)
efek anti-tumor ampuh dari situs mutan aktif superoksida mangan-
superoksida manusia. konservasi evolusi inhibisi produk. J Biol
Chem 279 (13): 12.769 - 12.776
Demicheli V, Quijano C, Alvarez B, Radi R (2007) Inaktivasi
dan nitrasi superoksida dismutase manusia (SOD) oleh fluks oksida
nitrat dan superoksida. Gratis Radic Biol Med 42 (9): 1359 - 1368
Franklin CC, Backos DS, Mohar saya, White CC, Forman HJ,
Kavanagh TJ (2009) Struktur, fungsi, dan regulasi posttranslational dari
subunit katalitik dan modifikator glutamat sistein ligase. Aspek Mol
Med 30 (1 - 2): 86 - 98
Gould LJ, LeongM, Sonstein J, Wilson S (2005) Optimasi dan
validasi model luka iskemik. Luka Perbaikan Regen 13 (6): 576 - 582
Greenacre SA, Rocha FA, Rawlingson A, Meinerikandathevan S,
Poston RN, Ruiz E, Halliwell B, Brain SD (2002) Protein nitrasi peradangan kulit
pada tikus: peran penting diinduksi nitrat oksida sintase dan polimorfonuklear
leukosit. Br J Pharmacol 136 (7): 985 - 994
Gurjala AN, Liu WR, Mogford JE, Procaccini PS, Mustoe TA
(2005) Umur tergantung respon dari kulit manusia utama
747
fibroblas stres oksidatif: kelangsungan hidup sel, kinase pro-hidup, dan
masuk ke penuaan selular. Luka Perbaikan Regen 13 (6): 565 - 575
Kim A, Murphy MP, Oberley TD (2005) redoks mitokondria
negara mengatur transkripsi protein mangan mitokondria superoksida
dismutase nuklir dikodekan: respon adaptif yang diusulkan untuk
ketidakseimbangan redoks mitokondria. Gratis Radic Biol Med 38 (5): 644 - 654
Krueger KE, Srivastava S (2006) fi kasi protein pascatranslasi
kation: implikasi saat ini untuk deteksi kanker, pencegahan, dan terapi.
Mol Sel Proteomika 5 (10): 1799 - 1810 Liu R, Choi J (2000) penurunan
Umur-terkait di gamma-
ekspresi gen sintetase glutamylcysteine pada tikus. Gratis Radic Biol Med
28 (4): 566 - 574 Liu H, Wang H, Shenvi S, Hagen TM, Liu RM (2004)
Glutathione
metabolisme selama proses penuaan dan penyakit Alzheimer. Ann NY Acad
Sci 1019: 346 - 349
Lizarbe TR, Garcia-Rama C, Tarin C, Saura M, Calvo E, Lopez
JA, Lopez-Otin C, Folgueras AR, Lamas S, Zaragoza C (2008) Nitrat oksida
memunculkan fungsional MMP-13 proteintyrosine nitrasi selama
perbaikan luka. FASEB J 22 (9): 3207 - 3215
MacMillan-Gagak LA, Gagak JP, Thompson JA (1998)
inaktivasi Peroxynitrite-dimediasi superoksida dismutase mangan
melibatkan nitrasi dan oksidasi residu tirosin kritis. Biokimia 37 (6): 1613 -
1622 Mogford JE, Sisco M, Bonomo SR, Robinson AM, Mustoe TA
(2004) Dampak penuaan pada ekspresi gen pada tikus percobaan dari iskemik
penyembuhan luka kulit. J Surg Res 118 (2): 190 -
196
Morrison JP, Coleman MC, Aunan ES, Walsh SA, Spitz DR,
Kregel KC (2005) Aging mengurangi tanggap terhadap BSOand panas
gangguan stress dari glutathione dan enzim antioksidan. Am J Physiol
regul integr Comp Physiol 289 (4): R1035 - R1041 Mustoe TA, O ' Shaughnessy
K, Kloeters O (2006) luka kronis
patogenesis dan pengobatan saat ini strategi: hipotesis pemersatu.
Plast Reconstr Surg 117 (7 Suppl): 35S - 41S Paglia DE, Valentine WN
(1967) Studi pada kuantitatif dan
karakterisasi kualitatif eritrosit glutathione peroxidase. J Lab Clin Med 70
(1): 158 - 169 Radi R, Beckman JS, Bush KM, Freeman BA (1991)
Peroxynitrite-diinduksi peroksidasi lipid membran: potensi sitotoksik
superoksida dan oksida nitrat. Arch Biochem Biophys 288 (2): 481 - 487
Salgo MG, Bermudez E, Squadrito GL, Pryor WA (1995a)
Peroxynitrite menyebabkan kerusakan DNA dan oksidasi tiol di
thymocytes tikus [dikoreksi]. Arch Biochem Biophys 322 (2): 500 - 505
Salgo MG, Squadrito GL, Pryor WA (1995b) penyebab Peroxynitrite
apoptosis pada thymocytes tikus. BiochemBiophys Res Commun 215 (3): 1111 - 1118
Seelig GF, Simondsen RP, Meister A (1984) dissocia- Reversible
tion gamma-glutamylcysteine sintetase menjadi dua subunit. J Biol Chem 259
(15): 9345 - 9347 Sen CK (2003) Kasus umum untuk kontrol redoks perbaikan
luka.
Luka Perbaikan Regen 11 (6): 431 - 438 Sohal RS, Ku HH, Agarwal S,
Forster MJ, Lal H (1994) oksidatif
kerusakan, generasi oksidan mitokondria dan pertahanan antioksidan selama
penuaan dan dalam menanggapi pembatasan makanan di mouse. Mech Aging
Dev 74 (1 - 2): 121 - 133
748
Soybir OC, Gurdal SO, Oran ES, Tulubas F, Yuksel M, Akyildiz
AI, Bilir A, Soybir GR (2012) Tertunda penyembuhan luka kulit pada tikus berusia
dibandingkan dengan yang lebih muda. Int Luka J 9 (5): 478 - 487
Swift ME, Luka bakar AL, Gray KL, DiPietro LA (2001) Umur-terkait
perubahan dalam respon inflamasi ke dermal cedera. J Invest Dermatol
117 (5): 1027 - 1035
Szczesny B, Bhakat KK, Mitra S, Boldogh I (2004) Umur-
modulasi tergantung dari enzim perbaikan DNA oleh kovalen modifikasi
dan distribusi subselular. Mech Aging Dev 125 (10 - 11): 755 - 765
Tu Z, Anders MW (1998) Ekspresi dan karakterisasi
manusia glutamat-sistein ligase. Arch Biochem Biophys 354 (2): 247 - 254
AGE (2014) 36: 733 - 748
Wu L, Brucker M, Gruskin E, Roth SI, Mustoe TA (1997)
efek diferensial platelet-derived growth factor BB dalam mempercepat
penyembuhan luka di usia dibandingkan hewan muda: dampak
hipoksia jaringan. Plast Reconstr Surg 99 (3): 815 -
822, diskusi 823 - 814
Wu L, Xia YP, Roth SI, Gruskin E, Mustoe TA (1999)
Mengubah faktor pertumbuhan-beta1 gagal untuk merangsang penyembuhan
luka dan merusak transduksi sinyal dalam model ulkus iskemik berusia:
pentingnya oksigen dan usia. Am J Pathol 154 (1): 301 - 309
Zelko IN, Mariani TJ, Folz RJ (2002) dismutase superoksida
keluarga multigene: perbandingan CuZn-SOD (SOD1), Mn-SOD
(SOD2), dan EC-SOD (SOD3) struktur gen, evolusi, dan ekspresi.
Gratis Radic Biol Med 33 (3): 337 - 349