Uji toksisitas sel mamalia

Sel Vero diperoleh dan dibudidayakan Shanghai, China ditambah dengan 10% serum bovine
janin, 100 U / mL penisilin dan 100 U / mL streptomisin di 37 oC di bawah 5% CO2. Sel
dipanen oleh 0,05% trypsin untuk menyiapkan sel tunggal suspensi dan dikultur selama 24
jam sebelum perawatan CLP-19. Peningkatan jumlah CLP-19 ditambahkan dan sel-sel
diinkubasi untuk yang lain 48 jam. Setelah dicuci, sel-sel dibudidayakan lebih segar media
yang mengandung 100 mg / L merah netral selama 90 menit sebelumnya ke cuci PBS.
Kemudian sel diobati dengan 200 μL diasamkan isopropanol (0,33% HCl), dan viabilitasnya
adalah dinilai dengan A 540. Penurunan A 540 nilai menunjukkan mengurangi viabilitas sel.

Uji kombinasi

Efek antibakteri keseluruhan CLP-19 pada Kombinasi dengan antibiotik konvensional itu
diselidiki dengan analisis kotak-kotak melalui pembacaan dari FICI. Kontrol pertumbuhan
sumur mengandung media dan tidak ada antibiotik. Agen dimasukkan ke dalam masing-
masing piring. Setiap tes itu dilakukan dalam rangkap tiga.

Uji kinetika antibakteri

Suspensi bakteri pada log log pertengahan yang dilapisi di piring mikrotiter 96-well dan
diobati dengan CLP-19, ceftazidime, atau diobati dengan CLP-19 dan ceftazidime. Setelah
inkubasi pada suhu 25 ° C selama 5 menit, 15 min, 30 menit, 1 jam, 3 jam, 6 jam dan 24 jam,
jumlah yang layak bakteri ditentukan dengan pengenceran serial di PBS dan plating pada
trypticase soy agar (TSA) dengan 24 jam inkubasi pada suhu 37 ° C. Batas deteksi untuk
masing-masing sumur adalah 100 CFU.

Uji difusi disk

Tindakan CLP-19 saja, ceftazidime sendiri dan perlakuan gabungan, cakram kertas steril (AA,
diameter 6 mm; diresapi dengan MICs masing-masing atau dengan PBS saja sebagai kontrol
Cakram dikeringkan selama 3 jam pada suhu 25 ° C dan ditempatkan ke permukaan piring
TSA yang telah diunggulkan 100 μL suspensi E. coli menyebar untuk mencapainya halaman
pertumbuhan semi-konfluen) dan dibiarkan mengering 3 jam pada suhu 37 ° C. Pelat
kemudian diinkubasi selama 5 hari pada suhu 37 ° C dan diperiksa setiap 24 jam untuk
penampilan zona yang jelas di sekitar masing-masing cakram.

Uji pembentukan radikal hidroksil

Bakteri diobati dengan MICs dari CLP-19, ampisilin, ceftazidime, eritromisin, levofloxacin
atau CLP-19 dalam kombinasi dengan masing-masing antibiotik konvensional, dan PBS
berfungsi sebagai kontrol. Semua kelompok percobaan diinkubasi pada suhu 37oC selama 2
jam. 5 mM pewaris fluorescent dye30- (p-hydroxyphenyl) fluorescein (HPF) (Invitrogen)
kemudian ditambahkan. Intensitas fluoresensi HPF diukur dengan sebuah
spektrofluorofotometer pada eksitasi 490 nm dan 515 nm panjang gelombang emisi.
NAD, ekstraksi NADH

Bakteri di fase pertengahan log disentrifugasi pada 13000 rpm selama 5 menit dan
resuspended dalam 1 mL LB. Untuk NAD dan ekstraksi NADH, sampel bakteri dikumpulkan
dengan sentrifugasi (13000 rpm selama 1 menit) di setiap setengahnya jam antara 0 dan 2
jam setelah penambahan MICs CLP-19, ceftazidime, atau kombinasi. Supernatan itu dihapus
dan pelet dibekukan segera di es kering-etanol mandi dan disimpan pada -80 ° C sampai
semua sampel telah dikumpulka. Analisis pelet es dingin itu dimulai dengan menambahkan
75 μL NaOH 0,2 M (untuk NADH ekstraksi) atau 75 μL HCl 0,2 M (untuk ekstraksi NAD),
setelah itu sampel dipanaskan selama 10 menit pada suhu 100 ° C dan kemudian
disentrifugasi pada 10.000 rpm selama 5 menit. Supernatan yang mengandung NAD/NADH
dipindahkan ke segar tabung dan disimpan dalam gelap di atas es sampai digunakan dalam
bersepeda pengujian kadar logam.

Studi pelepasan endotoksin

Bakteri pada fase pertengahan log itu diobati dengan 2 × MICs CLP-19, ceftazidime, atau in
kombinasi selama 6 jam pada suhu 37 ° C. Bakteri diobati dengan PBS berfungsi sebagai
kontrol Sampel disaring melalui sebuah filter bebas pirogen 0.2-pm pori polysulphone dan
filtratnya segera disimpan pada suhu -70 ° C sampai digunakan. Untuk analisis, filtrat
dicairkan pada suhu kamar, secara serial diencerkan dengan air bebas pirogen (kisaran: 102
- sampai 104 kali lipat) dan bereaksi dengan reagen Limulus amebocytelysate (LAL).

Analisis statistik

Data dinyatakan sebagai rata-rata paling sedikit tiga eksperimen independen ± standar
deviasi. Statistik signifikansi ditentukan oleh paired Student t test jika dibandingkan hanya
dua kelompok atau satu arah ANOVA diikuti dengan uji apakah menganalisa lebih dari dua
kelompok. Perbedaan dianggap signifikan secara statistik di P <0,05