PROTOKOL PCR DAN ELEKTROFORESIS DNA

A. ALAT DAN BAHAN

1. Alat
No Alat Jumlah
1 PCR 1 unit
2 Tube PCR 8 buah
3 Tips Kuning 1 box
4 Tips Putih 1 box
5 Mikropipet 20-200µL 1 box
6 Mikropipet 2-20µL 1 buah
7 Glove 1 pasang
8 UV Transiluminator 1 buah
9 Cetakan Gel 1 buah
10 Microwave 1 buah
11 Tabung Durham 1 buah
12 Elektroforesis 1 buah

2. Bahan
a. Bahan PCR
No Bahan Jumlah
1 Primer forward ITS1 1 µL
2 Primer reverse ITS4 1 µL
3 10x Buffer PCR 2 µL
4 dNTPs 2 µL
5 DNA template 2 µL
6 Taq polymerase 1 µL
7 Nuclease Free Water 11 µL

9 Agarosa 1% 30 ml
10. EtBr (Ethidium Bromide) 1µL/100mL 100 ml
11. TAE 1x 100 ml
12. Nuclese Free Water 100 µL
13. Loading Dye 2 µL
14. 1 Kb DNA Ledder 2 µL

B. CARA KERJA
1. PCR
a. Semua alat dan bahan disiapkan.
b. Setelah siap, 10xPCR buffer, primer ITS1 dan ITS4, dNTPs, DNA template dan Taq
Polymerase di masukkan ke dalam tube PCR dengan menggunakan mikropipet dan tips
(sebaiknya pipetkan ke tengah tube PCR bukan di dindingnya), tambahkan Nuclease Free
Water hingga total reaksi 40 µL.
c. Homogenkan dengan menggunakan mikropipet.
d. Siapkan PCR, masukkan tube PCR yang sudah diisi mix reaction dan atur suhunya seperti
dibawah ini :

e. Running PCR

2. Elektoforesis
a. Buatlah agarosa 1% dengan cara melarutkan 0,3 gram agarosa hingga 30 mL dalam TAE
buffer 1x. Panaskan hingga homogen dalam Microwave.
b. Cetak agarosa 1% dalam cetakan gel.
c. Gel agarosa yang sudah padat di masukan kedalam alat elektoforesis dan ditambahkan
TAE buffer 1x.
d. Mix 5 µL hasil PCR dengan 1 µL Loading Dye 6x di kertas parafilm.
e. Masukan 1Kb DNA Ladder dan Mix hasil PCR dengan 1 µL Loading Dye 6x ke dalam
sumur.
f. Running alat elektroforesis dalam waktu 40 menit, dengan voltase 75 V dan kuat arus 400
mA.
g.Setelah selesai, staining gel agarosa dalam EtBr selama 5 menit, kemudian bilas dengan
aquades selama 5 menit untuk menghilangkan sisa EtBr.
h. Gel hasil staining dilihat dalam UV Transiluminator.